江西省首例Rh 基因鑲嵌體血清學(xué)特點(diǎn)及分子生物學(xué)的研究

王長(zhǎng)奇，王康，劉莎，桂紅云，龔晨輝，饒美英*，高宏軍，鄧小兵，吳怡，陳園

(1.江西嘉佑曙光骨科醫(yī)院，南昌 330003；2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院，南昌 330006；3.江蘇力博醫(yī)藥生物技術(shù)股份有限公司，無錫 214400）

個(gè)體中可能同時(shí)存在兩個(gè)或兩個(gè)以上不同細(xì)胞系的現(xiàn)象。 如果細(xì)胞系來源于一個(gè)合子，通常稱之為鑲嵌體（Mosaic）；如果細(xì)胞系來源于兩個(gè)或者兩個(gè)以上合子，則稱之為嵌合體（Chimera），音譯為“開米拉”。 Anderson 于 1951 年研究了牛的嵌合體，描述了這兩種不同情況[1]。 后來，又有學(xué)者建議對(duì)其進(jìn)行區(qū)分，以便明確這兩種現(xiàn)象不同的起源、頻率和對(duì)組織的影響等[2]。 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的血型嵌合體和鑲嵌體的現(xiàn)象比較少見，其中，鑲嵌體主要由染色體畸變和基因突變產(chǎn)生； 而嵌合體主要是由于雙生子之間的血管交叉吻合， 造血細(xì)胞通過吻合的血管交換而產(chǎn)生[3]。 筆者在進(jìn)行Rh 血型檢查中發(fā)現(xiàn)1 例DC 雙相，經(jīng)血清學(xué)檢查和基因分析證實(shí)為Rh 基因鑲嵌體，這是我省首次發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 患者，男，19 歲，南昌人，由于手外傷而入院。實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了ABO 常規(guī)血型、Rh 亞型、血常規(guī)、尿常規(guī)、凝血常規(guī)、生化等檢查。

1.2 主要試劑和儀器設(shè)備 試劑：Rh 血型分型檢測(cè)卡由江蘇力博醫(yī)藥生物技術(shù)股份有限公司提供，批號(hào)：201911005；抗人球蛋白檢測(cè)卡由江蘇力博醫(yī)藥生物技術(shù)股份有限公司提供， 批號(hào)：201908001；ABO、RhD 血型抗原檢測(cè)卡由江蘇力博醫(yī)藥生物技術(shù)股份有限公司提供， 批號(hào)：201910007；人類紅細(xì)胞RhD 基因分型試劑盒(熒光 PCR 法)，批號(hào):20200605；人類紅細(xì)胞 RhCE 基因分型試劑盒(熒光 PCR 法)，批號(hào):20200727；RhD外顯子（科研）測(cè)序試劑盒（批號(hào)：20200317）由江蘇中濟(jì)萬泰生物醫(yī)藥有限公司提供。所有試劑均在有效期內(nèi)且按說明書進(jìn)行操作，室內(nèi)質(zhì)控符合要求。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 血清學(xué)試驗(yàn) 采集先證者及其父母的外周血樣本檢查。 Rh 血型分型檢測(cè)，抗人球蛋白檢測(cè)，不規(guī)則抗體篩查，ABO、RhD 血型抗原檢測(cè)均由江蘇力博醫(yī)藥生物技術(shù)股份有限公司提供的微柱凝膠卡進(jìn)行鑒定。

1.3.2 毛細(xì)管分離技術(shù) ⑴用鹽水洗滌紅細(xì)胞3次，末次洗滌后900-1000g 離心5-15min，在保留白膜層的情況下盡可能去掉上清，混勻(離心血樣，吸取白膜層附近的紅細(xì)胞,洗滌后混勻)。 ⑵毛細(xì)管內(nèi)加入混勻的洗滌紅細(xì)胞，橡皮泥封死管底。 ⑶毛細(xì)管離心機(jī)離心20-25min。 ⑷在近心端處切取3-5mm，將紅細(xì)胞沖到干凈試管，鹽水洗滌，配置相應(yīng)的濃度進(jìn)行測(cè)試。

1.3.3 Rh 基因分型 RhD 外顯子（科研）測(cè)序，人類紅細(xì)胞RhD 基因分型試劑盒(熒光PCR 法)，人類紅細(xì)胞RhCE 基因分型試劑盒(熒光PCR 法）按照試劑盒操作說明書提取基因組DNA 進(jìn)行Rh 基因分型。 該工作由江蘇中濟(jì)萬泰生物醫(yī)藥有限公司完成。

2 結(jié)果

2.1 先癥者血常規(guī)，尿常規(guī)，凝血常規(guī)，生化等檢查:結(jié)果均在參考范圍那內(nèi)。

2.2 RhD 血型抗原檢測(cè) RhD 血型抗原檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，血液中有2 種血型的紅細(xì)胞，外觀出現(xiàn)混合凝集現(xiàn)象，見圖1。

圖1 低倍鏡下部分凝集的紅細(xì)胞

2.3 先癥者和其父母ABO 血型和 Rh 血型檢查發(fā)現(xiàn)先癥者血型為“O”，Rh 血型檢查為D 雙相，父母 ABO 血型都是 B 型，Rh 血型檢查 D 為陽性。 檢查結(jié)果見圖2 和圖3。

圖2 先癥者ABO 血型

2.4 先癥者Rh 分型檢查 結(jié)果先癥者C 雙相和D雙相為雙相， 基因型有可能為 CcDee、Ccdee、ccDee、ccdee，有待基因檢測(cè)進(jìn)行鑒定。 圖 4 和圖 5分別給出了Rh 分型檢查結(jié)果和洗滌后Rh 分型檢查結(jié)果。

2.5 先癥者其父母Rh 分型檢查：結(jié)果先癥者其父親Rh 分型檢查為CCDee， 先癥者其母親Rh 分型檢查為ccDEe。 兩者的檢查結(jié)果分別見圖6 和圖7。

圖3 先癥者父母ABO 血型

圖4 先癥者Rh 分型

圖5 先癥者洗滌后Rh 分型

圖6 先癥者父親Rh 分型

2.6 先癥者不規(guī)則抗體測(cè)定 先癥者不規(guī)則抗體測(cè)定結(jié)果均為陰性，測(cè)定結(jié)果見圖8。

圖7 先癥者母親Rh 分型

圖8 先癥者（右邊三個(gè)）不規(guī)則抗體測(cè)定

2.7 先癥者毛細(xì)管離心法檢查 結(jié)果先癥者C 雙相 D 雙相為雙相，Rh 基因型有可能為 CcDee、Ccdee、ccDee、ccdee，有待基因檢測(cè)進(jìn)行鑒定。 圖 9給出了毛細(xì)管離心法檢查結(jié)果。

圖9 先癥者毛細(xì)管離心法檢查近端結(jié)果

2.8 先癥者用抗D 血清分離后檢查： 先癥者用抗D 血清分離后分型檢查大D 大C 均為陰性。 檢查結(jié)果見圖10。

圖10 用抗D 血清分離后分型檢查結(jié)果

表1 先癥者及其父母Rh 基因分型

2.9 先癥者核酸檢測(cè)分析 ⑴臨床血清學(xué)先證者可見D,C 雙群，懷疑嵌合。 其父母血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果與基因分型結(jié)果相符， 根據(jù)其父母血清學(xué)結(jié)果推斷該患者有可能是鑲嵌體：ccdee+CcDee。⑵以基因測(cè)序方法進(jìn)行分析沒有發(fā)現(xiàn)突變，故改選方案，使用熒光PCR 定量分析。 ⑶熒光PCR 定量分析：根據(jù)血清學(xué)推斷， 選擇以RhD 第十外顯子以及C 的特征突變點(diǎn)為目標(biāo)，結(jié)果以CT 值表示，CT 值為達(dá)到一定熒光量所需的循環(huán)數(shù)， 在固定基因組DNA的情況下，可測(cè)定出其基因組DNA 內(nèi)該型別基因含量。 （見表 2)

表2 其基因組DNA 內(nèi)該型別基因含量

綜合上述檢查證實(shí)為該先證者為CcDee+ccdee 嵌合。

2.10 先癥者兩代Rh 血型家系圖見圖11。

圖11 先癥者兩代血型家系圖

3 討論

本研究中的先證者外表正常， 分娩時(shí)并無雙胞胎，無輸血史和干細(xì)胞移植史，可以排除天然和人工開米拉。 其父母ABO 血型正反定型相符，Rh血型分析分別為CCDee 和ccDEe， 因此懷疑為罕見的Rh 鑲嵌體。 通過研究發(fā)現(xiàn)，Rh 血型鑒定有混合現(xiàn)象，可能先證者體內(nèi)含有2 種細(xì)胞象，也就是發(fā)育期的鑲嵌體現(xiàn)象。先癥者參加過獻(xiàn)血，都以Rh陽性血輸給了患者，如果患者自身需要輸血，也可以用Rh 陽性血輸給自己，此基因型可能不會(huì)引起輸血反應(yīng)。

關(guān)于嵌合體血型的研究較多,有報(bào)道稱嵌合體血型能引起嚴(yán)重的輸血反應(yīng)。 有1 例61 歲患者因右腎癌細(xì)胞切除術(shù)后高血壓,Hb 降低, 輸入量為281ml 的O 型的紅細(xì)胞幾小時(shí)后發(fā)生嚴(yán)重的溶血[4]， 其原因是嵌合體現(xiàn)象常常導(dǎo)致ABO 表現(xiàn)型遺傳上的不相符[5]。 在中國(guó)臺(tái)灣發(fā)現(xiàn)1 例21 歲大學(xué)生的血清學(xué)血型為AB,但她的父親、母親卻分別為BO1 型和A102O02 型， 通過單體型基因的HLAABC,HLA-DR-B,16 個(gè) STR 位點(diǎn)以及 2 個(gè) X 染色體,6 個(gè)Y 染色體STR 位點(diǎn)的檢測(cè)分析, 該個(gè)體為A102O02/B101O02 開米拉血型[6]。 可見 Rh 嵌合體會(huì)導(dǎo)致Rh 表現(xiàn)型遺傳上的不相符，在臨床上應(yīng)引起高度重視。 同樣鑲嵌體血型也有一些實(shí)例，通過研究發(fā)現(xiàn), 后天RhD 鑲嵌體可能是骨髓及外骨髓增殖疾?。╩yeloproliferative disease,MPL）的信號(hào)[7]。這種鑲嵌體可能與白血病和骨髓增生異常綜合征有關(guān)，它會(huì)引起缺乏腫瘤抑制基因的缺乏，使得受影響器官的惡性轉(zhuǎn)化[8]。 此時(shí)需加強(qiáng)對(duì)患者血液病的篩查，有助于骨髓腫瘤的診斷和預(yù)測(cè)。

Rh 血型實(shí)驗(yàn)是輸血醫(yī)學(xué)中僅次于ABO 系統(tǒng)的第二大血型系統(tǒng)，Rh 血型系統(tǒng)抗原有D 和C、c、E、e 五種， 分別由 RhD 基因和 RhCE 基因編碼組成，RhD 和RhCE 蛋白均是反復(fù)跨膜的蛋白質(zhì)，Rh血型表型的多態(tài)性由基因基礎(chǔ)即RHD 和RHCE基因突變所決定[9,10]。 使用相應(yīng)的抗D、抗C、抗c、抗E 和抗e 五種血型試劑可以鑒定這些抗原，臨床上D 抗原是Rh 抗原中免疫原性最強(qiáng)的抗原，也是最具有臨床意義的抗原。 目前也發(fā)現(xiàn)抗E、抗C抗原引起溶血的報(bào)道[11,12]。 由于患者D 抗原出現(xiàn)了雙相，C 抗原也出現(xiàn)雙相， 采用高分辨率熒光對(duì)樣本進(jìn)行Rh 基因分型。 根據(jù)上述檢測(cè)結(jié)果，先證者RhD 外顯子10 的CT 值約為其父的一半， 其母的測(cè)量值則介于先證者與其父之間， 推測(cè)其存在鑲嵌體；RhCE 分型結(jié)果可見先證者存在Cc，且C 的CT 值為 c 的 1/2，推測(cè)其鑲嵌體組合為 Cc+cc。 先證者父親存在一股RhD-RhCE 雜合， 另一股為正常D，其表現(xiàn)型為CCDee；其母親為一股RhD 全缺失，一股正常D，其表現(xiàn)型為ccDEe；先證者帶有兩群細(xì)胞, 一群細(xì)胞表現(xiàn)型為CcDee， 另一群為ccdee。 先證者基因型鑒定為 CcDee/ccdee。 病人遺傳關(guān)系可清楚歸納于家系圖中。

目前， 國(guó)內(nèi)外有一些關(guān)于臨床上比較常見的嵌合體和鑲嵌體的研究， 這些工作對(duì)可能的疾病有一定的啟示，并且優(yōu)化了部分疾病的治療方案。本例患者RH 鑲嵌體的研究對(duì)科學(xué)合理用血、更為精準(zhǔn)的臨床診斷和治療有很大指導(dǎo)意義。