青牛解毒湯水煎液對(duì)小鼠的鎮(zhèn)痛抗炎作用觀察

唐周一豆，覃驪蘭

青牛解毒湯是一首經(jīng)驗(yàn)方，由壯藥黃牛茶加路邊青退熱湯[1]組成，臨床上治療各種熱毒癥效果顯著，但其作用機(jī)制尚不明確。2018年7～10月，我們采用醋酸扭體法觀察青牛解毒湯水煎液的鎮(zhèn)痛作用，利用二甲苯致小鼠耳廓腫脹、棉球致小鼠肉芽腫以及角叉菜膠致小鼠足趾腫脹法觀察其對(duì)小鼠急慢性炎癥的影響[2]，從而完善對(duì)青牛解毒湯藥理作用的認(rèn)知，為其臨床應(yīng)用及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Secura225D-1CN型萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó)賽多利斯)，TGL-16M型離心機(jī)(湖南湘儀)。

1.1.2 處方組成 青牛解毒湯由路邊青30 g、生石膏30 g(先煎)、黃牛茶15 g、白馬骨15 g、茅莓15 g組成。路邊青為馬鞭草科植物大青的干燥全株，生石膏為硫酸鹽類礦物硬石膏族石膏，黃牛茶為藤黃科黃牛木屬植物黃牛木的根，白馬骨為茜草科植物白馬骨或六月雪的全草株，茅梅為薔薇科懸鉤子屬茅莓的根莖，均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定。

1.1.3 藥品與試劑 醋酸地塞米松(浙江仙琚制藥，生產(chǎn)批號(hào)161259)；二甲苯(天津大茂，生產(chǎn)批號(hào)1301100027)；拜阿司匹靈(德國(guó)拜耳，生產(chǎn)批號(hào)H20130192)；角叉菜膠(德國(guó)Sigma，生產(chǎn)批號(hào)C1013-100G)。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種小鼠，雄性，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可號(hào)SCXK(湘)2016-0002。飼養(yǎng)條件：動(dòng)物于安靜、整潔環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，室溫控制在 25 ℃，相對(duì)濕度 55%～65%，塑料籠內(nèi)以玉米芯作墊料，正常飲食，自由飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均于廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行，并嚴(yán)格根據(jù)廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)委員會(huì)制定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)方青牛解毒湯的制備 根據(jù)人臨床劑量對(duì)小鼠給藥劑量進(jìn)行等效換算，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)決定分別采用臨床劑量的2、4、8倍作為青牛解毒湯的低、中、高劑量，濃度分別為34.125、68.250、136.500 g/kg。路邊青、白馬骨、黃牛茶、茅莓加10倍(m/V)量的蒸餾水浸泡30 min，生石膏布包后加10倍(m/V)量的蒸餾水先煎30 min后，倒入其余藥物浸泡液中；電磁爐煎1 h，得濾液；再次加入8倍量的蒸餾水煎1 h，合并濾液[3]；濃縮并配成濃度分別為34.125、68.250、136.500 g/kg的溶液，置4 ℃冰箱備用。

1.2.2 復(fù)方青牛解毒湯鎮(zhèn)痛作用觀察 采用醋酸扭體實(shí)驗(yàn)。取小鼠50只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機(jī)分成5組各10只。青牛解毒湯低、中、高劑量組分別以34.125、68.250、136.500 g/kg的青牛解毒湯20 mL/kg灌胃，模型組以等體積蒸餾水灌胃，陽(yáng)性藥組以等體積拜阿司匹靈5 mg/kg灌胃，1次/d，連續(xù)7 d。末次給藥1 h后，按順序腹腔注射0.6%冰醋酸，觀察15 min內(nèi)小鼠扭體反應(yīng)(腹前壁緊貼籠底、臀部歪扭、腹部?jī)?nèi)凹和后肢伸張)次數(shù)[4]，并計(jì)算抑制率。扭體反應(yīng)抑制率=(模型組扭體反應(yīng)次數(shù)-給藥組扭體反應(yīng)次數(shù))/模型組扭體反應(yīng)次數(shù)×100%。

1.2.3 復(fù)方青牛解毒湯抗急性炎性反應(yīng)觀察 采用二甲苯致小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)。取小鼠50只，分組及用藥干預(yù)方法同1.2.2，僅陽(yáng)性藥組以等體積醋酸地塞米松5 mg/kg灌胃。末次給藥1 h后，以移液槍將30 μL二甲苯均勻涂布小鼠右耳兩面，20 min后脫頸處死；沿耳根將小鼠雙耳剪下，疊放整齊；用直徑8 mm打孔器制作耳片，精確稱重，以右耳減去左耳質(zhì)量判斷腫脹度，計(jì)算耳廓腫脹抑制率[5]。耳廓腫脹抑制率=(模型組耳廓腫脹度-給藥組耳廓腫脹度)/模型組耳廓腫脹度×100%。

1.2.4 復(fù)方青牛解毒湯抗慢性炎性反應(yīng)觀察 采用棉球致小鼠肉芽腫實(shí)驗(yàn)。取小鼠50只，分組及用藥干預(yù)方法同1.2.3。干預(yù)前各組小鼠腹腔注射4%水合氯醛0.1 mL/10 g麻醉，于小鼠右側(cè)腋窩下置入高溫滅菌的棉球5 mg(100 ℃烘箱干燥12 h至恒重)，縫合，次日干預(yù)用藥。于第8天，將小鼠脫頸處死，剪開(kāi)腋下皮膚并取出棉球；將肉芽組織周圍的脂肪組織剝凈，置于濾紙上；將剝?nèi)『玫娜庋棵耷蚍湃?0 ℃烘箱(提前預(yù)熱)干燥12 h，直至恒重，精密稱量[6]。以植入后棉球質(zhì)量減去植入前棉球質(zhì)量表示肉芽腫質(zhì)量，計(jì)算肉芽腫形成抑制率。肉芽腫形成抑制率=(模型組肉芽腫質(zhì)量-給藥組肉芽腫質(zhì)量)/模型組肉芽腫質(zhì)量×100%。

1.2.5 復(fù)方青牛解毒湯抗炎性腫脹作用觀察 采用角叉菜膠致小鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)。

1.2.5.1 小鼠足趾腫脹度測(cè)定 取小鼠60只，隨機(jī)分為6組各10只，青牛解毒湯低、中、高劑量組及模型組、陽(yáng)性藥組用藥干預(yù)同1.2.3，空白組以等體積蒸餾水灌胃；末次給藥4 h后，除空白組外，其余各組均于小鼠右后肢足跖皮下注射1%角叉菜膠50 μL；30 min后脫頸處死小鼠，于踝關(guān)節(jié)處剪下左右后足，稱重；以左右后足質(zhì)量之差作為足趾腫脹度，并計(jì)算足趾腫脹抑制率[7]。足趾腫脹抑制率=(模型組足趾腫脹度-給藥組足趾腫脹度)/模型組足趾腫脹度×100%。

1.2.5.2 小鼠足趾腫脹組織中前列腺素E2(PGE2)檢測(cè) 取各組小鼠右后足底損傷組織，制成10%組織勻漿；4 ℃下以3 500 r/min離心15 min，取上清液，按試劑盒說(shuō)明步驟測(cè)定損傷組織中的PGE2[8]。

2 結(jié)果

2.1 青牛解毒湯對(duì)醋酸致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)的影響 青牛解毒湯中、高劑量組和陽(yáng)性藥組扭體反應(yīng)次數(shù)分別為(11.1±4.5)、(8.7±4.1)、(2.9±3.9)次，均少于模型組的(18.7±9.5)次(P<0.05或<0.01)；青牛解毒湯低劑量組扭體反應(yīng)次數(shù)為(12.0±6.9)次，與模型組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。青牛解毒湯低、中、高劑量組扭體反應(yīng)抑制率分別為35.83%、40.64%、53.48%，陽(yáng)性藥組為84.49%。

2.2 青牛解毒湯對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響 青牛解毒湯低、中、高劑量組和陽(yáng)性藥組耳廓腫脹度分別為(3.8±1.6)、(3.6±2.7)、(3.2±1.7)、(3.5±2.0)mg，均低于模型組的(7.8±4.8)mg(P<0.05或<0.01)；牛解毒湯低、中、高劑量組耳廓腫脹抑制率分別為51.87%、53.88%、59.55%，陽(yáng)性藥組為55.73%。

2.3 青牛解毒湯對(duì)棉球致小鼠肉芽腫的影響 青牛解毒湯低、中、高劑量組和陽(yáng)性藥組肉芽腫質(zhì)量分別為(7.2±1.6)、(7.0±0.9)、(6.9±1.1)、(6.7±1.0)mg，均低于模型組的(10.7±1.6)mg(P均<0.01)；牛解毒湯低、中、高劑量組肉芽腫形成抑制率分別為32.44%、34.27%、35.11%，陽(yáng)性藥組為37.65%。

2.4 青牛解毒湯對(duì)角叉菜膠致小鼠足腫脹的影響

2.4.1 各組小鼠足趾腫脹度比較 青牛解毒湯低、中、高劑量組和陽(yáng)性藥組足趾腫脹度分別為(42.8±10.0)、(41.3±7.9)、(33.9±11.2)、(11.7±2.6)mg，均低于模型組的(65.2±18.3)mg、高于空白組的(4.4±1.7)mg，且模型組高于空白組(P均<0.01)；牛解毒湯低、中、高劑量組足趾腫脹度抑制率分別為32.03%、34.30%、46.14%，陽(yáng)性藥組為81.47%。

2.4.2 各組小鼠足趾腫脹組織中PGE2表達(dá)比較 青牛解毒湯低、中、高劑量組和陽(yáng)性藥組足趾腫脹組織中PGE2為(135.06±26.14)、(117.94±11.47)、(106.23±10.57)、(127.63±14.31)ng/L，均低于模型組的(143.86±12.92)ng/L(P<0.05或<0.01)；青牛解毒湯低劑量組和模型組高于空白組的(117.12±10.24)mg(P均<0.01)，而青牛解毒湯高劑量組低于空白組(P<0.05)。

3 討論

炎癥是機(jī)體在遇到各種刺激時(shí)所做的防御反應(yīng)，通常表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛和功能障礙。在大多數(shù)情況下，炎癥對(duì)于機(jī)體是有益的，機(jī)體通過(guò)炎癥反應(yīng)控制損傷的進(jìn)一步發(fā)生；然而，在某些失控的情況下也會(huì)對(duì)機(jī)體有一定的損害，如對(duì)人體自身組織的攻擊等。在炎癥過(guò)程中，一方面，損傷因子可直接或間接損傷組織和細(xì)胞;另一方面，機(jī)體通過(guò)一系列血管反應(yīng)、液體滲出、白細(xì)胞滲出及活化，稀釋、中和、殺傷和包圍損傷因子，且機(jī)體通過(guò)實(shí)質(zhì)和間質(zhì)細(xì)胞的再生使受損傷的組織得以修復(fù)和愈合。因此，可以說(shuō)炎癥是損傷、抗損傷和修復(fù)的統(tǒng)一過(guò)程[9]。

黃牛茶[10]為藤黃科黃牛木屬植物黃牛木的嫩葉、根或樹皮。其根及樹皮全年可采，洗凈切碎，曬干；葉春夏采集，晾干。黃牛茶作為壯藥，主產(chǎn)于廣西金秀、平南、桂平、北流、龍州、武鳴、隆安、靖西等地，來(lái)源廣泛，價(jià)格便宜，療效可靠。其性味一說(shuō)是“甘淡微苦，涼”，一說(shuō)是“性平”[11]，歸肺、胃與大腸經(jīng)[12]。研究發(fā)現(xiàn)，其葉含黃酮苷、酚類、糖類，根含黃酮苷、酚類、氨基酸[12]。復(fù)方青牛解毒湯是一首經(jīng)驗(yàn)方，由黃牛茶加路邊青退熱湯[4]所組成，臨床上用以治療各種熱毒癥效果顯著。青牛解毒湯是由路邊青、黃牛茶、生石膏、白馬骨、茅莓按照2∶1∶2∶1∶1配伍而成，主治熱毒內(nèi)盛所致的發(fā)熱。方中路邊青味苦性寒，為清熱毒、通龍路之要藥，主治發(fā)熱；生石膏味甘淡，性寒，長(zhǎng)于清熱毒、退高熱；黃牛茶味甘、微苦，性涼，解暑清熱，利濕消滯。三藥合用，共奏清熱毒、退高熱之功，為方中之主藥。白馬骨味淡、微辣，性微寒，功專清熱毒、調(diào)火路；茅莓味甘、苦，性涼，善清熱毒。二藥合用，共助主藥發(fā)揮清熱毒之作用，為方中之佐藥。五味藥相互配伍，共同發(fā)揮清熱毒、退高熱之功效[13]。

目前，我們對(duì)于黃牛茶的研究大部分都停留在其化學(xué)成分上，而對(duì)由其組成的青牛解毒湯也只是在臨床應(yīng)用上獲得認(rèn)同。本研究采用醋酸扭體法觀察青牛解毒湯水煎液的鎮(zhèn)痛作用，利用二甲苯致小鼠耳廓腫脹、棉球致小鼠肉芽腫以及角叉菜膠致小鼠足趾腫脹法觀察其對(duì)小鼠急慢性炎癥的影響;結(jié)果發(fā)現(xiàn)，青牛解毒湯水煎劑可減少扭體反應(yīng)次數(shù)、耳廓腫脹度、棉球肉芽腫形成量、足趾腫脹度，表明青牛解毒湯具有一定的鎮(zhèn)痛抗炎作用。PGE2是花生四烯酸環(huán)氧合酶的代謝產(chǎn)物，為二十碳不飽和脂肪酸。其作用為擴(kuò)張血管，增加器官血流量，降低血管外周阻力，降低血壓；舒張支氣管平滑肌，降低通氣阻力，抑制胃酸分泌；同時(shí)，還具有免疫抑制和抗炎作用[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，青牛解毒湯對(duì)足趾腫脹小鼠炎癥組織中的PGE2有顯著抑制作用，且抑制作用較陽(yáng)性藥物顯著，從而控制角叉菜膠致小鼠足趾腫脹炎癥的發(fā)生。由此可見(jiàn)，青牛解毒湯具有一定的鎮(zhèn)痛抗炎作用，其減輕角叉菜膠所致炎性腫脹與降低PGE2表達(dá)有關(guān)，可為其臨床應(yīng)用及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。