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    珍珠繡線菊葉斑病菌生物學(xué)特性及藥劑敏感性試驗

    2022-08-05 06:29:42王睿寧劉吉王祿鑫王天奕范文忠
    農(nóng)業(yè)與技術(shù) 2022年14期
    關(guān)鍵詞:繡線菊葉斑病氮源

    王睿寧劉吉王祿鑫王天奕范文忠

    (1.吉林非常道農(nóng)業(yè)技術(shù)有限公司,吉林 長春 130000;2.吉林省雅酷園藝工程集團有限公司,吉林 長春 130115;3.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,吉林 吉林 132101)

    引言

    珍珠繡線菊(Spiraea thunbergii Bl.)為薔薇科繡線菊屬,株高約1.5m的小灌木,分布日本、山東、陜西、遼寧、吉林等地,因其花期早、花朵密集,喜光、耐寒等特性,常被用作園林綠化林木,珍珠繡線菊作為生活小區(qū)的綠化植物,在吉林省大面積種植。近年來,在春季發(fā)現(xiàn)珍珠繡線菊葉斑病危害較重,受害葉片初期出現(xiàn)褪綠斑點,病斑邊緣有暈圈,中后期不規(guī)則形的暗褐色病斑,病斑多為1.0~3.0mm×1.5~2.0mm,極少數(shù)病斑在后期開裂,病斑多為單個危害,不融合。通過分子生物學(xué)技術(shù)及形態(tài)學(xué)鑒定確定該病害病原為鏈格孢屬(Alternaria ochroleuca),確定為珍珠繡線菊鏈格孢葉斑病。通過對珍珠繡線菊葉斑病菌生物學(xué)特性以及藥劑敏感性研究,為防治奠定基礎(chǔ),同時提供理論依據(jù)[1-3]。

    1 材料和方法

    1.1 供試材料

    珍珠繡線菊葉斑病病菌菌種(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院植物病理實驗室)。

    供試碳源:L-阿拉伯糖(L-Arabinose)、L-蘇糖(L-Threose)、甘露糖(Mannose)、葡萄糖(Glucose)、果糖(Fructose)、麥芽糖(maltose);供試氮源:硫酸銨((NH4)2SO4)、硝酸銨(NH4NO3)、氯化銨(NH4CL)、硝酸鉀(KNO3)、硝酸鈣(Ca(NO3)2)、尿素(CON2H4);NaOH溶液、HCl溶液、75%酒精等。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 菌種的分離與鑒定

    在無菌條件下制作PDA培養(yǎng)基若干,采用組織分離法進行分離、純化病原菌。按照柯赫氏法則將獲得的病原回接至植株上,并獲得相近的病斑,然后再分離病原物,得到菌落均一穩(wěn)定的病原物,將病原菌送檢,根據(jù)DNA序列及病原形態(tài),鑒定病原物的分類[4-7]。對病原菌rDNA ITS片段的PCR進行擴增和序列測定[8-10],所有的擴增產(chǎn)物保存于4℃冰箱中,交由上海生工生物工程有限公司進行序列測定,確定病原分類地位。

    1.2.2 病原菌生物學(xué)特性研究

    1.2.2.1 不同溫度對菌落生長的影響

    以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,在126℃滅菌30min后取出,制作PDA培養(yǎng)基平板。無菌操作,打取直徑5mm菌餅,移入PDA培養(yǎng)基平板中央處。設(shè)5~35℃,設(shè)置為7個不同溫度恒溫培養(yǎng),7個處理,重復(fù)4次,培養(yǎng)5d,十字交叉法測量菌落直徑[11-13]。

    1.2.2.2 不同光照對菌絲生長的影響

    設(shè)24h黑暗、24h光照、12h∶12h=黑暗∶光照;3個處理,4次重復(fù)。方法同上,測量菌落直徑。

    1.2.2.3 不同碳源對菌絲生長的影響

    以馬鈴薯半組合培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基;分別用等量碳源進行置換,碳源為L-阿拉伯糖(L-Arabinose)、L-蘇糖(L-Threose)、甘露糖(Mannose)、葡萄糖(Glucose)、果糖(Fructose)、麥芽糖(maltose),打取菌餅置于培養(yǎng)基中央,恒溫20℃培養(yǎng)5d,十字交叉法測量菌落的直徑。

    1.2.2.4 不同氮源對菌絲生長的影響

    以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,用不同的氮源:硫酸銨((NH4)2SO4)、硝酸銨(NH4NO3)、氯化銨(NH4CL)、硝酸鉀(KNO3)、硝酸鈣(Ca(NO3)2)、尿素(CON2H4)取代等量的硝酸鈉,氮含量折算按3g·L-1進行計算,試驗共設(shè)氮源6個處理,重復(fù)4次;試驗方法同上。

    1.2.2.5 不同酸堿度對菌絲生長的影響

    無菌條件下制作PDA培養(yǎng)基,調(diào)節(jié)pH值為5、6、7、8、9、10;6個處理,4次重復(fù),試驗及測量方法同上。

    1.2.2.6 不同溫度對孢子萌發(fā)的影響

    配制2%麥芽糖孢子懸浮液,采用玻片萌發(fā)法,設(shè)5~35℃,不同溫度設(shè)置7個處理,重復(fù)4次,恒溫培養(yǎng),每1h鏡檢1次孢子萌發(fā)率,連續(xù)3次至孢子不再萌發(fā)為止。

    1.2.2.7 光照對孢子萌發(fā)的影響

    設(shè)24h黑暗、24h光照、12h∶12h=黑暗∶光照;3個處理,4次重復(fù)。采用玻片萌發(fā)法,25℃恒溫暗培養(yǎng),測定孢子萌發(fā)率,方法同上。

    1.2.2.8 不同碳源對孢子萌發(fā)的影響

    配制2%以L-阿拉伯糖(L-Arabinose)、L-蘇糖(L-Threose)、甘露糖(Mannose)、葡萄糖(Glucose)、果糖(Fructose)、麥芽糖(maltose)碳源孢子懸浮液,6個處理,4次重復(fù),采用玻片萌發(fā)法,25℃恒溫暗培養(yǎng),測定孢子萌發(fā)率,方法同上。

    1.2.2.9 不同氮源對孢子萌發(fā)的影響

    選擇不同的氮源,氮含量折算按3g·L-1進行計算,配制硫酸銨((NH4)2SO4)、硝酸銨(NH4NO3)、氯化銨(NH4CL)、硝酸鉀(KNO3)、硝酸鈣(Ca(NO3)2)、尿素(CON2H4)不同的氮源孢子懸浮液,6個處理,4次重復(fù),采用玻片萌發(fā)法,25℃恒溫暗培養(yǎng),測定孢子發(fā)率,方法同上。

    1.2.2.10 不同的酸堿度對孢子萌發(fā)的影響

    調(diào)節(jié)pH值,設(shè)pH值為5、6、7、8、9、10,配制不同酸堿度的麥芽糖孢子懸浮液,6個處理,4次重復(fù),采用玻片萌發(fā)法,20℃恒溫暗培養(yǎng),測定孢子發(fā)率,方法同上。

    1.2.3 不同藥劑對珍珠繡線菊葉斑病菌敏感性試驗

    選取啶氧菌酯、肟菌酯、氟環(huán)唑、丙環(huán)唑、吡唑醚菌酯、代森錳鋅、苯醚甲環(huán)唑、抑霉唑、醚菌酯、百菌清等10種殺菌劑原藥,每種藥劑用適量的助劑溶解,配制5~7個不同濃度的含藥培養(yǎng)基,重復(fù)4次,以清水為對照。

    采用菌絲生長速率法,打取直徑5mm菌餅,移入PDA培養(yǎng)基平板中央處。設(shè)20℃恒溫培養(yǎng)5d,用十字交叉法測量菌落直徑[14,15]。參照Wadley法,測定供試殺菌劑原藥有效成分對菌絲的抑制率。利用最小二乘法建立“質(zhì)量濃度對數(shù)-幾率值”直線方程,用DPS7.05分析軟件求出各藥劑的毒力回歸方程和EC50。

    抑制率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100

    毒力指數(shù)(TI)=對照藥劑EC50/處理藥劑EC50×100

    2 結(jié)果與分析

    2.1 珍珠繡線菊葉斑病癥狀描述

    珍珠繡線菊葉斑病危害較重,受害葉片初期出現(xiàn)褪綠斑點,病斑邊緣有暈圈,中后期形成不規(guī)則暗褐色病斑,病斑多為1.0~3.0mm×1.5~2.0mm,極少數(shù)病斑在后期開裂,病斑單一,多為單個危害,病斑不融合。

    圖1 珍珠繡線菊葉斑病危害癥狀

    2.2 珍珠繡線菊葉斑病病原菌形態(tài)及鑒定

    采集典型的病葉,利用組織分離法分離3種菌株,按照柯赫氏法則,接種病原菌于30個微傷葉片,獲取發(fā)病葉,對照不發(fā)病,對病葉再次分離純化后,獲得1種病原菌,所得病原菌落形態(tài)及孢子形態(tài)與最初分離的一致,另2個菌株未發(fā)病。病原菌落為圓形,初期顏色為灰白色,中后期灰色,菌絲稠密,氣生菌絲生長旺盛。通過分子生物學(xué)技術(shù)及形態(tài)學(xué)鑒定,確定病原為鏈格孢屬(Alternaria ochroleuca)。寄主為珍珠繡線菊(Spiraea thunbergii Bl.)。

    圖2 分離的菌落形態(tài)及孢子形態(tài)

    2.3 生物學(xué)特性研究

    2.3.1 不同碳源對菌絲生長及孢子萌發(fā)的影響

    表1 不同碳源對菌絲生長及孢子萌發(fā)影響

    由方差分析可知,適合菌絲生長、孢子萌發(fā)的碳源為麥芽糖。

    2.3.2 不同氮源對菌絲生長及孢子萌發(fā)的影響

    表2 不同氮源對菌絲生長及孢子萌發(fā)影響

    由方差分析可知,適合菌絲生長的氮源為硝酸銨;適宜孢子萌發(fā)的氮源為硫酸銨。

    2.3.3 不同酸堿度對菌絲生長及孢子萌發(fā)的影響

    表3 不同pH值對菌絲生長及孢子萌發(fā)影響

    由方差分析可知,pH為7時更適合菌絲生長、孢子萌發(fā)。

    2.3.4 不同溫度對菌絲生長及孢子萌發(fā)的影響

    由表4可知,15℃更適合菌絲生長,20~25℃更適合孢子萌發(fā)。

    表4 不同溫度對菌絲生長及孢子萌發(fā)影響

    2.3.5 不同光照對菌絲生長及孢子萌發(fā)的影響

    由表5可知,病菌在全黑暗、全光照以及黑暗與光照交替條件下均能生長,12h∶12h=黑暗∶光照更適合菌絲生長、孢子萌發(fā)。

    表5 不同光照對菌絲生長及孢子萌發(fā)影響

    2.4 不同殺菌劑對珍珠繡線菊葉斑病的毒力

    由表6可知,病菌對殺菌劑氟環(huán)唑、丙環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑敏感性最高,EC50值小于10mg·L-1;其次為肟菌酯,敏感性也較高,EC50值小于10.82mg·L-1;氟環(huán)唑、丙環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑、肟菌酯毒力指數(shù)較高,可以有效抑制葉斑病菌的生長。

    表6 不同殺菌劑對珍珠繡線菊葉斑病毒力

    在生產(chǎn)中,可以優(yōu)先選用氟環(huán)唑等三唑類藥劑、肟菌酯等甲氧基丙烯酸酯類類殺菌劑,在發(fā)病初期交替使用,可以控制珍珠繡線菊葉斑病的發(fā)生。

    3 討論與結(jié)論

    3.1 結(jié)論

    珍珠繡線菊葉斑病主要危害珍珠繡線菊,受害葉片初期出現(xiàn)褪綠斑點,病斑邊緣有暈圈,中后期呈不規(guī)則暗褐色病斑,病斑多為1.0~3.0mm×1.5~2.0mm,極少數(shù)病斑在后期開裂,病斑單一,多為單個危害,病斑不融合。通過珍珠繡線菊葉斑病病原菌形態(tài)及分子生物學(xué)鑒定,確定珍珠繡線菊葉斑病病原為鏈格孢屬(Alternariaochroleuca),明確了分類地位。通過生物學(xué)特性研究表明,適合菌絲生長、孢子萌發(fā)的碳源為麥芽糖;適合菌絲生長的氮源為硝酸銨;適宜孢子萌發(fā)的氮源為硫酸銨;pH為7更適合菌絲生長、孢子萌發(fā);15℃更適合菌絲生長,20~25℃更適合孢子萌發(fā);12h∶12h=黑暗∶光照更適合菌絲生長、孢子萌發(fā)。室內(nèi)毒力測定結(jié)果表明,對病菌敏感的殺菌劑為氟環(huán)唑、丙環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑、肟菌酯,可以有效抑制珍珠繡線菊葉斑病菌的生長。

    3.2 討論

    本文研究了10種殺菌劑對珍珠繡線菊葉斑病菌的敏感性,為有效控制病害的發(fā)生提供了理論依據(jù);對于藥劑的田間使用及防治效果,還需要進一步進行試驗,對于不同種類殺菌劑交替使用及混合使用的聯(lián)合毒力等,需要進一步研究與探索。

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