胰腺十二指腸同源盒基因-1/神經(jīng)生成素3信號(hào)通路在胰島β細(xì)胞分化中的作用機(jī)制研究進(jìn)展

洪洋，楊開明

大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000

糖尿病可分為1型糖尿病(T1D)和2型糖尿病(T2D)。T1D是自身免疫炎癥介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡導(dǎo)致胰島β細(xì)胞丟失，最終導(dǎo)致胰島素分泌減少。T2D是外周組織胰島素抵抗可導(dǎo)致胰島β細(xì)胞衰竭，進(jìn)一步造成血糖升高。長(zhǎng)期高血糖可導(dǎo)致糖尿病患者出現(xiàn)冠心病、腎病等并發(fā)癥，嚴(yán)重危害患者身心健康。傳統(tǒng)治療方法治療糖尿病效果不佳。Shapiro等[3，4]研究發(fā)現(xiàn)，胰島移植治療效果與胰島的分離純化率及存活率密切相關(guān)，且胰島移植僅對(duì)T1D患者治療效果較好。

胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的發(fā)育過程，是由胰芽原始導(dǎo)管上皮干細(xì)胞分化為成熟的胰島功能細(xì)胞的過程，包括三個(gè)階段：第一階段是α細(xì)胞的形成；第二階段是β細(xì)胞的形成；第三階段為內(nèi)分泌祖細(xì)胞繼續(xù)向胰島細(xì)胞分化，使胰腺具有外分泌與內(nèi)分泌兩部分功能。有很多重要轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控β細(xì)胞的分化與成熟[5,6]。目前胚胎發(fā)育中胰干細(xì)胞細(xì)胞譜系多樣化的分子調(diào)控機(jī)制仍不明確。轉(zhuǎn)錄因子的異位表達(dá)可改變或反分化體細(xì)胞的命運(yùn)，這個(gè)過程被稱為細(xì)胞重編程。非β細(xì)胞重新編程為可產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞可能為T1D患者的胰島β細(xì)胞再生治療提供新的思路和方法。研究[7]發(fā)現(xiàn)，胰十二指腸同源盒基因-1(Pdx-1)、神經(jīng)生成素3(Ngn3)、V-maf肌腱膜化纖維肉瘤癌基因同源物A(Mafa)是三種關(guān)鍵的β細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子，可在胰腺發(fā)育的過程中相互影響，將不同類型的細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為胰島素陽性細(xì)胞。Zhou等[8]研究也發(fā)現(xiàn)，這三種轉(zhuǎn)錄因子的特定組合可將成年小鼠中已分化的胰外分泌細(xì)胞重編程為形態(tài)、功能相似的β細(xì)胞，其與內(nèi)源性胰島β細(xì)胞無本質(zhì)區(qū)別，能分泌胰島素來改善高血糖癥。Pdx-1/Ngn3信號(hào)通路可促使β細(xì)胞分化，促進(jìn)干細(xì)胞向β細(xì)胞分化和增殖，通過β細(xì)胞移植治療T1D及晚期T2D，具有較好的臨床應(yīng)用前景。現(xiàn)將有關(guān)Pdx-1/Ngn3信號(hào)通路在胰島β細(xì)胞分化中的作用機(jī)制研究進(jìn)展綜述如下。

1 Pdx-1在胰島β細(xì)胞分化中的作用機(jī)制

β細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)節(jié)胰島素的合成和分泌，這些轉(zhuǎn)錄因子不僅受其他基因的表達(dá)調(diào)節(jié)，而且還受其他蛋白質(zhì)的活性和翻譯后修飾的調(diào)節(jié)。在胰腺內(nèi)分泌部發(fā)育的調(diào)控信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中，Pdx-1/Ngn3信號(hào)各轉(zhuǎn)錄因子及其蛋白對(duì)Ngn3的調(diào)控是該信號(hào)的關(guān)鍵，在胰腺早期發(fā)育中，Pdx-1表達(dá)于各種胰干細(xì)胞，其是胰島素轉(zhuǎn)錄因子也是同源域轉(zhuǎn)錄因子，是腺泡、導(dǎo)管和胰島細(xì)胞發(fā)育的重要因素，在胰腺外分泌和內(nèi)分泌干細(xì)胞中均有表達(dá)[9,10]。

Pdx1又稱為胰島素啟動(dòng)子因子-1(IPF-1)、胰島素上游因子-1(IUF-1)或葡萄糖敏感因子。研究[11]發(fā)現(xiàn)，短暫的高血糖可促進(jìn)大鼠血清Pdx-1基因表達(dá)，而持續(xù)的高血糖則明顯抑制血清Pdx-1基因的表達(dá)。在胚胎發(fā)育早期，Pdx-1僅在E9.5和E12.5之間胰的原始導(dǎo)管的干細(xì)胞中表達(dá)[7,12]。Kodama等[13]研究發(fā)現(xiàn)，彈性蛋白酶Cre介導(dǎo)的Pdx-1失活，會(huì)導(dǎo)致胰發(fā)育過程中外分泌部細(xì)胞分化受損，彈性蛋白酶Cre介導(dǎo)的Pdx-1基因突變小鼠則表現(xiàn)出葡萄糖穩(wěn)態(tài)降低，胰島素分泌減少，可以看出 Pdx-1對(duì)胰的發(fā)育及胰各種細(xì)胞的分化有著重要作用，Pdx-1的消耗和減少會(huì)引起大鼠葡萄糖耐受不良?；蚴Щ钛芯縖14]證明了Pdx-1在胚胎發(fā)生過程中的關(guān)鍵作用，Pdx-1敲除的小鼠會(huì)出現(xiàn)胰發(fā)育不全、Bruner′s腺缺失和十二指腸乳頭畸形。研究[15,16]發(fā)現(xiàn)，敲除Pdx-1基因的小鼠、綿羊會(huì)出現(xiàn)胰發(fā)育和功能障礙，進(jìn)一步證明Pdx-1在胰早期發(fā)育和β細(xì)胞分化成熟中的關(guān)鍵作用，Pdx-1是胰發(fā)育和胰島素基因轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)控基因。

2 Ngn3在胰島β細(xì)胞分化中的作用機(jī)制

Ngn3是對(duì)胰島發(fā)育有重要影響的轉(zhuǎn)錄因子，Ngn3可始動(dòng)內(nèi)分泌祖細(xì)胞，使其分化為內(nèi)分泌細(xì)胞。具有內(nèi)分泌的胰島細(xì)胞均來自瞬時(shí)表達(dá)高水平Ngn3的胰干細(xì)胞，Ngn3活性的喪失幾乎消除了胰島內(nèi)分泌細(xì)胞的分化。小鼠胚胎發(fā)育中Ngn3表達(dá)從E11.5到E15.5達(dá)到峰值，Ngn3基因缺失的小鼠不能產(chǎn)生任何內(nèi)分泌細(xì)胞，也不能表達(dá)胰島素基因增強(qiáng)結(jié)合蛋白1(Islet1)、樁蛋白4(Pax4)、Pax6、神經(jīng)細(xì)胞分化因子1(NeuroD1)等轉(zhuǎn)錄因子，而缺失 Pax6、NeuroD1、轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)蛋白Nkx6.1 或Nkx2.2的胰組織中仍存在Ngn3基因的表達(dá)，提示Ngn3是最早表達(dá)的堿性螺旋環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，它位于這些因子的上游，是內(nèi)分泌細(xì)胞啟動(dòng)分化時(shí)所必需的轉(zhuǎn)錄因子，在促進(jìn)胰內(nèi)胚層細(xì)胞向內(nèi)分泌細(xì)胞分化又能維持成熟胰島細(xì)胞的功能[17]。在成熟胰島細(xì)胞中，過度表達(dá)Ngn3可增強(qiáng)糖尿病患者胰島內(nèi)分泌功能。Ngn3作為內(nèi)分泌干細(xì)胞標(biāo)記，與Pdx-1基因聯(lián)合可誘導(dǎo)非β細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為β樣細(xì)胞，若Ngn3、Pdx-1與唯一一種β細(xì)胞胰島素基因活化轉(zhuǎn)錄因子Mafa結(jié)合，其相互協(xié)同作用還可使多功能干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞，但其潛在風(fēng)險(xiǎn)尚需要深入研究。

Ngn3蛋白的磷酸化或調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的翻譯后修飾，能改變促進(jìn)非β細(xì)胞向β細(xì)胞分化的微環(huán)境，提高β樣細(xì)胞的分化率[18]。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)[19]證明，去除生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞周期的抑制可使Ngn3去磷酸化，促進(jìn)β樣細(xì)胞表達(dá)胰島素基因，促進(jìn)胰干細(xì)胞向內(nèi)分泌細(xì)胞分化，表明抑制Ngn3的磷酸化可促進(jìn)功能性β細(xì)胞的生成。Matsuoka等[20,21]發(fā)現(xiàn)，Mafa能增強(qiáng)Pdx-1將Ngn3陽性的內(nèi)分泌干細(xì)胞重編程為胰島素陽性細(xì)胞、將定型的胰高血糖素α陽性細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為正常陽性細(xì)胞的能力，同時(shí)Pdx-1和Mafa共同作用，促進(jìn)α細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為胰島β細(xì)胞，且單獨(dú)的Pdx-1基因表達(dá)無法在體內(nèi)將α細(xì)胞轉(zhuǎn)化為胰島β細(xì)胞，進(jìn)一步說明，糖尿病細(xì)胞治療時(shí)轉(zhuǎn)錄因子相互作用對(duì) 胰島β細(xì)胞分化和增殖的重要作用。因此，人體胃、腸組織上皮等導(dǎo)管類器官，可作為功能性胰島β細(xì)胞的可再生來源，在糖尿病的發(fā)生、發(fā)展和治療的研究中發(fā)揮重要作用。

3 Pdx-1/Ngn3信號(hào)通路在胰島β細(xì)胞分化中的作用機(jī)制

在復(fù)雜的Ngn3轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，Notch信號(hào)通路可通過誘導(dǎo)Sox9表達(dá)來間接調(diào)控Pdx-1、Ngn3表達(dá)。Ngn 3基因啟動(dòng)子可被 Notch信號(hào)下游靶基因Hes1 阻遏蛋白抑制表達(dá)。Pdx-1可通過結(jié)合其他轉(zhuǎn)錄因子間接或直接激活Ngn3的表達(dá)等多條信號(hào)通路，隨后的調(diào)控中，Ngn3又分別激活下游轉(zhuǎn)錄因子Islet1 、NeuroD1、胰島素瘤相關(guān)蛋白1(Insm1)、Insm2，最后調(diào)控胰島干細(xì)胞分化產(chǎn)生β細(xì)胞、α細(xì)胞、δ細(xì)胞、PP細(xì)胞和ε細(xì)胞等5種內(nèi)分泌功能細(xì)胞[2,22,23]。

胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞亞型由轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同活性決定，這些由基因編碼的蛋白作用于胰干細(xì)胞，表明Ngn3與胰島各內(nèi)分泌干細(xì)胞相互作用，與Ngn3下游基因表達(dá)構(gòu)成的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子形成較復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，通使胰島內(nèi)分泌干細(xì)胞分化形成成熟的胰島細(xì)胞。從Pdx-1/Ngn3信號(hào)通路的調(diào)控作用來看，Pdx-1是Ngn3基因的上游調(diào)控因子，可通過激活Ngn3的表達(dá)調(diào)控胰干細(xì)胞分化。在胚胎發(fā)育過程中，位于Ngn3上游的基因在遺傳譜系追蹤發(fā)現(xiàn)，Pdx-1基因在胰島內(nèi)分泌干細(xì)胞中可直接作用調(diào)節(jié) Ngn3 表達(dá)。

Pdx-1可控制胰腺的早期胚胎發(fā)育和產(chǎn)生胰島素的胰島β細(xì)胞的后期分化，在胰腺早期發(fā)育過程中參與交叉調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)來促進(jìn)內(nèi)分泌祖細(xì)胞的分化。Pdx-1突變的小鼠血清Ngn3以及性別決定區(qū) Y 框蛋白9(Sry related HMG box-9，Sox9)、肝細(xì)胞核因子6(Hnf6)、Hnf1b和叉頭框蛋白A2(Foxa2)等其他調(diào)節(jié)Ngn3基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子水平均降低[1,24]。而胰內(nèi)分泌干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Insm2是Ngn3下游的直接靶基因，也是該信號(hào)通路的下游調(diào)控因子。在Pdx-1和Ngn3的協(xié)同作用下，調(diào)節(jié)Insm2的啟動(dòng)子，激活其表達(dá)。Insm2再通過上調(diào)胰島干細(xì)胞分化的關(guān)鍵基因Pax6、Nkx2.2、Nkx6.1表達(dá)，從而進(jìn)一步分化為各胰島干細(xì)胞，隨后再繼續(xù)分化為成熟的β細(xì)胞胰島β細(xì)胞。其中，Insm2基因受 NeuroD1和Ngn3調(diào)節(jié)，NeuroD1(編碼神經(jīng)源性分化因子1)是參與內(nèi)分泌細(xì)胞譜系以及神經(jīng)元發(fā)育的基本環(huán)螺旋轉(zhuǎn)錄因子。Ngn3直接激活的NeuroD1參與成熟胰島細(xì)胞的維持和分化[25]。二者通過與Insm2 啟動(dòng)子的近端E盒結(jié)合，促進(jìn)神經(jīng)內(nèi)分泌組織中Insm2的表達(dá)[26]。

NeuroD1雜合子基因突變會(huì)導(dǎo)致年輕型晚期糖尿病(maturity onset diabetes of the young 6，MODY 6)[27]。目前MODY 6是臨床上異質(zhì)性的單基因疾病，易感人群為青春期及<25歲的成年人，其特征是胰島β細(xì)胞功能障礙，確診時(shí)要與T1D和T2D鑒別診斷[28]。決定胰島內(nèi)分泌細(xì)胞命運(yùn)的Ngn3及其直接靶基因如Insm2、Pax6、Nkx2同源框2(Nkx2.2)、Nkx6.1(NK6 Homeobox 1)在胰組織各種細(xì)胞中均有表達(dá)，基因敲除Insm2以外的靶基因均可影響胰內(nèi)分泌細(xì)胞的分化和形成[13]。

3.1 Insm2 Insm2與Insm1是從胰島細(xì)胞中分離出的兩個(gè)同源基因，并且編碼的蛋白有相似的蛋白結(jié)構(gòu)。其在胰島細(xì)胞中的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子Ngn3及其靶基因NeuroD1的調(diào)節(jié)。Insm2在胚胎胰發(fā)育的內(nèi)分泌細(xì)胞中表達(dá)，小鼠胚胎從E11.5到E13.5或孕8～20 周時(shí)在胎兒胰組織中達(dá)到表達(dá)峰值，并與Ngn3表達(dá)存在重疊。Insm2表達(dá)在E11.5到E13.5時(shí)瞬時(shí)增強(qiáng)，并在Ngn3 / NeuroD1轉(zhuǎn)導(dǎo)的胰導(dǎo)管上皮細(xì)胞中被激活。

Cai等[29]使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)以及染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)技術(shù)分析了Insm2基因的5′上游區(qū)域，證明了Ngn3和NeuroD1是Insm2基因上游調(diào)控的激活因子。Wang等[30]采用CRISPR-Cas9方法制備純合Insm2-/-小鼠，Insm2-/-小鼠空腹血糖水平高于野生型，葡萄糖耐量和胰島素/ C肽水平均降低野生型。證明Insm2的缺失會(huì)減少葡萄糖刺激的胰島素分泌和降低葡萄糖耐量，Insm2-/-小鼠中Insm1、Ngn3和NeuroD1的轉(zhuǎn)錄水平增加，表明Insm2參與神經(jīng)內(nèi)分泌組織的發(fā)育途徑，該途徑受轉(zhuǎn)錄因子Ngn3、NeuroD1和Insm1調(diào)控。

3.2 Pax6 Pax6是胰島β細(xì)胞Insulin基因表達(dá)的直接激活劑，并維持成熟胰島β細(xì)胞的功能和特性。缺乏Pax6可導(dǎo)致進(jìn)行性致死性糖尿病。在胰島β細(xì)胞中Pax6結(jié)合的基因在缺失后相應(yīng)下調(diào)，這些被結(jié)合和調(diào)控的基因多半可在Pax6缺陷型胰島β細(xì)胞中被激活，表明Pax6在胰島β細(xì)胞中既起轉(zhuǎn)錄激活因子作用，又起阻遏作用，抑制Ngn3啟動(dòng)子、Ngn3的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的表達(dá)，或者抑制Ngn3調(diào)節(jié)劑Foxa2可發(fā)揮其阻遏作用。

Pax6可通過調(diào)節(jié)胰高血糖素基因及Mafb、cMaf和NeuroD1/Beta2基因的轉(zhuǎn)錄影響α細(xì)胞的功能[31]。成年小鼠中若 Pax6 缺失會(huì)導(dǎo)致β細(xì)胞的大量喪失以及α細(xì)胞的擴(kuò)增，最終出現(xiàn)低胰島素血癥和高血糖癥，α細(xì)胞出現(xiàn)的異常可能是β細(xì)胞重新編程或者旁分泌作用，導(dǎo)致Pax6缺乏癥的獨(dú)特代謝表現(xiàn)，即嚴(yán)重的酮癥。Pax6還可直接結(jié)合并激活Pdx-1和Mafa基因啟動(dòng)子，三者協(xié)同作用可激活參與β細(xì)胞分化和功能的必需基因。

3.3 Nkx2.2 Nkx2.2屬于哺乳動(dòng)物NK2同源盒轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，是胰和腸道神經(jīng)內(nèi)分泌分化的生物標(biāo)記，是除σ細(xì)胞外所有胰島細(xì)胞都表達(dá)的細(xì)胞因子，也是參與ε細(xì)胞分化的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子[32]。純合Nkx2.2無效突變的小鼠可患有糖尿病，可能原因?yàn)橐葝uβ細(xì)胞的分化被移植，表明Nkx2.2在胰島β細(xì)胞的最終分化中發(fā)揮重要作用。ε細(xì)胞可調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞的各種功能。ε細(xì)胞能分泌生長(zhǎng)素釋放肽，抑制胰島素從胰島β細(xì)胞的釋放，有助于升高血糖水平，同時(shí)參與胰島β細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，抑制胰島β細(xì)胞凋亡[33]。

Nkx2.2與NeuroD1間的遺傳相互作用可調(diào)控胰島PP細(xì)胞和ε細(xì)胞的相對(duì)比例。Nkx2.2阻止NeuroD1的激活可導(dǎo)致α細(xì)胞的形成，反之則導(dǎo)致β細(xì)胞形成[16]。Nkx2.2還可通過直接與胰島素啟動(dòng)子結(jié)合、與胰島素基因激活復(fù)合物物理締合及誘導(dǎo)調(diào)節(jié)胰島素基因轉(zhuǎn)錄的其他蛋白質(zhì)表達(dá)來發(fā)揮其功能。

3.4 Nkx6.1 Nkx2.2和 Nkx6.1都是α細(xì)胞命運(yùn)決定因子Arx的直接轉(zhuǎn)錄阻遏物，Nkx2.2阻遏物活性的缺乏會(huì)導(dǎo)致小鼠β細(xì)胞向α細(xì)胞轉(zhuǎn)化，抑制Arx表達(dá)可穩(wěn)定β細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[34]。Nkx6.1可在Ngn3 陽性細(xì)胞系中表達(dá)，但最后僅在胰島β細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)。在β細(xì)胞分化前，Nkx6.1和Islet1通過直接轉(zhuǎn)錄機(jī)制拮抗內(nèi)分泌前體中Arx的表達(dá)，阻止與Pdx-1協(xié)同合作的α細(xì)胞功能。此外，β細(xì)胞中Nkx6.1的失活，會(huì)導(dǎo)致β細(xì)胞同一性消失并轉(zhuǎn)化為δ細(xì)胞，使β細(xì)胞具有δ細(xì)胞的特性，在β細(xì)胞分化后，α細(xì)胞和PP細(xì)胞特異性基因的表達(dá)就會(huì)通過獨(dú)立于Nkx6.1的機(jī)制被抑制，表明Nkx6.1的特異性表達(dá)，是成熟β細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，能促進(jìn)內(nèi)分泌前體細(xì)胞向β細(xì)胞分化。

除了通過Arx抑制α細(xì)胞特異性基因外，Nkx6.1還可以將δ、PP和ε細(xì)胞的前體細(xì)胞重新分配在 β細(xì)胞譜系，誘導(dǎo)β細(xì)胞基因和抑制非β內(nèi)分泌基因來促進(jìn) β細(xì)胞命運(yùn)的選擇[35]。缺少Nkx6. 1會(huì)導(dǎo)致β細(xì)胞形成與分化異常,說明維持著β細(xì)胞的正常功能需要Nkx6. 1的持續(xù)表達(dá)。隨著β細(xì)胞分化，需要Nkx2.2來維持Nkx6.1的表達(dá)。在胰 β細(xì)胞形成中，Nkx6.1位于Nkx2.2的下游，介導(dǎo)了β細(xì)胞祖細(xì)胞的擴(kuò)增和最終分化?？杀籔ax6基因激活表達(dá)[36]。

綜上所述，Pdx-1/Ngn3信號(hào)通路是調(diào)控胰島β細(xì)胞分化的重要信號(hào)通路。Pdx-1/Ngn3信號(hào)網(wǎng)絡(luò)各基因依次有序的表達(dá)調(diào)控，能將胰干細(xì)胞通過基因的順序編程分化為β細(xì)胞，隨后由控制成熟胰島細(xì)胞功能所需的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)來控制。對(duì)于胰干細(xì)胞分化調(diào)控信號(hào)的研究，對(duì)臨床上糖尿病的生物治療策略具有重要價(jià)值。目前研究發(fā)現(xiàn)參與胰島細(xì)胞分化調(diào)控中的轉(zhuǎn)錄因子，能夠?qū)⒁绕渌鼉?nèi)分泌細(xì)胞和外分泌細(xì)胞重新編程而分化為β細(xì)胞，證實(shí)了胰島β細(xì)胞的活性可通過胰組織其它細(xì)胞的可塑性而實(shí)現(xiàn)。全面認(rèn)識(shí)胚胎胰發(fā)育以及胰島形成過程的調(diào)控機(jī)制，在探索糖尿病的治療尤其是細(xì)胞替代治療將具有創(chuàng)新意義。