132例晚期非小細胞肺癌胸腔積液EGFR基因突變檢測結果及其臨床意義：一項來自單中心的回顧性研究

魯濤 李強 李嵐 楊凱珍 周丹菲 高潔 陳閩江 徐燕 鐘巍 王孟昭 梁智勇 趙靜

對于晚期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC），初始診斷時胸腔積液發(fā)生率為10%-15%；而對經治患者，于疾病后期出現(xiàn)胸膜轉移或者胸腔積液的發(fā)生率更高[1]。由于惡性胸水中含有一定數量的腫瘤細胞，因此，使得胸水用于確診以及進一步的分子檢測成為可能。當前，胸腔積液表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因突變檢測缺乏標準流程，大部分基因檢測公司檢測時缺乏嚴格的病理質控，造成胸水EGFR基因突變檢測結果和組織檢測結果有一定出入，對臨床指導是否選擇EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI）進行治療造成困惑。近期，一項納入1,226例東亞人群胸水EGFR突變檢測的薈萃分析[2]顯示，胸水標本EGFR突變檢測的靈敏度僅為86%，分析原因可能與檢測方法的敏感性以及缺乏病理質控有一定關系。

因此，本研究擬回顧性分析中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院病理科收集的胸腔積液標本的EGFR突變檢測結果，重點闡述病理質控的標準操作流程以及該結果在真實世界中指導EGFR-TKIs使用情況及臨床療效。

1 資料和方法

1.1 納入標準 ①2012年1月-2018年6月期間，北京協(xié)和醫(yī)院病理科分子病理室收到的胸腔積液標本的患者；②胸腔積液必須進行沉渣包埋及必要的免疫組化檢查，用于診斷NSCLC；③胸水沉渣包埋切片用于病理質控，經判斷滿足標準，適合于進行EGFR基因突變檢測；④所有患者均經組織病理學或胸水細胞學確診為NSCLC；⑤病例資料相對完整，必須包括是否使用了EGFR-TKIs的信息。該回顧性研究經中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會批準進行，所有患者均簽署知情同意書進行EGFR基因突變檢測。

1.2 臨床資料的收集 通過查閱病歷，獲取患者的臨床基線特征及治療信息。本研究收集以下數據：性別、年齡、吸煙史、病理類型、腫瘤原發(fā)灶-淋巴結-轉移（tumor-node-metastasis, TNM）分期、EGFR-TKIs使用情況以及療效，具體包括疾病控制率（disease control rate, DCR）和無進展生存時間（progression-free survival,PFS）。

1.3 療效評價 依照實體瘤療效評價標準（Response Evaluation in Solid Tumors, RECIST）1.1版，分為完全緩解（complete response, CR）、部分緩解（partial response,PR）、疾病穩(wěn)定（stable disease, SD）和疾病進展（progressive disease, PD）。CR和PR必須在4周后經影像學檢查確認。DCR指CR+PR+SD患者比率。PFS定義為開始EGFR-TKIs治療至首次記錄的PD時間或死亡時間。隨訪截止時間至2019年6月30日。

1.4 胸腔積液標本的處理方法 取胸水樣本50 mL，3,500 rpm，離心5 min后，棄上清，再加適量蛋清甘油凝固樣本，并加入9倍于標本量的95%酒精混勻，3,500 rpm，離心5 min后，沉渣石蠟包埋，備用。

1.5 能用于EGFR檢測的胸腔積液標本質量控制標準 取上述石蠟包埋的沉渣，切片，HE染色。鏡下觀察，如果切片中，腫瘤細胞≥100個，即滿足質控標準，可進行EGFR基因突變檢測。如果切片中，腫瘤細胞<100個，則不滿足質控標準，不推薦進行EGFR基因突變檢測。如圖1所示。

1.6 胸腔積液EGFR基因突變檢測 滿足上述質量控制標準的胸水沉渣蠟塊，常規(guī)切片5 μm厚，5張-10張，刮片富集腫瘤細胞，提取DNA并定量。EGFR基因突變，采用市售EGFR基因突變檢測試劑盒（德國凱杰EGFR RGQ PCR Kit，QIAGEN，批號：3540192，貨號：870111），檢測方法和步驟按照試劑盒操作說明書進行。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件進行數據統(tǒng)計學處理。計量資料采用中位數描述，計數資料采用率表示。率的比較采用卡方檢驗或秩和檢驗。均數的比較采用t檢驗。生存數據采用Kaplan-Meier分析并進行Log-rank檢驗。所以統(tǒng)計檢驗均為雙側檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 本研究流程圖 2012年1月-2018年6月，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院病理科分子病理室收到的胸腔積液標本，按照胸水沉渣包埋切片中腫瘤細胞數目≥100個作為質控標準，共有155例胸腔積液標本進行了EGFR突變檢測，排除資料不全、未確診以及非NSCLC患者，最終132例患者納入本研究。132例患者中，72例（54.5%）患者EGFR突變陽性，另60例（45.5%）患者EGFR突變陰性。72例突變陽性患者中，除2例20 Ins以及1例T790M突變患者未使用EGFRTKIs，其余69例患者均使用了EGFR-TKIs。60例EGFR突變陰性患者中，有15例使用EGFR-TKIs。如圖2所示。

2.2 入組患者臨床特征 132例患者中，男性64例（48.5%），女性68例（51.5%）；中位年齡63歲（54歲-74歲）；正在吸煙或既往有吸煙史者35例（26.5%），從不吸煙者97例（73.5%）；除1例（0.8%）為大細胞癌外，其余均為腺癌（131例，99.2%）；分期上均屬于IV期。胸水EGFR基因突變陽性組和EGFR基因突變陰性組，在性別和吸煙方面并未顯示存在顯著差異，P值分別為0.382和0.24，如表1所示。

2.3 入組患者EGFR基因突變情況分布 72例EGFR基因突變中，19 Del和21 L858R是主要突變類型，分別為35例和29例，占EGFR基因突變的88.9%；原發(fā)耐藥突變20 T790M 1例（1.4%）以及20 Ins 2例（2.8%）；另外，EGFR基因雙突變5例（6.9%），且均為19 Del合并20 T790M。

圖 1 病理圖片。A：胸水沉渣包埋切片提示有大量腫瘤細胞，部分排列呈腺管狀及微乳頭狀，全片腫瘤細胞數目大于100，病理質控合格；B：胸水沉渣包埋切片提示腫瘤細胞少，腫瘤細胞單個散在或呈腺管狀，全片腫瘤細胞數目小于100，病理質控不合格（HE染色, ×10）。Fig 1 Pathological pictures.A: The section of pleural fluid sediment embedded in paraffin indicates that there are a large number of tumor cells,which are presented in tubular and papillary morphology.The number of tumor cells in the whole section is more than 100, and the pathological quality control is qualified; B: The section of pleural fluid sediment embedded in paraffin indicates that there are few tumor cells, which are scattered or presented in tubular morphology.The number of tumor cells in the whole section is less than 100, and the pathological quality control is unqualified (HE staining, ×10).

表 1 132例患者的臨床資料［n (%)］Tab 1 Clinical characteristics of the 132 study patients [n (%)]

圖 2 本研究流程圖Fig 2 The flow chart of this study

2.4 132例患者EGFR-TKIs使用情況 132例患者中，84例（63.6%）患者使用了EGFR-TKIs，其中32例（38.1%）使用吉非替尼，12例（14.3%）使用厄洛替尼，38例（45.2%）使用埃克替尼，2例（2.4%）使用奧希替尼。在72例EGFR突變陽性患者中，69例（95.8%）患者使用了EGFR-TKIs，其中29例（40.3%）選擇吉非替尼，9例（12.5%）選擇厄洛替尼，29例（40.3%）選擇?？颂婺?，3例（4.2%）未選擇EGFR-TKIs治療（1例為20 T790M突變，2例為20 Ins）；在這69例患者中，將EGFRTKIs作為一線治療59例（85.5%），作為二線治療10例（14.5%）。在60例EGFR突變陰性患者中，15例（25%）患者使用了EGFR-TKIs，其中3例（5%）選擇吉非替尼，3例（5%）選擇厄洛替尼，9例（15%）選擇?？颂婺?，45例（75%）患者未使用EGFR-TKIs；在這15例患者中，其中將EGFR-TKIs作為一線治療6例（40%），二線治療4例（26.7%），三線及以上5例（33.3%）。

2.5 EGFR-TKIs治療的DCREGFR突變陽性組中24例患者有療效評估結果，無CR出現(xiàn)，23例出現(xiàn)PR+SD，1例出現(xiàn)PD，DCR為95.8%。EGFR突變陰性組中3例患者有療效評估結果，且均為PD，DCR為0%。EGFR突變陽性組和突變陰性組中使用EGFR-TKIs在療效上有顯著差異（P=0.001）。

2.6 EGFR-TKIs治療的PFS 至末次隨訪時，EGFR突變陽性組中69例使用EGFR-TKIs的患者中，43例出現(xiàn)PD，中位PFS為11個月（95%CI: 8.89-13.11）；EGFR突變陰性組中15例使用EGFR-TKIs的患者中，6例出現(xiàn)進展，中位PFS為1個月（95%CI: 0.70-1.30）。兩組采用Log-rank檢驗，P<0.001，有顯著差異。兩組PFS曲線如圖3所示。

3 討論

目前，關于胸水檢測EGFR基因突變的研究主要集中在方法學上，包括傳統(tǒng)測序[3]、下一代測序技術（next generation sequencing, NGS）[4,5]、肽核酸PCR（peptide nucleic acid-PCR, PNA-PCR）測序[3,6]、擴增阻滯突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system, ARMS）[7]、微滴式數字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）[8]、cobas[9]等。一般來說，高靈敏度方法，如cobas、ddPCR或ARMS法較傳統(tǒng)測序以及NGS等方法具有更高的敏感性。另外，有數項研究比較胸水離心后的上清液和胸水沉渣包埋細胞塊用于檢測EGFR基因的敏感性，結果有爭議，部分研究[4,7]顯示兩者檢測結果一致性較高，而另外有研究[10]顯示胸水沉渣細胞塊的敏感性高于胸水上清液。一篇納入15項東亞人群胸水EGFR突變檢測研究的meta分析[2]顯示，相對于腫瘤組織，胸水標本（包括胸水上清液或胸水沉渣包埋細胞塊）EGFR檢測敏感性為86%，特異性為93%，存在14%的漏診率以及7%的誤診率，究其原因可能與胸水標本未進行嚴格病理質控有關。同時這也提示，基因檢測首選腫瘤組織；對于無法獲取組織的晚期NSCLC患者，可用胸水標本替代組織進行EGFR基因突變檢測。

關于胸水EGFR基因檢測的病理質控研究很少，很少有研究關注如何做好胸水檢測EGFR基因突變的質控問題。有學者[7,10]認為，胸水EGFR基因突變檢測的質控取決于所選用的方法，如ARMS法的檢測靈敏度為1%，因此，要求胸水沉渣切片中腫瘤細胞比例須大于1%-2%。一般而言，胸水中腫瘤細胞含量越高或者富集胸水中腫瘤細胞，胸水沉渣EGFR檢測敏感性越高[5,11]。2016版中國NSCLC患者EGFR基因突變檢測專家共識[12]明確指出，無論采用哪種標本類型，均應保證包含足夠的腫瘤細胞，盡量剔除非腫瘤組織和細胞，推薦腫瘤細胞數量在200個以上，腫瘤細胞比例達50%，應用靈敏度高的方法時可酌情降低標準。由于采用了敏感的ARMS檢測方法，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院分子病理科分子病理室將胸水沉渣細胞塊的質控標準規(guī)定為腫瘤細胞≥100個，并以此標準指導臨床樣本檢測。

圖 3 胸水EGFR突變陽性和陰性患者使用EGFR-TKIs的PFS曲線Fig 3 PFS for EGFR positive and negative paitents treated with EGFR-TKIs

本回顧性研究顯示，胸水沉渣細胞塊EGFR基因突變陽性率為54.5%，而且主要是EGFR經典突變19 Del和21 L858R，此與文獻[3,4,7-10]中報道的結果一致。既往研究[13-15]顯示，EGFR基因突變更常見于女性及不吸煙患者。但也有研究[16]顯示，對于有胸腔積液的肺腺癌患者，EGFR基因突變與性別、吸煙史、年齡及腫瘤分期均無關，此與本研究結果一致。另外，本研究未能提示的這些特征，也可能與樣本量少及嚴格病理質控后導致更大選擇性偏倚有關，但嚴格的病理質控是為了保證檢測結果的準確、可靠。本研究中，EGFR突變陽性組，使用EGFR-TKIs，DCR高達95.8%，中位PFS為11個月，而EGFR突變陰性組，使用EGFR-TKIs均在1個月后評估病情，出現(xiàn)PD，中位PFS僅1個月，療效指標均具有顯著差異，這與其他研究結果[3,4,6]一致。雖然胸水沉渣EGFR基因突變檢測結果，無配對腫瘤組織檢測結果進行驗證，但是該檢測結果指導下的EGFR-TKIs使用及其療效與既往通過組織檢測結果指導EGFR-TKIs使用療效一致[17-19]，這也間接說明了具有病理質控把關前提下的胸水沉渣EGFR突變檢測結果準確可靠，具有較強的臨床意義。

本次回顧性研究的132例患者中，84例（63.6%）患者選擇了EGFR-TKIs作為一種治療手段，其中32例（38.1%）使用吉非替尼，12例（14.3%）使用厄洛替尼，38例（45.2%）使用?？颂婺?，僅2例（2.4%）使用奧希替尼。由于一代EGFR-TKIs之間療效差異不明顯，但副作用譜還是有明顯區(qū)別的。其中，厄洛替尼的皮疹、腹瀉發(fā)生率明顯高于吉非替尼、埃克替尼[20]。此外，二代EGFR-TKIs較一代EGFR-TKIs，皮疹、甲溝炎以及腹瀉發(fā)生率顯著升高[21,22]。因此，在臨床治療抉擇中，一代吉非替尼和埃克替尼的使用率遠遠高于厄洛替尼。盡管三代奧希替尼與一代吉非替尼相比，能夠顯著提高PFS和總生存期（overall survival, OS）[23]，不良反應也不明顯，但因經濟原因，一線選擇奧希替尼治療也非常少，本研究中僅2例使用奧希替尼，其中1例是同時合并19 Del和20 T790M突變，另1例為19 Del突變。

多項研究[17-19,21-23]證實，對于EGFR突變陽性患者，EGFR-TKIs較化療能夠明顯延長PFS，同時不良反應大大下降，因此，眾指南均將EGFR-TKIs推薦為一線治療。在本研究中，胸水EGFR突變陽性患者中，85.5%將EGFRTKIs作為一線治療，這也與指南推薦一致。

本研究也有很多局限性。第一，病理質控標準的確定屬于經驗性，應該進一步探討不同質控標準下的檢測敏感性及特異性，以及不滿足質控標準的標本是否可以通過采用富集腫瘤細胞的方法，如顯微切割等，提高腫瘤細胞比例，來提高檢測敏感性，值得進一步研究；第二，缺乏配對的組織標本的檢測結果，無法客觀判斷檢測結果的準確性，另外沒有同時評價胸水上清液是否適合作為組織檢測的替代樣本；第三，本研究數據失訪、刪失比例高，無法獲得OS、客觀緩解率（objective response rate, ORR）等數據用于統(tǒng)計分析；第四，本研究屬于回顧性研究，而且樣本量不大，所得結論尚需大規(guī)模前瞻性研究去進一步驗證。

綜上，采用胸水沉渣包埋細胞塊切片中腫瘤細胞計數≥100作為質控標準，指導進一步進行EGFR基因突變檢測所得結果能夠指導臨床選擇EGFR-TKIs進行治療，具有較強的臨床意義，但其中尚有更多細節(jié)，比如質控標準的優(yōu)化，更適宜推廣的檢測方法，胸水上清液檢測的評價等尚需要進一步研究。

Author contributions

Lu T, Li Q, Li L, Yang KZ, Zhou DF, Gao J and Zhao J conceived and designed the study.Lu T, Gao J, Chen MJ, Xu Y, Zhong W, Wang MZ, Liang ZY and Zhao J performed the experiments.Lu T, Li Q, Li L, Yang KZ, Zhou DF, Gao J and Zhao J analyzed the data.Lu T and Zhao J contributed analysis tools.Zhong W, Liang ZY, and Wang MZ provided critical inputs on design, analysis, and interpretation of the study.All the authors had access to the data.All authors read and approved the final manuscript as submitted.