納米探針應(yīng)用研究進展及其對結(jié)腸癌診治的應(yīng)用進展

劉志超，盧波君，楊 炯，屈亞威 綜述 劉海峰 審校

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一[1]，在國內(nèi)，據(jù)調(diào)查其發(fā)病率呈逐年增高，每年新發(fā)病例約140萬例[2]。最新不完全統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，至今美國2020年結(jié)直腸癌全年發(fā)病人數(shù)接近15萬人，占總癌癥發(fā)病人數(shù)的9%，死亡的9%，僅次于肺癌、前列腺癌、白血病，已成為癌癥中的第四大殺手[3]。

早期結(jié)腸癌手術(shù)后5年存活率可高達90%，而晚期存活率僅為17%[4]。因此，結(jié)腸癌的早期診斷與治療對于結(jié)腸癌的預(yù)后非常重要[5]。目前，纖維結(jié)腸鏡仍然是結(jié)腸癌早期診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[6]，但受操作醫(yī)師技能的限制及結(jié)腸生理彎曲等因素，往往存在一定的漏診[7]。常規(guī)手術(shù)不能有效提高患者生存率[8]，而放射治療、化學(xué)藥物治療在殺死癌細(xì)胞時，會給人體正常細(xì)胞也帶來嚴(yán)重?fù)p傷，極大地降低了癌癥患者的生存質(zhì)量[9]。納米探針技術(shù)在材料、生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域的急速發(fā)展為我們更加精準(zhǔn)、高效、低毒地診斷和治療癌癥提供了廣闊的思路。筆者綜述納米探針技術(shù)在結(jié)腸癌診斷和治療領(lǐng)域的研究進展，并展望其應(yīng)用前景。

1 應(yīng)用研究進展

納米探針是一種能探測單個活細(xì)胞的新型超微生物傳感器，具有體積小(1～100 nm)、能在細(xì)胞內(nèi)實時測量、對細(xì)胞無損傷或微損傷等諸多特點，通過將藥物和成像試劑與納米探針有機結(jié)合，可以將藥物和成像劑精確地遞送到病變組織，達到有效治療癌癥、減少藥物毒副反應(yīng)的目的[10,11]。自1960年全球首次報道脂質(zhì)體作為蛋白和藥物載體以來，控釋聚合物、聚乙二醇化的脂質(zhì)體、聚合物膠束、樹枝狀聚合物等眾多的納米材料被應(yīng)用于疾病的診斷和治療[12]。

隨著研究的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)無機納米材料，例如，量子點探針[13]、不同結(jié)構(gòu)的納米金[14,15]、碳納米材料[16]、磁性納米顆粒、鈀納米片[17]、硫化銅納米材料[18]和其他新型納米材料[19,20],這些材料具有較高的對比度、穩(wěn)定性和生物兼容性，可以實時動態(tài)成像，為癌癥的診斷和治療評價提供影像支持。前些年，無機探針在體內(nèi)的潛在毒性與降解問題得不到有效的解決。近幾年，有機納米探針如有機近紅外染料[21]、卟啉脂質(zhì)體[22]和高分子聚合物因在生物安全性方面具有明顯優(yōu)勢而得到研究者們的廣泛關(guān)注，例如，NIR染料探針可隨尿液代謝出體外；基于蛋白質(zhì)、脂質(zhì)體、聚多巴胺等物質(zhì)的光熱探針可在體內(nèi)完全降解；聚苯胺、聚吡咯等光熱探針雖然不易降解，但也不會溶解并釋放出有毒元素[23]，因結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性好而被用于光熱治療；部分聚合物材料具有良好的應(yīng)用前景，但仍需要解決一些問題。

據(jù)不完全統(tǒng)計，截至2010年前已經(jīng)有24種基于脂質(zhì)體、聚合物、白蛋白和納米晶種材料開發(fā)的納米制劑被批準(zhǔn)并應(yīng)用于臨床。如：美國先靈葆雅公司生產(chǎn)Doxil/Caelyx(阿霉素-脂質(zhì)體)可用于治療乳腺癌、卵巢和卡博西肉瘤 可用于治療乳腺癌、卵巢和卡博西肉瘤；美國阿斯利康公司制造并在2014年獲批上市的 Abraxane(紫杉醇-白蛋白混懸劑[24])成功用于治療晚期乳腺癌。納米探針不僅大大提高了抗癌藥物的腫瘤靶向作用，還顯著減少了傳統(tǒng)劑型中使用輔料以及高濃度下化療藥物本身所產(chǎn)生的毒副作用，多個地區(qū)及國家的臨床治療結(jié)果也顯示出其相比于傳統(tǒng)溶劑化療，探針包裹的腫瘤治療效果更好。

我國用于癌癥治療的創(chuàng)新的納米藥物在全國來說仍屬于產(chǎn)業(yè)空白，相比于美國日本等地起步較晚。江蘇恒瑞首仿的注射用紫杉醇(白蛋結(jié)合型)已獲得優(yōu)先審評；國內(nèi)的研究團隊在可降解聚合物納米膠束、脂質(zhì)體包裹ICG 探針和DOX藥物復(fù)合納米顆粒制備上也已取得突破性進展，正在籌備審批用于臨床治療。利用納米探針技術(shù)精準(zhǔn)及高效能地診斷和治療癌癥已成為可能，下一步研究的重點方向?qū)⑹情_發(fā)更加安全的納米級探針。

2 對結(jié)腸癌的診斷應(yīng)用

傳統(tǒng)的生物醫(yī)學(xué)成像技術(shù)，如X線成像、超聲成像、核磁共振成像、計算機輔助層析等，對癌癥的早期檢測效果欠佳。目前，結(jié)腸鏡檢查是結(jié)腸癌診斷的主要方法，如白光內(nèi)鏡、染色內(nèi)鏡等，但單純直觀鏡檢難以在結(jié)腸癌早期靈敏、精準(zhǔn)地診斷，而探針與鏡檢相結(jié)合可對人體內(nèi)部生理或病理過程實現(xiàn)動態(tài)成像，從而對腫瘤進行更早、更有效地診斷[25]。

2.1 酶活化探針 酶的生物相容性強，表面的活性基團便于功能性修飾，因此，酶活化探針可以無創(chuàng)、實時、高特異性、高靈敏度地進行腫瘤病灶檢測。近年來人們發(fā)現(xiàn)某些近紅外光譜(NIR)染料與蛋白質(zhì)之間存在共價或非共價相互作用[26]，從而探索以普通蛋白和酶負(fù)載NIR染料作為熒光探針來識別和定位結(jié)腸腫瘤細(xì)胞。Mitsunaga等[27]研究發(fā)現(xiàn)，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶在結(jié)腸腫瘤細(xì)胞中高表達，可催化酶活化探針發(fā)出熒光，小動物活體實驗顯示，局部噴灑探針后5 min可探查到直徑<1 mm的結(jié)腸腫瘤病灶。余祖紅等[28]利用腫瘤的標(biāo)志物基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)[29]特異性識別多肽底物的特性，設(shè)計和構(gòu)建了分別將熒光素(FITC-N3)和熒光淬滅基團Dabcyl-NHS偶聯(lián)于多肽底物兩端，制備得到MMP-2/9特異性識別的熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)熒光分子探針Dab-GPLGVRGYFITC，將其成功應(yīng)用于人源大腸癌細(xì)胞LoVo和臨床結(jié)腸癌組織樣本體外檢測初步研究，充分證明了探針對MMP-2/9檢測具有較強的特異性和靈敏度，檢測率高達95%以上。該探針與組織結(jié)腸癌裂解液作用后熒光信號比胃炎組織強5到9倍，因此對結(jié)腸癌早期臨床診斷具有極大潛力。

2.2 金納米探針 金納米(gold nanorods，GNRs)是將含金的金屬鹽合成球狀、棒狀及星形等多種形態(tài)、具有不同性質(zhì)屬性的納米顆粒(直徑1～100 nm)。GNRs具有顯著的表面等離子共振(LSPR)特性、制備過程簡單、生物相容性和穩(wěn)定性好，被廣泛應(yīng)用于生物成像和治療中[30]。

Lin等[31]使用金納米顆粒作為表面增強拉曼光譜(SERS)[32,33]的探針，可動態(tài)地獲得結(jié)腸癌患者的血清生物化學(xué)信息。該方法的PCA-LDA(主成分分析-費希爾線性判別分析)診斷算法診斷結(jié)腸癌的敏感性和特異性分別為97.4%、100%，結(jié)果表明以金納米顆粒作為探針的表面增強拉曼光譜聯(lián)合PCA-LDA 對結(jié)腸癌的檢查具有極高的化學(xué)特異性、敏感性和分辨率，如果在今后的研究中，能夠克服掃描速度相對緩慢、光譜的信號較弱等限制因素，該方法會變得更加完善。

Huang等[34]利用Stober法將金納米棒表面的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)替換成硅殼層，顆粒表面修飾葉酸，合成了具有高效CT成像和光熱治療能力的多功能金納米診療體系(GNR-SiO2-FA)。金納米/銀納米的SERS以及局部表面等離子共振效應(yīng)性質(zhì)使其能夠高效地區(qū)分骨骼和其他組織，再結(jié)合光熱/光動力治療，易于實現(xiàn)金納米/銀納米的診療一體化[35]。

2.3 SERS免疫探針 席剛琴等[36]將制備的SERS探針與癌胚抗原(CEA，是唯一推薦用于結(jié)腸癌患者常規(guī)臨床檢測的分子標(biāo)志物[37])單克隆抗體結(jié)合形成SERS免疫探針，將SERS探針與結(jié)腸癌組織切片上的相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性結(jié)合后進行SERS檢測和成像，結(jié)果顯示CEA在結(jié)腸癌腺上皮高表達，在間質(zhì)及正常上皮基本不表達。該結(jié)果表明，SERS標(biāo)記抗體檢測分析技術(shù)具有高敏感性和高特異性，有望應(yīng)用于結(jié)腸癌組織切片中蛋白質(zhì)表達的分析，成為結(jié)腸癌輔助診斷的一種重要方法。

2.4 抗原特異性結(jié)合探針 Sakuma等[38]研究中設(shè)計能與結(jié)腸癌組織TF(Thomsen-Friedenreich)抗原特異結(jié)合的探針，并將其局部應(yīng)用到鼠原位結(jié)腸癌模型中，分別用白光內(nèi)鏡及熒光內(nèi)鏡成像，TF抗原在結(jié)腸癌組織中高表達，而在正常結(jié)腸組織中幾乎不表達，顯示出較好的特異性。結(jié)果顯示，熒光內(nèi)鏡能發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)內(nèi)鏡不易發(fā)現(xiàn)的病變，且可以檢測化療過程中TF表達的動態(tài)改變。

2.5 表皮生長因子受體特異性結(jié)合探針 Liu等[39]局部應(yīng)用能特異結(jié)合EGFR(表皮生長因子受體)的熒光分子探針后，CLE局部成像，結(jié)果顯示，在37 例活體分子成像中，在結(jié)腸癌、結(jié)腸腺瘤患者檢測到熒光信號的比例分別為18/19、12/18，而在10 例正常黏膜處幾乎沒有或僅有很微弱的熒光信號。腫瘤組織的微循環(huán)以擴張、扭曲、囊性血管網(wǎng)的形成為特點，因此，對腫瘤血管的成像并確定其形態(tài)特征，是實現(xiàn)優(yōu)化腫瘤靶向血管治療即抗血管生成療法目標(biāo)的前提之一。

2.6 循環(huán)腫瘤細(xì)胞分子探針 腫瘤細(xì)胞突破細(xì)胞基底膜進入人體血液形成了循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell, CTC)，是腫瘤逐步發(fā)展的重要標(biāo)志，是腫瘤形成并轉(zhuǎn)移的早期狀況。與超聲、影像和穿刺等輔助檢查相比，外周血CTC檢測簡便、無創(chuàng)，能直觀、實時監(jiān)測腫瘤進展。研制CTC分子探針是實現(xiàn)對實體瘤早期診斷的基礎(chǔ)[40]。國內(nèi)龐代文團隊制備了EpCAM單抗修飾磁性納米粒子，實現(xiàn)了全血樣品中CTC的快速捕獲和檢測，已用于結(jié)腸癌除病理外的臨床檢測指導(dǎo)用藥中[41]。

2.7 上轉(zhuǎn)換納米粒子(UCNPs)探針 上轉(zhuǎn)換納米粒子(up-conversion nan-oparticles，UCNPs)具備抗光、發(fā)光穩(wěn)定性良好，生物安全性高，易與抗體耦聯(lián)等的優(yōu)點。曹永等[42]采用熱解法制備CD44v6功能化UCNPs探針，并將其用于體外結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞的熒光成像，為結(jié)直腸癌的早期診斷及治療提供實驗性理論基礎(chǔ)。

3 對結(jié)腸癌的治療應(yīng)用

3.1 納米探針通過光動力療法治療 駱莉萍等[43]利用光敏劑誘導(dǎo)的光動力療法(PDT)[44]，評價血卟啉衍生物(HPD)和5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)兩種光敏劑對結(jié)直腸癌的治療效果，研究者們將120例晚期結(jié)直腸癌患者，隨機分成兩組，觀察組和對照組均采用常規(guī)化療，觀察組聯(lián)合PDT進行治療，周期3個月，結(jié)果，觀察組癥狀改善率、總有效率、中位生存時間均明顯高于對照組，并有統(tǒng)計學(xué)意義，從而證明用5-ALA生物誘導(dǎo)的光動力療法可有效緩解結(jié)腸癌患者的癥狀，延長生存期。

3.2 納米染色標(biāo)記輔助內(nèi)鏡下手術(shù) 據(jù)報道，結(jié)腸癌術(shù)后伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能性高達45%以上，因此，傅駿等[45]探索向癌灶周圍注入鈉米碳染色標(biāo)記，而后再行根治術(shù)，通過隨機對照發(fā)現(xiàn)，鈉米碳淋巴結(jié)示蹤劑染色效果良好，標(biāo)記組淋巴結(jié)檢出數(shù)明顯高于對照組，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)檢出率和黑染淋巴結(jié)陽性轉(zhuǎn)移率均高于對照組。因此，能有效指導(dǎo)與定位結(jié)腸癌手術(shù)，正確制定手術(shù)方案并實施淋巴結(jié)清除術(shù)。

3.3 納米基因載體誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡 余麗[46]通過兩步接枝共聚法制備出粒徑較小、粒度分布均勻的RNA納米顆粒，選取人基因序列中的相關(guān)位點序列構(gòu)建靶向的重組質(zhì)粒，篩選出最佳的重組質(zhì)粒載體，將新型殼聚糖聚乙二醇納米基因載體導(dǎo)入結(jié)腸癌細(xì)胞，評價納米基因載體對結(jié)腸癌的抑制和凋亡效果，結(jié)果顯示，殼聚糖聚乙二醇納米顆粒其細(xì)胞毒性低、轉(zhuǎn)染率高，能夠高效轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞株并有效干擾，誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡并抑制其增殖。其能長時間高效介導(dǎo)干擾沉默結(jié)腸癌細(xì)胞中的基因表達。

3.4 立體復(fù)合膠束對結(jié)腸癌的治療 沈可欣[47]成功應(yīng)用納米技術(shù)合成制備聚乳酸立體復(fù)合膠束，并以環(huán)狀 RGD 多肽作為靶向配體基團修飾納米膠束，然后成功將化療藥阿霉素(DOX)裝載其中作為納米探針負(fù)載抗腫瘤藥物。最后驗證了納米膠束載體SCM/DOX及 cRGD-SCM/DOX能夠提高腫瘤細(xì)胞對藥物的攝取，確定了其在結(jié)腸癌治療中的靶向作用，達到殺傷消滅結(jié)腸癌細(xì)胞的效果。

綜上所述，現(xiàn)在國內(nèi)已有不少優(yōu)秀的科研團隊和企業(yè)在從事商品化納米探針的研發(fā)，并已初見成效，隨著納米技術(shù)在醫(yī)藥、生物、化學(xué)、材料、工程等多領(lǐng)域、多學(xué)科的迅猛發(fā)展，不同材料、不同結(jié)構(gòu)整合于一體的多功能化納米顆粒將被制成探針，能夠研發(fā)出進一步降低生物毒性、增加穩(wěn)定性和個體相容性的產(chǎn)業(yè)化納米探針。將來，納米探針技術(shù)會向集傳輸藥物、靶向跟蹤、分子影像學(xué)診斷、光熱治療、藥物控釋等功能于一體的方向發(fā)展，最終實現(xiàn)納米探針在腫瘤診療一體化領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。