一種由大體積惡性胸腔積液中分離腫瘤細胞的方法初探

王閆飛 梁震 劉勇 寇芙蓉 姜丹鳳 鄭艷群 劉巍 朱步東

惡性胸腔積液（malignant pleural effusion, MPE）是晚期惡性腫瘤常見并發(fā)癥，如非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）、乳腺癌、淋巴瘤等[1]。分離和鑒定MPE中腫瘤細胞及其基因突變類型對于疾病診斷、病情評估以及治療策略的制定有重要臨床意義。目前，有多種方法用于從MPE中分離腫瘤細胞，如激光捕獲顯微切割技術(shù)、流式細胞分選技術(shù)以及磁珠捕獲等，但這些方法共同缺點是不能實現(xiàn)從大體積MPE中高通量分選腫瘤細胞，部分技術(shù)在分選過程中還需對細胞進行固定和染色，使得分離細胞不能進行后續(xù)培養(yǎng)和分析，進一步限制了這些方法的廣泛運用[2-4]。

本研究基于腫瘤細胞與正常細胞在細胞分離液中沉降系數(shù)不同，聯(lián)合運用細胞分離介質(zhì)Percoll和Ficoll通過密度梯度離心方法分離、富集大體積MPE中的腫瘤細胞。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2018年8月-2018年10月于北京大學腫瘤醫(yī)院日間病房門診操作室進行胸腔積液引流的20例連續(xù)的伴MPE的晚期肺癌患者，留取一次引流操作收集的全部胸腔積液，胸腔積液量500 mL-1,000 mL?；颊咂骄挲g（60.9±11.4）歲，男性13例，女性7例，男女比例1:0.54。所有患者均經(jīng)病理確診為肺癌，其中腺癌18例，小細胞癌2例。其中10例肺腺癌患者已進行腫瘤組織二代基因測序（next-generation sequencing, NGS）基因檢測，檢測實驗室與panel不限。所有患者胸腔積液脫落細胞學均找見腫瘤細胞。本研究經(jīng)醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者均簽署了知情同意書。

1.2 試劑 Percoll細胞分離液（上海前塵生物科技有限公司），F(xiàn)icoll-PaqueTMPLUS單核細胞分離液（GE Healthcare），RPMI-1640培養(yǎng)基（Thermo Fisher）。

1.3 研究方法

1.3.1 胸腔積液腫瘤細胞分離 分離方法在既往文獻[5]基礎上進行適量調(diào)整。將患者一次胸腔積液引流收集所有胸腔積液2,000 rpm室溫離心10 min。留取10 mL上清用作提取游離DNA，棄多余上清后用RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細胞，吸取部分總細胞以提取基因組DNA，調(diào)整細胞濃度為107個/mL。離心管加Ficoll-PaqueTMPLUS單核細胞分離液后按1:1體積比緩慢加入細胞懸液，2,000 rpm室溫離心25 min，此時，F(xiàn)icoll-PaqueTMPLUS單核細胞分離液與RPMI-1640培養(yǎng)基交界面細胞為腫瘤細胞與白細胞，紅細胞沉于管底。吸取交界面細胞，1,000 rpm離心5 min后用RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為107個/mL。離心管加入45% Percoll后，按1:1體積比再緩慢加入細胞懸液。2,000 rpm室溫離心25 min。此時，Percoll與RPMI-1640培養(yǎng)基交界面細胞為腫瘤細胞，離心管底部細胞為以淋巴細胞為主白細胞。

1.3.2 細胞鑒定 將分離所得腫瘤細胞送賽特生物醫(yī)藥科技有限公司進行免疫熒光染色與染色體熒光原位雜交（immunostaining- fluorescenceinsituhybridization, iFISH）檢測，采用抗白細胞分化抗原45（CD45）和白細胞分化抗原31（CD31）的抗體以及8號染色體著絲粒（CEP8）探針，鑒定分離細胞是否為腫瘤細胞，并計算腫瘤細胞的純度。腫瘤細胞判定標準：DAPI（細胞核標記）陽性；CD45陰性；CD31陰性；CEP8顯示異倍體。熒光顯微鏡下隨機選取20個視野，腫瘤細胞的純度=[ DAPI（+）CD45（-）CD31（-）CEP8（異倍體）細胞數(shù)]/DAPI（+）細胞數(shù)×100%。

1.3.3 DNA提取 分別對胸腔積液上清、胸腔積液總細胞及分離腫瘤細胞（tumor cells in pleural effusion, ETCs）進行DNA提取。其中胸腔積液上清游離DNA（tumor derived DNA from pleural effusion supernatant, etDNA）采用康為世紀的游離DNA提取試劑盒CW2612提取；胸腔積液總細胞DNA及ETC-DNA采用康為世紀的血液基因組DNA提取試劑盒CW2087提??；提取方法無調(diào)整。

1.3.4 基因檢測 將所提取的etDNA、胸腔積液總細胞DNA及ETC-DNA送江蘇康為世紀生物科技有限公司應用NGS技術(shù)行基因檢測（cancer50）。

1.4 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的連續(xù)型變量使用均數(shù)±標準差表示；不符合正態(tài)分布的連續(xù)型變量使用中位數(shù)及上下四分位間距表示；分類數(shù)據(jù)比較使用Kappa檢驗，連續(xù)型變量比較使用Wilcoxon符號秩檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MPE腫瘤細胞分離情況 ETCs形態(tài)學特征如圖1所示，可見成簇中大型細胞，出現(xiàn)細胞質(zhì)空泡化，細胞核形態(tài)不一。經(jīng)計數(shù)，從胸腔積液中分離得到腫瘤細胞中位數(shù)量8.50×104（上下四分位間距9.25×103-3.75×105）個。經(jīng)iFISH檢測顯示DAPI（+）CD45（-）CD31（-）CEP8（異倍體），提取細胞符合腫瘤細胞特征性標記（圖2）。隨機選取20個視野，腫瘤細胞的純度85.50%±5.80%。

2.2 比較10例肺腺癌患者MPE不同分離組分基因突變檢測情況 10例行腫瘤組織NGS基因檢測的肺腺癌患者中，組織表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因突變檢出率為70.00%，其中6例患者為外顯子21 L858R突變，1例為外顯子19 L747-A750>P缺失突變（圖3）。對于該10例患者，使用NGS技術(shù)對etDNA、總細胞DNA及ETC-DNA進行基因突變檢測，EGFR基因突變檢出率分別為70.00%、50.00%和70.00%（圖3，表1）。與使用腫瘤組織進行基因檢測檢測金標準相比，檢測結(jié)果一致性分別為100.00%（P>0.999, kappa=1.000）、80.00%（P=0.500, kappa=0.600）和100.00%（P>0.999,kappa=1.000）。ETC-DNA與etDNA相比，一致性較好（P=1.000, kappa=1.000）（圖4）。

對于3種組分中至少一種EGFR突變檢測結(jié)果為陽性的7例患者，etDNA、總細胞DNA、ETC-DNA基因突變中位豐度分別為16.05%（4.78%-43.06%）、1.09%（0.00%-2.39%）和33.02%（18.50%-76.70%）（表1，圖5）。ETC-DNA檢測豐度傾向于高于etDNA檢測豐度，但差異無統(tǒng)計學意義（P=0.310）；兩者均高于總細胞檢測豐度（P=0.018;P=0.018）。

3 討論

3.1 MPE中腫瘤細胞提取 MPE中細胞成分以紅細胞、淋巴細胞為主，腫瘤細胞相對較少。在已有的分離細胞方法中，激光捕獲顯微切割技術(shù)所獲得的腫瘤細胞純度最高，認為是金標準，但這項技術(shù)獲得細胞數(shù)量較少，且過程中需干燥細胞，導致細胞損傷，無法進行后續(xù)分析[6]。流式細胞分選技術(shù)是分離細胞的常用方法，處理效率較激光捕獲顯微切割技術(shù)更高，但由于需固定細胞和進行細胞類型特異性抗體標記，使得分選細胞不能用于活細胞實驗和繼續(xù)擴增培養(yǎng)[6]。磁珠捕獲也是基于細胞類型特異性抗體分選技術(shù)，但受處理量限制，也僅能獲得較少量的目標細胞[4]。本研究采用常見細胞分離介質(zhì)Percoll和Ficoll聯(lián)合分離腫瘤細胞，分離過程中無需特殊設備和特異性抗體，成本相對低廉，實現(xiàn)了從大體積MPE中大量分離腫瘤細胞，可獲得104左右的腫瘤細胞，iFISH檢測純度達到80%以上，提取質(zhì)量穩(wěn)定，具有較高的應用前景。

3.2 MPE中分離腫瘤細胞用于液體活檢的前景 NSCLCEGFR基因突變情況與酪氨酸激酶抑制劑臨床效果密切相關[7]，使EGFR基因突變檢測有重要臨床意義。腫瘤組織被認為是進行基因檢測金標準，然而很多患者因活檢困難等原因難以獲得腫瘤組織，使得液體活檢成為基因檢測優(yōu)秀替代。血液循環(huán)腫瘤DNA（circulatory tumor DNA,ctDNA）是常用液體活檢來源，但由于ctDNA含量少，檢測敏感率低[8]。MPE是晚期NSCLC的常見并發(fā)癥，發(fā)生率高達60%[1]，標本易得，取材安全，其中存在大量脫落的惡性腫瘤細胞及腫瘤細胞破碎而來的etDNA，可以體現(xiàn)實時的腫瘤突變狀態(tài)，檢測效果優(yōu)于ctDNA[9]，成為基因檢測的新領域[8]。傳統(tǒng)的研究使用MPE沉渣細胞制成的涂片或石蠟包埋標本進行檢測。MPE沉渣由紅細胞、淋巴細胞為主的白細胞和腫瘤細胞構(gòu)成，因其中混入了大量正常組織細胞，影響了檢測效能，導致檢測敏感性差。Tong等[9]研究采用MPE離心后的上清提取的etDNA進行二代測序檢測，發(fā)現(xiàn)etDNA腫瘤特有突變檢出率98%，高于胸水沉渣細胞DNA（89%）和外周血ctDNA（86%），但仍差于腫瘤組織（檢出率為100%）；在肺癌EGFR突變檢出率中，胸水上清檢出率為71%，高于胸水沉渣細胞（68%）和外周血（59%），而Zhou等[10]的研究顯示，胸水上清etDNA所檢出突變的豐度高于胸水沉渣DNA和ctDNA，與腫瘤組織相近。盡管etDNA的使用已經(jīng)極大改善了液體活檢的檢測敏感性，然而，由于胸腔積液中細胞成分復雜，胸腔積液上清中同樣混有大量正常細胞壞死而來的DNA片段，會干擾對目標基因突變狀態(tài)的檢測，導致檢測敏感性低于腫瘤組織。對于上清液中DNA片段的混雜，現(xiàn)有手段無法進行分離；而采用合適的分離技術(shù)純化腫瘤細胞，優(yōu)化標本質(zhì)量，從而去除MPE沉渣細胞中正常細胞基因組對測序信息的掩蓋，為理論可行。Wang等[11]通過使用流式細胞學手段富集MPE中惡性腫瘤細胞以提高應用等位基因特異的TaqMan聚合酶鏈式反應（competitive allelespecific TaqMan polymerase chain reaction, CAST-PCR）手段對NSCLC患者EGFR基因檢測的效能，該研究顯示，28例NSCLC患者的MPE標本中，應用流式細胞學手段對MPE中的惡性腫瘤細胞進行富集之后，腫瘤細胞中位濃度由0.64%升至40.8%，EGFR基因突變檢測陽性率由28.6%提升到42.9%，檢測敏感性提高了44.4%，提示通過對MPE中腫瘤細胞的提取、富集是提高基因檢測效能的可行方式，但該研究應用流式細胞學對腫瘤細胞進行提取，技術(shù)相對復雜，費用昂貴，限制了該方法的推廣應用。

表 1 肺腺癌患者EGFR基因檢測情況Tab 1 EGFR mutation status in lung adenocarcinoma patients

圖 1 惡性胸腔積液分離腫瘤細胞形態(tài)學特征。A、B可見成簇中大型細胞，出現(xiàn)細胞質(zhì)空泡化，細胞核形態(tài)不一。Fig 1 Morphological characteristics of tumor cells isolated from malignant pleural effusion.There are clusters of large cells with cytoplasmic vacuolization and heterogeneous nuclei (A, B).

圖 2 惡性胸腔積液分離腫瘤細胞iFISH檢測。應用iFISH檢測鑒定分離腫瘤細胞腫瘤細胞判定標準：DAPI（細胞核標記）陽性；CD45陰性；CD31陰性；CEP8顯示異倍體。Fig 2 Identifying isolated tumor cells by iFISH.Criteria for tumor cells: DAPI (nuclear marker)positive; CD45 negative; CD31 negative; CEP8 shows aneuploid.iFISH: immunostainingfluorescence in situ hybridization; DAPI: 4',6-diamidino-2-phenylindole.

圖 3 10例肺腺癌患者腫瘤組織及胸腔積液不同組分EGFR基因檢出情況Fig 3 EGFR mutation status in tumor tissue and different components of pleural effusion in 10 lung adenocarcinoma patients

圖 4 10例肺腺癌患者腫瘤組織及胸腔積液不同組分EGFR基因檢出率Fig 4 EGFR mutation rates in tumor tissue and different components of pleural effusion in 10 lung adenocarcinoma patients

圖 5 7例肺腺癌患者胸腔積液不同組分EGFR基因突變豐度Fig 5 EGFR mutation abundance in different components of pleural effusion in 7 lung adenocarcinoma patients

我們聯(lián)合用兩種常用細胞提取介質(zhì)，對腫瘤細胞進行了有效提取。使用NGS基因檢測發(fā)現(xiàn)，在MPE沉渣中去除體內(nèi)正常細胞后，ETC-DNAEGFR突變檢出率提高，與組織檢出率一致性良好，中位突變豐度明顯增加，有高于etDNA突變豐度的趨勢。進一步改善提純技術(shù)并擴大樣本量后，ETC-DNA的檢測效率有可能進一步提高，優(yōu)于etDNA，有待后續(xù)研究證實。

綜上，本研究建立了一種從晚期腫瘤患者MPE中分離腫瘤細胞方法，與其他分離方法相比，該方法可實現(xiàn)從大體積MPE中分離得到大量純度較高腫瘤細胞，且操作簡便、價格低廉。在去除正常細胞基因組干擾后，使用分離所得的腫瘤細胞進行基因檢測，基因突變檢測率與組織DNA一致性良好，檢測豐度有高于etDNA的趨勢。該方法有較高應用前景，值得推廣及進一步研究。

Author contributions

Wang YF, Liang Z, Liu Y, Liu W and Zhu BD conceived and designed the study.Wang YF, Liang Z, Kou FR, Jiang DF,Zheng YQ selected specimen and clinical data of the study.Wang YF, Liang Z and Liu Y performed the experiments.Wang YF and Liang Z analyzed the data.Wang YF, Liang Z, Kou FR, Jiang DF, Zheng YQ, Liu Wei and Zhu BD provided critical inputs on design, analysis, and interpretation of the study.All the authors had access to the data.All authors read and approved the final manuscript as submitted.