HSF1通過調(diào)節(jié)ATF6-XBP1通路影響肝臟AA淀粉樣變性

王琨璐，付志豪，王宇彬，劉元昊，高澤晗，冷建寧，尚 晶，錢金澤，劉 巍

淀粉樣變性是由多種原因引起的淀粉樣蛋白錯(cuò)誤的折疊聚集，進(jìn)而形成不溶性纖維沉積于各組織和重要臟器之間，造成其功能損傷或衰竭的一組慢性臨床綜合征，其中包括朊病毒病(prion disease, PD)、Ⅱ型糖尿病、阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease, AD)等[1]。AA淀粉樣變性是最常見的系統(tǒng)性淀粉樣變性之一，由血清淀粉樣蛋白A沉積于肝臟等重要臟器引起，臨床上常繼發(fā)于慢性感染或炎癥，預(yù)后較差[2]。由熱休克、氧化應(yīng)激等因素誘發(fā)的熱休克反應(yīng)(heat shock response, HSR)和由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙引起的未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)是維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)所必需的系統(tǒng)，其激活異?？赡軐?dǎo)致神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展。目前對(duì)于兩種應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)在AA淀粉樣變性中的相互作用還缺乏了解，并且相關(guān)通路在該病中的作用機(jī)制和調(diào)控途徑未見詳細(xì)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(heat shock transcription 1, HSF1)基因敲除小鼠構(gòu)建肝臟AA淀粉樣變模型，著重探討UPR通路中的2個(gè)主要因子：活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6, ATF6)和X-盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein 1, XBP1)在肝臟AA淀粉樣變中的作用機(jī)制以及HSP1對(duì)其通路的調(diào)節(jié)，以證實(shí)HSR與UPR的相互作用，有助于該病在臨床上的預(yù)防與治療策略的合理選擇。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組HSF1基因敲除型小鼠受贈(zèng)于日本山口大學(xué)醫(yī)學(xué)系研究科醫(yī)化學(xué)系中井彰教授。所用小鼠均為8周齡雄鼠，分組如下：HSF1基因敲除鼠10只，隨機(jī)分為敲除型實(shí)驗(yàn)組和敲除型空白組，每組各5只。野生型小鼠12只，隨機(jī)分為野生型實(shí)驗(yàn)組和野生型空白組，每組各6只。

1.2 模型制備依據(jù)Pras的經(jīng)驗(yàn)方法，AA淀粉樣纖維種子由AA淀粉樣變誘導(dǎo)的野生型小鼠肝臟組織中提取，各實(shí)驗(yàn)組采用尾靜脈注射AA淀粉樣纖維(1 μg/100 μL)，同時(shí)給予皮下注射1%AgNO30.5 mL的方法制備AA淀粉樣變模型，并每隔1天皮下注射1%AgNO30.5 mL持續(xù)誘導(dǎo)炎癥刺激。誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行1周后造模完成。

1.3 組織取材淀粉樣變誘導(dǎo)1周后取材，采用乙醚麻醉后處死小鼠，取小鼠肝臟置入液氮，部分置于10%中性福爾馬林與4%多聚甲醛配置成的固定液中室溫固定進(jìn)行形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)。其余部分直接冷藏于-80 ℃進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.4 形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)將10%中性福爾馬林固定后的肝臟組織包埋封蠟，待蠟塊成型后，參考李敏等[3]對(duì)肝臟組織進(jìn)行石蠟切片并保存于4 ℃。將肝臟切片進(jìn)行剛果紅染色，并在偏光鏡下觀察染色情況，確定淀粉樣沉積程度。同時(shí)對(duì)相同部位連續(xù)切片進(jìn)行免疫組化SP法染色，小鼠淀粉樣蛋白A(mouse amyloid A, mAA)抗體稀釋比例1 ∶3 000，在顯微鏡下觀察切片，特異性地判斷淀粉樣沉積情況。

1.5 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(1)肝組織GRP78、ATF6及XBP1蛋白檢測(cè)：采用SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)膜后檢測(cè)蛋白的表達(dá)，所用抗體的稀釋比例分別為GRP78(1 ∶3 000)、ATF6(1 ∶200)和XBP1(1 ∶200)。(2)肝組織中ATF6及XBP1 mRNA檢測(cè)：從肝臟組織中提取RNA并合成cDNA，使用Taq DNA Polymerase進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)時(shí)定量檢測(cè)采用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒，操作系統(tǒng)選用Mx 3005 RT-PCR SYSTEM。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用StatView software package(Abacus Concepts, Berkeley, CA, USA)完成數(shù)據(jù)分析，采用Mann-WhitneyU完成數(shù)據(jù)的組間比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HSF1敲除對(duì)肝臟AA淀粉樣變的影響將小鼠肝臟切片進(jìn)行剛果紅染色，結(jié)果顯示敲除型實(shí)驗(yàn)組淀粉樣物質(zhì)沉積顯著高于野生型實(shí)驗(yàn)組，而敲除型與野生型空白組均未見淀粉樣物質(zhì)沉積(圖1、2)；并且淀粉樣物質(zhì)沉積多侵及匯管區(qū)血管壁，肝實(shí)質(zhì)一般不受侵犯，符合AA淀粉樣變性特點(diǎn)。對(duì)相同部位連續(xù)切片進(jìn)行mAA免疫組化SP法染色，可見在綠色熒光位置出現(xiàn)等量的淀粉樣沉積，證明剛果紅染色所見淀粉樣物質(zhì)沉積即為AA淀粉樣物質(zhì)(圖3)。上述結(jié)果提示，HSF1的缺失促進(jìn)肝臟AA淀粉樣變的形成。

圖1 各組小鼠肝臟組織中淀粉樣物質(zhì)的沉積，剛果紅染色：A.野生型空白組；B.野生型實(shí)驗(yàn)組(箭頭為淀粉樣沉積物)；C.野生型實(shí)驗(yàn)組(偏正光)(箭頭為淀粉樣沉積物)；D.敲除型空白組；E.敲除型實(shí)驗(yàn)組(箭頭為淀粉樣沉積物)；F.敲除型實(shí)驗(yàn)組(偏正光)(箭頭為淀粉樣沉積物)

圖2 各組小鼠肝臟組織中淀粉樣蛋白指數(shù)的比較

圖3 各組小鼠肝臟組織中mAA的表達(dá)，SP法：A.野生型空白組；B.野生型實(shí)驗(yàn)組(箭頭所示)；C.敲除型空白組；D.敲除型實(shí)驗(yàn)組(箭頭所示)

2.2 AA淀粉樣變中HSF1的缺失對(duì)UPR作用的影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)中的關(guān)鍵蛋白GRP78的表達(dá)，標(biāo)志ERS的激活與UPR的啟動(dòng)。Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示：野生型實(shí)驗(yàn)組、敲除型實(shí)驗(yàn)組中GRP78蛋白表達(dá)量均高于相應(yīng)的空白組，而敲除型實(shí)驗(yàn)組GRP78蛋白的表達(dá)量明顯低于野生型實(shí)驗(yàn)組(圖4)；提示AA淀粉樣變性激活ERS進(jìn)而引發(fā)UPR，通過誘導(dǎo)GRP78的合成促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的折疊，對(duì)受損細(xì)胞具有保護(hù)作用，而HSF1的缺失一定程度上削弱了這種保護(hù)反應(yīng)。

圖4 Western blot法檢測(cè)各組小鼠肝臟組織中GRP78的表達(dá)

2.3 ATF6與XBP1 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性RT-PCR結(jié)果顯示：野生型實(shí)驗(yàn)組ATF6 mRNA表達(dá)量低于野生型空白組，但前者XBP1 mRNA表達(dá)量顯著高于后者；敲除型實(shí)驗(yàn)組ATF6 mRNA表達(dá)量顯著高于敲除型空白組，但前者XBP1 mRNA表達(dá)量低于后者。以上結(jié)果提示，在AA淀粉樣變過程中，ATF6與XBP1的表達(dá)呈反向相關(guān)(圖5)。

圖5 各組小鼠肝臟組織中ATF6和XBP1 mRNA的表達(dá)量

本組針對(duì)ATF6因子進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果可見敲除型實(shí)驗(yàn)組ATF6蛋白的表達(dá)量顯著上升(圖6)，此結(jié)果與RT-PCR結(jié)果相吻合。再針對(duì)XBP1因子進(jìn)行Western blot檢測(cè)，可見野生型實(shí)驗(yàn)組XBP1蛋白表達(dá)量顯著高于野生型空白組，敲除型實(shí)驗(yàn)組XBP1蛋白表達(dá)量明顯低于敲除型空白組，而野生型空白組與敲除型空白組XBP1蛋白的表達(dá)量無明顯差異，該結(jié)果亦與RT-PCR結(jié)果相吻合。此外，作為ATF6直接調(diào)控的下游因子以及經(jīng)剪切后發(fā)揮作用的XBP1s原型，XBP1u在野生型實(shí)驗(yàn)組淀粉樣變的發(fā)展中表達(dá)增強(qiáng)，而在敲除型實(shí)驗(yàn)組淀粉樣變的發(fā)展中表達(dá)減弱(圖7)。

圖6 Western blot法檢測(cè)各組小鼠肝臟組織中ATF6的表達(dá)

圖7 Western blot法檢測(cè)各組小鼠肝臟組織中XBP1的表達(dá)

3 討論

淀粉樣變性是一種以蛋白質(zhì)構(gòu)象障礙為特點(diǎn)的嚴(yán)重慢性全身性疾病，AA淀粉樣變性是最常見的系統(tǒng)性淀粉樣變性之一，其發(fā)病機(jī)制與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)。HSF1作為調(diào)節(jié)熱休克蛋白的主要轉(zhuǎn)錄因子，能夠抑制朊病毒蛋白(prion protein, PP)、多聚谷氨酰胺(polyglutamine)蛋白等蛋白質(zhì)的異常聚集和錯(cuò)誤折疊，還可影響老化淀粉樣物質(zhì)(AApoAII amyloid fibrils)的形成[4-6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣證實(shí)HSF1的缺失促進(jìn)肝臟AA淀粉樣變的形成，且淀粉樣變沉積多侵及匯管區(qū)血管壁，肝實(shí)質(zhì)一般不受侵犯，與先前實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合[7]。

同時(shí)已有多種研究表明，應(yīng)對(duì)ERS的保護(hù)性反應(yīng)UPR與AD等淀粉樣變疾病高度相關(guān)[8]。UPR系統(tǒng)由3個(gè)緊密相連的信號(hào)通路構(gòu)成，分別為PKR樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶、ATF6和肌醇酶1α(inositol-requiring enzyme 1α, IRE1α)。其中，ATF6和IRE1α的啟動(dòng)子與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的GRP78結(jié)合，通過誘導(dǎo)分子伴侶和去除錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)起保護(hù)細(xì)胞的作用：ATF6全長(zhǎng)蛋白在轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體后被激活，并被加工為可溶性細(xì)胞質(zhì)片段釋放，能夠進(jìn)入細(xì)胞核并激活特定基因子集的轉(zhuǎn)錄。IRE1α則通過自磷酸化被激活，導(dǎo)致XBP1 mRNA的加工，產(chǎn)生有效的轉(zhuǎn)錄因子XBP1s發(fā)揮作用。有關(guān)ATF6與XBP1通路的緊密聯(lián)系已得到證實(shí)：當(dāng)細(xì)胞處于穩(wěn)態(tài)時(shí)，ATF6以酶原形式與GRP78結(jié)合[9]；而UPR啟動(dòng)后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的GRP78-ATF6復(fù)合體發(fā)生解聚，ATF6經(jīng)高爾基體被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核中，通過調(diào)節(jié)XBP1等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄從而減輕ERS、恢復(fù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在野生型實(shí)驗(yàn)組ATF6因子表達(dá)低于野生型空白組，XBP1因子表達(dá)則高于空白組；而在敲除型組中ATF6、XBP1因子表達(dá)呈相反趨勢(shì)，這可能是由于HSF1基因?qū)C(jī)體具有保護(hù)作用，從而抑制應(yīng)激的過度表達(dá)：在AA淀粉樣變性初期，HSF1基因被激活，增強(qiáng)ATF6和XBP1通路相關(guān)因子的表達(dá)以對(duì)抗應(yīng)激損傷；一旦應(yīng)激過度對(duì)機(jī)體自身造成破壞，ATF6的表達(dá)將被HSF1反向抑制，呈XBP1表達(dá)增強(qiáng)而ATF6表達(dá)減弱的趨勢(shì)。在HSF1基因敲除后，ATF6的表達(dá)因不受制約而顯著增強(qiáng)，應(yīng)激持續(xù)存在，下游XBP1的表達(dá)隨之急劇增加，進(jìn)而激活下游的凋亡途徑，導(dǎo)致機(jī)體損傷進(jìn)一步加重。另外，結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果“XBP1u在野生型實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)高于敲除型實(shí)驗(yàn)組”，可以推測(cè)敲除型實(shí)驗(yàn)組XBP1s表達(dá)急劇增強(qiáng)會(huì)反過來抑制XBP1u的表達(dá)，從而使XBP1整體表達(dá)減弱，最終呈ATF6的表達(dá)增強(qiáng)而XBP1表達(dá)減弱的趨勢(shì)，其結(jié)果有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，HSF1的缺失削弱肝臟組織中的UPR反應(yīng)，從而加劇了機(jī)體淀粉樣物質(zhì)的沉積程度，強(qiáng)有力地證實(shí)HSR和UPR之間的相關(guān)性。這與先前的實(shí)驗(yàn)結(jié)論相吻合：HSR能通過多種途徑對(duì)UPR起調(diào)節(jié)作用，包括上調(diào)參與蛋白質(zhì)折疊和分泌的基因、抑制總體轉(zhuǎn)錄和翻譯以及協(xié)調(diào)氧化應(yīng)激等其他應(yīng)激反應(yīng)；并且HSR和UPR能夠共同控制ERS中的蛋白質(zhì)折疊和分泌，增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的抗逆性[11]；同時(shí)也有實(shí)驗(yàn)表明，通過HSR激活HSF1需要完整的UPR通路[12]，從而證實(shí)UPR對(duì)HSR亦存在調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)通過探討HSF1對(duì)ATF6-XBP1通路在肝臟AA淀粉樣變性中的作用機(jī)制，揭示了HSR與UPR在其中的相互作用，為淀粉樣變疾病的發(fā)病機(jī)制提供新依據(jù)，有助于該病在臨床上的預(yù)防與治療策略的合理選擇。