漿液性卵巢癌中GPSM2的表達與化療耐藥及預后的相關性

張繼方，呂慶杰

卵巢癌是惡性程度和病死率較高的婦科腫瘤，其中漿液性卵巢癌(serous ovarian cancer, SOC)是最常見的卵巢上皮性惡性腫瘤[1]。多數患者在疾病進展期時被發(fā)現，卵巢癌晚期患者的主要治療方法為腫瘤細胞減滅術并輔以鉑類和紫杉醇聯(lián)合化療[2]。在臨床治療中化療耐藥頻繁發(fā)生。因此，尋找預測耐藥的生物學標志物，對延長患者生存期具有重要價值。G蛋白信號調節(jié)蛋白2(G-protein signaling modulator 2, GPSM2)屬于調節(jié)G蛋白激活的蛋白家族，通過調節(jié)紡錘體的定向運動維持細胞的對稱性分裂。研究發(fā)現，GPSM2與惡性腫瘤關系密切，然而GPSM2在卵巢癌中的作用尚未有文獻報道。本實驗重點探討GPSM2在SOC中的表達，并進一步分析GPSM2與化療耐藥及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 材料選取2012年1月～2014年12月中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院病理科存檔的SOC石蠟標本131例以及同期漿液性囊腺瘤、交界性漿液性囊腺瘤、正常卵巢及輸卵管石蠟標本各15例，該分組標準參考文獻[3]。其中SOC患者年齡25～76歲，平均51.8歲，中位年齡51歲。按FIGO(2016)標準進行臨床病理分期：Ⅰ+Ⅱ期38例，Ⅲ+Ⅳ期93例；腫瘤組織學分級：G1+G2級59例，G3級72例。另收集中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院行手術切除的新鮮SOC、正常卵巢、輸卵管組織各10例。納入標準：(1)均為原發(fā)性SOC患者；(2)均實施腫瘤細胞減滅術；(3)術前未接受放、化療；(4)術后化療方案為紫杉醇聯(lián)合鉑類治療。根據NCCN指南化療敏感組為首次采用鉑類與紫杉醇聯(lián)合為主的化療方案后臨床上獲得緩解，完成化療周期，停藥6個月以內無復發(fā)；化療耐藥組為首次采用鉑類與紫杉醇聯(lián)合為主的化療方案后臨床上獲得緩解，完成化療周期，在化療過程中或停藥6個月以內復發(fā)。臨床上卵巢癌復發(fā)的主要依據：血清CA125水平進行性升高，伴發(fā)胸腹水，影像學檢查證實有復發(fā)病灶，原因不明確的腸梗阻。所納入的SOC患者合計131例，在化療結束后以電話、門診或電子病歷等方式進行追蹤，其中死亡73例，失訪13例，隨訪率為90.1%。隨訪時間6～60個月，中位隨訪時間為46個月。疾病無進展生存期(progression-free survival, PFS)是從化療開始到疾病復發(fā)或死亡時間，總生存期(overall survival, OS)是從手術后第一天至死亡時間。本組中位PFS和中位OS分別為20個月和51個月。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 采用免疫組化SP法染色，切片厚約4 μm，二甲苯脫臘，梯度乙醇(100%、95%、75%)水化?？乖迯? min(pH 6.0檸檬酸鹽修復液)，滴加內源性過氧化物酶阻斷劑封閉，室溫孵育10 min，滴加一抗(工作濃度為1 ∶200)，4 ℃過夜。次日，滴加二抗，室溫孵育20 min，各步驟之間用PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min。DAB顯色2 min，沖洗，蘇木精復染2 min，中性樹膠封固。以PBS替代一抗作為陰性對照。GPSM2兔抗人多克隆抗體購自Proteintech公司，通用型試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.2.2RT-PCR 利用Trizol試劑盒提取總RNA，分光光度計測量RNA的濃度和純度。應用Prime Script RT reagent Kit反轉錄試劑盒(Takara公司，大連)將總RNA反轉錄為cDNA，以cDNA為模板對引物序列進行PCR擴增。GPSM2上游引物序列：5′-GACAAGGTGGGAGAAGCAAGAGC-3′、下游引物序列：5′-GGGGACCAGGGCAACCAAAAC-3′，GAPDH為內參照。PCR反應條件：95 ℃ 30 s，預變性；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，合計45個循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min。表達水平根據2-ΔΔCt法進行分析。

1.3 結果判讀GPSM2表達主要定位于細胞膜和(或)細胞質。按陽性細胞著色強度評分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。按陽性細胞占腫瘤細胞百分比評分：陽性細胞數<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。兩項評分結果相乘為最終評分：0～2分為陰性(-)，3～4分為弱陽性(+)，5～8分為中度陽性()，9～12分為強陽性()。通過繪制ROC曲線，進而確定Cut off值為9。本實驗將評分≥9分為高表達，<9分為低表達。本實驗經兩位經驗豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲法閱片控制誤差率。

2 結果

2.1 SOC中GPSM2的表達GPSM2主要表達于細胞膜和(或)細胞質，在卵巢良性腫瘤、交界性卵巢腫瘤、正常卵巢及輸卵管組織中主要呈低表達或無表達，131例SOC中111例陽性，陽性率為84.7%(圖1、2)。SOC組與其他三組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001，表1)。

圖1 A.正常卵巢中GPSM2的表達，SP法；B.正常輸卵管中GPSM2的表達，SP法；C.卵巢良性腫瘤中GPSM2的表達，SP法；D.交界性卵巢腫瘤中GPSM2的表達，SP法 圖2 A.SOC中GPSM2呈陰性，SP法；B.SOC中GPSM2呈弱陽性，SP法；C.SOC中GPSM2呈中度陽性，SP法；D.SOC中GPSM2呈強陽性，SP法

表1 卵巢、輸卵管、卵巢良性腫瘤、交界性卵巢腫瘤、SOC中GPSM2的表達

2.2 SOC中GPSM2 mRNA的表達本組檢測10例正常輸卵管、10例正常卵巢和10例SOC新鮮標本的GPSM2 mRNA表達量，結果顯示：GPSM2 mRNA在SOC中的表達量(1.75±0.15)高于卵巢(1.1 ± 0.16)和輸卵管(1±0.13)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖3)；卵巢和輸卵管的GPSM2 mRNA表達量差異無顯著性(P>0.05)。

圖3 GPSM2 mRNA在正常輸卵管、正常卵巢、SOC中的相對表達量

2.3 化療耐藥組與化療敏感組中GPSM2蛋白表達差異131例SOC標本按NCCN指南對化療耐藥的分類標準進行分類，其中41例為化療耐藥組，90例為化療敏感組。本組對免疫組化染色結果進行評分，化療耐藥組高表達率為58.5%，化療敏感組高表達率為35.6%。由于兩組評分結果不滿足正態(tài)分布，通過兩獨立樣本非參數檢驗Mann-WhitneyU檢驗進行比較，結果表明化療耐藥組GPSM2蛋白的表達水平高于化療敏感組(P=0.032，表2，圖4)。

圖4 GPSM2在化療耐藥組和化療敏感組中的免疫組化評分

表2 化療耐藥組與化療敏感組GPSM2的免疫組化評分比較

2.4 SOC中GPSM2表達與臨床病理特征的關系本組結果顯示，SOC中Ⅲ+Ⅳ期組GPSM2的高表達率為48.4%，顯著高于Ⅰ+Ⅱ期的28.9%(P=0.028)。化療耐藥組GPSM2的高表達率為58.5%，明顯高于化療敏感組的35.6%(P=0.014)，GPSM2表達與患者年齡、病理分級、有無淋巴結轉移、腹水量、CA125表達水平、殘余病灶、腫瘤大小無相關性(表3)。

表3 SOC中GPSM2表達與臨床病理特征的相關性

2.5 GPSM2表達與SOC患者預后的關系使用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗分析GPSM2與PFS和OS的相關性。GPSM2高表達組患者的1、3、5年的累積生存率分別為76%、44%、22%，GPSM2低表達組患者的1、3、5年的累積生存率分別為90%、68%、52%。本組結果顯示：GPSM2表達水平與SOC患者的OS(P<0.001)和PFS(P=0.018)均顯著相關，GPSM2蛋白高表達提示SOC患者預后較差(圖5)。

圖5 GPSM2的表達水平與SOC預后的相關性：A.PFS分析；B.OS分析

2.6 SOC患者預后的獨立危險因素本組各因素與PFS的單因素分析中，GPSM2表達水平、淋巴結轉移、殘余病灶、腹水量、FIGO分期、CA125水平與PFS顯著相關，由于FIGO分期已經包括腹水、淋巴結轉移，剩余因素納入Cox多因素分析，結果顯示GPSM2(HR：1.481，95%CI：1.008～2.177，P=0.046)與FIGO分期(HR：3.277，95%CI：1.914～5.609，P<0.001)為預測PFS的獨立危險因素(表4)。

表4 各變量與PFS的Cox單因素和多因素分析

本組各因素與OS的單因素分析中，GPSM2表達、年齡、淋巴結轉移、殘余病灶、腹水量、FIGO分期、CA125水平與OS顯著相關，由于FIGO分期包括腹水、淋巴結轉移，剩余因素納入Cox多因素分析，結果顯示GPSM2(HR：1.877，95%CI：1.165～3.023，P=0.01)與FIGO分期(HR：3.346，95%CI：1.613～6.942，P<0.001)是評估SOC患者OS的獨立危險因素(表5)。

表5 各變量與OS的Cox單因素和多因素分析

3 討論

女性卵巢癌的惡性程度較高，5年生存率約為40%，造成卵巢癌預后差的關鍵因素是化療耐藥[4-5]。因此，尋找預測化療耐藥的腫瘤標志物對延長卵巢癌患者的生存期有積極的意義。

GPSM2屬于G蛋白偶聯(lián)受體的內源性調節(jié)因子，調控有絲分裂過程中紡錘體的正確定位[6]，維持對稱性分裂，在G2/M期發(fā)揮重要作用[7-8]。GPSM2也受多種調節(jié)因子的調控，并通過與不同因子的相互作用，共同影響紡錘體的定位[9]。

本實驗從mRNA和蛋白水平分別檢測GPSM2的表達，結果顯示其在SOC中高表達。該實驗結果與GPSM2在肝癌、乳腺癌和胰腺癌組織中的高表達一致[10-15]，提示GPSM2與癌癥的發(fā)生緊密相關。

卵巢癌臨床治療的一線化療方案為鉑類與紫杉醇聯(lián)合化療，紫杉醇是一類抗微管藥物，使細胞分裂

在G2/M期停滯[16-17]，研究證實阻滯于G2/M期的細胞有明顯的凋亡傾向[18]，近年GPSM2與腫瘤的文獻報道較多，乳腺癌相關文獻表明[10-11]GPSM2在G2/M期表達上調，且GPSM2高表達與紫杉醇化療敏感性顯著相關。敲除GPSM2，紫杉醇誘導G2期阻滯減少，紫杉醇可能通過抑制GTP活性使誘導周期停滯的能力下降，從而導致患者產生耐藥性。以上表明，G2期停滯和微管調節(jié)可能是GPSM2的潛在機制。

乳腺和卵巢同屬雌孕激素依賴性器官，可能具有同源性。本實驗分析GPSM2在SOC化療耐藥的關系，發(fā)現耐藥組GPSM2的表達水平高于敏感組，提示GPSM2高表達可能會減弱SOC患者對化療藥物的敏感性，但GPSM2在乳腺癌和卵巢癌中對化療藥物產生不同的效應，也許是由于器官的異質性導致GPSM2在不同腫瘤中的差異表現，也許是由于未考慮到鉑類耐藥。

此外，生存分析發(fā)現GPSM2高表達與SOC患者較差的OS和PFS顯著相關。多因素生存分析發(fā)現，GPSM2、FIGO分期可以作為預測OS和PFS的獨立危險因素，與高臨床分期、化療耐藥的SOC患者往往有更差的預后相符。另外，在胰腺癌[12-13]和肝癌[14]中，上調GPSM2的表達能增加細胞的遷移和侵襲能力，提示GPSM2高表達可能會促進腫瘤的侵襲轉移，對患者預后不佳。

綜上所述，GPSM2與SOC發(fā)生、發(fā)展密切相關，GPSM2可能是評估化療療效和預后的重要指標。由于本實驗對GPSM2與化療藥物的潛在機制了解不足，可能限制了對兩者內在聯(lián)系的深入探討，尚待更多的實驗進一步分析。