微生物源類胡蘿卜素的研究進展

鄧永平 段 睿 王曉杰 艾瑞波 劉曉蘭

(1.齊齊哈爾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006；2.黑龍江省普通高校農(nóng)產(chǎn)品深加工重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾161006）

類胡蘿卜素是由所有光合生物和一些非光合作用的古生菌、真細菌、真菌合成的具有多烯骨架的異戊二烯類化合物[1]。在動物飼料中添加一定量的類胡蘿卜素，有利于改善動物體色和羽毛顏色，增加觀賞性[2]；也有利于提高動物的生產(chǎn)性能、機體免疫力、繁殖效率等[3-4]，對增加養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟效益具有一定的推動作用。

通過生物（植物、微生物）提取法和化學(xué)合成法均可獲取類胡蘿卜素[1]。化學(xué)合成色素的安全性備受質(zhì)疑，一些化學(xué)合成類胡蘿卜素（如蝦青素）已被發(fā)現(xiàn)有害并且禁止藥店銷售[5-6]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展和人們對食品安全的認識不斷提高，生物提取法獲得的天然來源的類胡蘿卜素需求量越來越大。植物來源的天然類胡蘿卜素生產(chǎn)成本相對較高，且受季節(jié)影響；而微生物來源的天然類胡蘿卜素由于具有天然、高效、生產(chǎn)成本低、易實現(xiàn)工業(yè)化的優(yōu)點而受到科研工作者的青睞。

本文對微生物來源的天然類胡蘿卜素的開發(fā)現(xiàn)狀進行了綜述，以期為產(chǎn)率高、經(jīng)濟可行的微生物法制備類胡蘿卜素提供新的思路。

1 微生物源類胡蘿卜素的合成代謝途徑

在產(chǎn)類胡蘿卜素的微生物代謝中，異戊二烯焦磷酸（IPP）及其異構(gòu)體二甲烯丙烯焦磷酸（DMAPP）是合成所有已知類胡蘿卜素的共同前體物[7]。在古生菌、一些革蘭氏陽性菌以及真菌中，IPP 是以乙酰CoA 為原料，經(jīng)MVA 途徑合成；而在大多數(shù)真菌和細菌（如E. coli）、藻類中IPP 和DMAPP 是以丙酮酸與3-磷酸甘油醛為原料，經(jīng)MEP 途徑合成；某些鏈霉菌屬（Streptomycetes）同時具有上述兩種途徑[8]。

由MVA 和MEP 途徑合成的IPP 及其異構(gòu)化產(chǎn)物DMAPP 在異戊二烯轉(zhuǎn)移酶的催化下以頭尾連接的方式使碳鏈延長，合成牻牛兒基焦磷酸（GPP、C10）、法尼焦磷酸（FPP、C15）或牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（GGPP、C20）[9]。在八氫番茄紅素合成酶（CrtB）催化下兩分子的GGPP 尾尾連接，形成無色的八氫番茄紅素（phytoene）。八氫番茄紅素脫氫酶基因（CrtI）是將無色的類胡蘿卜素轉(zhuǎn)變成紅色的類胡蘿卜素的關(guān)鍵基因。在CrtI 的催化下八氫番茄紅素多步脫氫，形成多種類胡蘿卜素合成代謝的重要前體物——紅色的番茄紅素（lycopene）。番茄紅素在番茄紅素環(huán)化酶（CrtY）催化形成β-胡蘿卜素（β-carotene）或含γ-環(huán)、ε-環(huán)的類胡蘿卜素。隨后，β-胡蘿卜素經(jīng)β-胡蘿卜素羥化酶（CrtZ）和β-胡蘿卜素酮酶（CrtW）的作用轉(zhuǎn)化為玉米黃質(zhì)（zeaxanthin）、角黃素（canthaxanthin）和蝦青素（astaxanthin）。來源于不同菌株的β-胡蘿卜素酮酶基因（crtW）會因其不同的反應(yīng)特性催化β-胡蘿卜素形成多種中間體，從而形成不同的類胡蘿卜素[10-11]。

2 微生物產(chǎn)類胡蘿卜素的研究現(xiàn)狀

能夠合成類胡蘿卜素的微生物包括藻類、真菌、真細菌、古生菌等其中的某些屬或種。類胡蘿卜素作為生物體一種重要的抗氧化劑，其含量受多種氧化應(yīng)激條件及前體物等的誘導(dǎo)，適當(dāng)?shù)牟捎么碳ひ蛩丶罢T導(dǎo)劑對培養(yǎng)過程進行處理有助于提高類胡蘿卜素的產(chǎn)量。

2.1 微藻類胡蘿卜素

微藻具有與高等植物相似的光合作用產(chǎn)能方式，是很有商業(yè)前景的類胡蘿卜素產(chǎn)生菌[12]。微藻類胡蘿卜素為9-順式與全反式β-胡蘿卜素異構(gòu)體組成，相比于化學(xué)合成類胡蘿卜素（全反式）具有更好的脂溶性和結(jié)晶性[13]。關(guān)于微藻產(chǎn)類胡蘿卜素的研究已有較多報道，其中鹽生杜氏藻（Dunaliella salina）、雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）等是產(chǎn)類胡蘿卜素的主要藻類。

鹽生杜氏藻（Dunaliella salina）是天然β-胡蘿卜素的最佳來源之一，在有強烈光照、高濃度鹽、高溫和營養(yǎng)缺乏的條件下，產(chǎn)量最多可占細胞干重的13%[14]，經(jīng)超臨界二氧化碳（SC-CO2）提取后產(chǎn)量可達115.43 μg/g 干微藻[15]。鹽生杜氏藻產(chǎn)類胡蘿卜素受光照和氮源的影響極大，培養(yǎng)后期氮源耗竭后，由于微藻細胞分裂速率的瞬時增加，細胞密度線性增加，光照下的生物量產(chǎn)量大約增加了一倍，同時，β-胡蘿卜素開始在細胞內(nèi)積累[16]。Prieto 等[17]利用開放式罐-封閉的管狀光生物反應(yīng)器兩階段培養(yǎng)鹽生杜氏藻，在第二階段控制氮源的條件下獲得了最高的類胡蘿卜素產(chǎn)量（328.8 mg/月），其中9-順式與全反式β-胡蘿卜素異構(gòu)體比率（1.5）達到最高。Sui 等[18]采用缺氮和高光照兩步培養(yǎng)法實現(xiàn)了鹽生杜氏藻蛋白質(zhì)和類胡蘿卜素的聯(lián)合生產(chǎn)，產(chǎn)量分別為22.7 mg/(l·d)和3 mg/(l·d)。

雨生紅球藻是天然蝦青素的最主要的來源。蝦青素的生產(chǎn)過程包括細胞生長期（綠色）和胞內(nèi)蝦青素積累期（紅色）兩階段。在細胞生長至穩(wěn)定期后，營養(yǎng)物質(zhì)逐漸匱乏，雨生紅球藻細胞生長減緩，胞內(nèi)開始積累蝦青素[19-20]，這個過程受碳源誘導(dǎo)物、光呼吸作用以及初始生物量密度（IBD）等因素影響。在培養(yǎng)基中加入一定量的有機碳源可顯著提高蝦青素的產(chǎn)量。Cordero 等[21]在雨生紅球藻培養(yǎng)基中添加0.30 mM 和0.60 mM 乙酸鈉可分別使蝦青素產(chǎn)量提高1.83%和1.78%。Pan-utaia 等[22]在培養(yǎng)基中添加100 mM 乙酸鉀可進一步提高蝦青素的產(chǎn)量至286 g/l，較對照提高了285%。IBD 是影響雨生紅球藻細胞活力和生產(chǎn)力的一個重要因素，IBD 低易引發(fā)嚴重光抑制光合作用，IBD 高引起個體細胞的嚴重光限制易造成蝦青素產(chǎn)量降低，在0.8 g/l 初始生物量密度下培養(yǎng)H. pluvialis FlotowK-0084 的蝦青素產(chǎn)率最高為17.1 mg/(l·d)[23]。此外，光呼吸直接促進蝦青素代謝途徑關(guān)鍵中間產(chǎn)物三磷酸甘油酸水平，可以加速雨生紅球藻中的蝦青素積累[24]。

除了鹽生杜氏藻和雨生紅球藻外，研究人員在其他藻類中也發(fā)現(xiàn)了類胡蘿卜素。Sivathanu 等[25]利用HPLC-NMR 和LC-MS-APCI 對土生綠球藻產(chǎn)類胡蘿卜素進行了表征，發(fā)現(xiàn)其包含紫黃質(zhì)、蝦青素、葉黃素、玉米黃質(zhì)、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素6 種組分。經(jīng)二氯甲烷提取，在淡水藻中型鞘藻（Oedogonium intermedium）中提取到類胡蘿卜素，其含量達(3 411.2±20.7) μg/g，經(jīng)HPLC-PDA-APCI-ITTOF-MS 鑒定到包括新黃素、9'-順式-新黃質(zhì)、洛羅黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、葉黃素、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素共七種主要的類胡蘿卜素，具有顯著的抗氧化活性[26]。此外，在細小裸藻（Euglena gracilis）類胡蘿卜素生物合成時，β-胡蘿卜素羥化酶基因EgCYP97H1 是類胡蘿卜素生物合成必需基因，編碼β-胡蘿卜素單羥化酶，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)該藻類中生物合成光敏性類胡蘿卜素[27]。

高光強度、高鹽度、極端溫度和氮缺乏等應(yīng)激條件是增強藻類細胞中類胡蘿卜素積累的主要因素。當(dāng)光強度高于微藻光合作用所需的光強度時，就會過量產(chǎn)生β-胡蘿卜素以克服光脅迫和潛在的光氧化損傷[28]。另外，通過基因水平進行調(diào)控，成為了提高微藻類胡蘿卜素產(chǎn)量的新手段。通過藍光可誘導(dǎo)蝦青素的生物合成途徑基因psy、pds、dgat1 和dgat2d 上調(diào)表達，從而使雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）積累了大量的蝦青素，分別比白光和紅光高4.0倍和6.7倍[29]。

2.2 真菌類胡蘿卜素

真菌類胡蘿卜素一般為C40 或C40 衍生物。產(chǎn)類胡蘿卜素真菌包括三孢布拉霉（Blakeslea trispora）、粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）、法夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）等。

B. trispora隸屬于毛霉目，是目前少數(shù)已用于商業(yè)化生產(chǎn)類胡蘿卜素的菌種[30]。該菌在（-）和（+）菌株有性繁殖階段產(chǎn)生的接合孢子與類胡蘿卜素的合成密切相關(guān)，在接合孢子形成中八氫番茄紅素合成酶的含量快速提高，與此同時，類胡蘿卜素含量也快速增加[31]。B. trispora合成的類胡蘿卜素種類受碳源的影響，當(dāng)以乳糖類為碳源時，優(yōu)先合成全反式-β-胡蘿卜素[31]；當(dāng)以油脂為底物時，可增強β-胡蘿卜素產(chǎn)量，而番茄紅素的產(chǎn)量有所降低[32]；當(dāng)有性繁殖培養(yǎng)基中添加乙酸鈉時，乙酸鈉通過檸檬酸循環(huán)轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸酯合成異戊二烯的底物乙酰-CoA，提高B. trispora中β-胡蘿卜素的生物合成參與基因hmgR、ipi、carG、carRA 和carB 基因轉(zhuǎn)錄水平，使β-胡蘿卜素的產(chǎn)量提高80%以上[33]。

B. trispora在外源干預(yù)下可積累番茄紅素。三丙胺通過抑制環(huán)化酶活性，并通過上調(diào)與萜類生物合成相關(guān)的基因的表達，來增強B.trispora的番茄紅素含量，經(jīng)1.8 g/l 三丙胺處理2 d 后，番茄紅素的比例從總類胡蘿卜素的1.7%增加到90.1%，產(chǎn)量達到83.2 mg/g 干物質(zhì)，是對照組的315.8 倍[34]；雙功能蛋白基因carRA 編碼八氫番茄紅素合酶和番茄紅素環(huán)化酶，為了提高番茄紅素的產(chǎn)量，Wang 等[35]對carR和carA基因敲除菌株以及carA過表達菌株進行了研究，發(fā)現(xiàn)carRA 基因收到破壞會使菌株喪失合成類胡蘿卜素的能力，而carA 過表達菌株使番茄紅素含量增加了2.26倍。

粗糙脈孢菌孢子呈橘紅色或黃色，內(nèi)含番茄紅素、紅酵母烯、鏈孢霉黃素、β-胡蘿卜素等多種類胡蘿卜素[36]。O2和H2O2刺激可觸發(fā)光誘導(dǎo)的粗糙脈孢菌類胡蘿卜素的合成[37]。此外，在低溫下經(jīng)光誘導(dǎo)可提高結(jié)構(gòu)基因的mRNA水平，也有利于類胡蘿卜素產(chǎn)量的提高[38]。

X. dendrorhous是商業(yè)生產(chǎn)蝦青素的優(yōu)勢菌，但蝦青素的產(chǎn)量相對較低[39]。Marcoleta Andres 等研究了乙醇與蝦青素合成的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)乙醇的合成受抑制時有利于蝦青素的積累，這一結(jié)果在Xiao的研究中也被證實，此外，X. dendrorhous菌體代謝產(chǎn)物如菌體蛋白、脂肪酸受抑制時也有利于蝦青素的積累[40-41]。谷氨酸通過促進葡萄糖代謝，降低了TCA循環(huán)對乙酰輔酶A 的利用，而表現(xiàn)出對X. dendrorhous蝦青素積累的積極影響，最大含量高達1.14 mg/g（DCW），比對照組高40.7%[42]。

Sakaki等[43]報道光輻射產(chǎn)生的氧化作用誘導(dǎo)了類胡蘿卜素的積累，在光輻射條件，紅酵母紅素的產(chǎn)量比黑暗條件下增加180%。在解脂耶氏酵母培養(yǎng)基中添加煙草可增加總類胡蘿卜素的產(chǎn)量[44]。Mahmoud Yolmeh 等[45]利用紫外線和疊氮化鈉誘變粘紅酵母（Rhodotorula glutinis）PTCC 5256，獲得一株高產(chǎn)菌株，產(chǎn)量可達8.36 g/l。

2.3 細菌類胡蘿卜素

細菌合成了迄今發(fā)現(xiàn)的所有C45 和大多數(shù)C30 和C50 類胡蘿卜素，而其余的則由古細菌產(chǎn)生，類胡蘿卜素數(shù)據(jù)庫中包括來自170 種細菌的307 種類胡蘿卜素和來自9 種古細菌的19 種類胡蘿卜素[46]。

在紅螺菌（Rhodospirillum rubrum）幼齡細胞中發(fā)現(xiàn)了番茄紅素、螺旋黃素等類胡蘿卜素[47]。通過代謝工程手段將球形紅細菌（Rhodobacter sphaeroides）的crtI4 基因?qū)隦hodospirillum rubrum中，敲除zwf 基因阻斷了競爭性磷酸戊糖途徑使番茄紅素產(chǎn)量提高了88%[48]。陳亞淑等[49]對北極海洋紅球菌（Rhodococcus sp.）B7740 產(chǎn)類胡蘿卜素進行了鑒定，發(fā)現(xiàn)極端環(huán)境改變了類胡蘿卜素的存在形式，在該菌株的代謝產(chǎn)物中存在2 種類胡蘿卜素的衍生物——甲基萘醌類類胡蘿卜素，通過液相色譜-質(zhì)譜鑒定出2 種萘醌類類胡蘿卜素，相對分子質(zhì)量分別 為720.6 和718.6，化 學(xué) 分 子 式 是C51H76O2和C51H74O2。Tian 等[50]從極端環(huán)境中分離到了抗輻射球菌R13（Deinococcus xibeiensis R13），該菌在C/N 比為1∶5 和10 μMFe2+存在下可產(chǎn)抵抗γ射線和紫外線照射的類胡蘿卜素，產(chǎn)量為6.64 mg/l，比原條件增加了84%。盛冉等[51]在魯氏不動桿菌Acinetobacter lwoffiiUL 發(fā)酵產(chǎn)物中提取到蝦紅素及較少的蝦青素。

極端嗜鹽古菌（Haloferax mediterranei）在含5%～28%NaCl（w/v）的條件下可產(chǎn)生具有強抗氧化特性的C50 類胡蘿卜素，經(jīng)HPLC-MS 檢測到四種類胡蘿卜素的異構(gòu)體[52]。

3 未來研究方向

相對于植物而言，微生物來源天然類胡蘿卜素的生產(chǎn)周期短，產(chǎn)率高，而且杜氏藻及三孢布拉氏霉類胡蘿卜已經(jīng)進入到工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)階段，但是還存在如下問題：①微藻類胡蘿卜素的生產(chǎn)成本較高，無法與傳統(tǒng)的化學(xué)合成方法和其他技術(shù)（例如從植物來源提取）競爭；另一方面，利用微藻類大規(guī)模生產(chǎn)蝦青素生產(chǎn)周期長，且需要嚴格的控制和維護培養(yǎng)過程；②三孢布拉氏霉來源的β-類胡蘿卜素生產(chǎn)周期長、菌體易衰退、關(guān)鍵基因的調(diào)控機理尚待進一步研究。

為了解決上述問題，可以從以下三方面展開研究：①降低類胡蘿卜素生產(chǎn)成本。類胡蘿卜素的生產(chǎn)原料往往占總成本的30%～70%，以工業(yè)、農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物作為廉價的營養(yǎng)來源是降低類胡蘿卜素生產(chǎn)成本的一個主要途徑，同時還可以提高工農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物的附加值。但是，為了使新生產(chǎn)工藝具有競爭力和可持續(xù)性，需要對新的原料的價格、來源進行評估。此外，針對類胡蘿卜素種類選擇特定碳源，適當(dāng)優(yōu)化基于工業(yè)、農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物的培養(yǎng)基的配方以確保高產(chǎn)類胡蘿卜素，從而降低生產(chǎn)成本。②通過現(xiàn)代生物技術(shù)手段獲得高產(chǎn)類胡蘿卜素菌株。合成生物學(xué)方法可用于改善關(guān)鍵酶的活性，以生產(chǎn)合成代謝途徑所需的代謝產(chǎn)物，通過合成生物學(xué)手段可以異源合成生產(chǎn)周期短、高產(chǎn)類胡蘿卜素菌株。③開發(fā)新的、高安全性的類胡蘿卜素高產(chǎn)菌株。