安全、便捷技術(shù)再生一次性醫(yī)用口罩的實(shí)驗(yàn)研究

宋武慧，潘濱，闞海東，徐燕意，易志剛

1. 復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教育部、衛(wèi)健委、醫(yī)科院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室； 2. 復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室，上海 200032

2019年12月在我國武漢出現(xiàn)的不明原因肺炎由新型冠狀病毒(2019 novel coronavirus, 2019-nCoV)感染所致[1-4]。隨后，2019-nCoV蔓延至全國，截至2020年2月9日，已導(dǎo)致 37 289 人感染，死亡人數(shù)達(dá)813人。2019-nCoV主要經(jīng)呼吸道和接觸傳播，以聚集性傳播尤為嚴(yán)重。呼吸道防護(hù)是防控該疾病的關(guān)鍵之一，可減少二次傳播的概率。由于疫情持續(xù)蔓延，口罩等個(gè)人防護(hù)用品短缺現(xiàn)象嚴(yán)重。目前，流傳許多口罩再生方法，但大多缺乏科研數(shù)據(jù)，未曾證明滅活病毒的效果，以及滅活病毒處理后對口罩濾過功能的影響。

流行性感冒(簡稱流感)病毒與2019-nCoV均為有包膜病毒，理化性質(zhì)相似，且均主要經(jīng)呼吸道傳播。本研究以普通一次性醫(yī)用口罩為例，用流感病毒作為模型病毒，模擬2019-nCoV污染，采用常用的恒溫烘箱干烤和電吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)處理2種方法，對表面污染有流感病毒的一次性醫(yī)用口罩進(jìn)行處理，檢測熱處理對病毒的滅活效果及口罩濾過截留PM2.5效果的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

一次性醫(yī)用外科口罩(ASTM F2100，等同于YY0469-2011)[5]。某品牌家用電吹風(fēng)機(jī)(50 Hz, 1 400 W)。流感病毒H1N1 A/PR8/34 毒株從美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC? VR-95TM)引進(jìn)；Mardin-Darby狗腎細(xì)胞(Mardin-Darby canine kidney cell，MDCK細(xì)胞)購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，培養(yǎng)基為含5% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(購自Gibco公司)。TPCK-胰酶購自Sigma公司，病毒采樣管購自友康生物科技有限公司。QIAamp Viral RNA抽提試劑盒購自Qiagen公司(貨號：52904)。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time fluorescence quantitative polymerasechain reaction, 實(shí)時(shí)熒光qRT-PCR)采用One Step PrimeScript RT-PCR 試劑盒(TAKARA公司，RR064A)。

1.2 病毒滅活

恒溫烘箱干熱處理：流感病毒濃縮液3.6×107pfu/ml，分別取10 μL滴加于口罩防水層(藍(lán)色)表面3個(gè)不同位置(病毒操作在生物安全柜中進(jìn)行)，滴加病毒的口罩置于錫箔紙上，然后放入鋁質(zhì)飯盒，加蓋后放入恒溫烘箱56 ℃、30 min干熱處理。

電吹風(fēng)熱風(fēng)處理：將滴加有病毒的口罩用保鮮袋包裹，然后在生物安全柜中用電吹風(fēng)機(jī)(最大檔)在口罩上方10～20 cm處進(jìn)行熱風(fēng)處理。

1.3 病毒洗脫及感染

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)將0.25 mL MDCK細(xì)胞(4×105細(xì)胞/mL)鋪板于48孔板中培養(yǎng)。

1.3.2 病毒感染經(jīng)上述熱處理后的口罩，可見病毒滴液斑痕，利用250 μL病毒采樣管中的病毒保存液沖吸數(shù)次，洗脫病毒至病毒滴液斑痕消失。取125 μL洗脫的病毒懸液并添加5 μg/mL TPCK-胰酶，接種于細(xì)胞中，37 ℃下病毒吸附1 h；然后吸取病毒懸液，用1 mL DMEM培養(yǎng)液洗滌2遍，加入新鮮的1 μg/mL TPCK-胰酶的DMEM培養(yǎng)液。感染2 d后，觀察細(xì)胞病變，并收集細(xì)胞上清液。

1.4 實(shí)時(shí)熒光qRT-PCR檢測病毒RNA

收集140 μL感染細(xì)胞的上清液，用QIAamp Viral RNA抽提試劑盒抽提RNA(根據(jù)試劑盒說明書操作)。50 μL無RNase的H2O洗脫。取2 μL RNA標(biāo)本，使用One Step PrimeScript RT-PCR試劑盒，利用引物Yi-js-O-97、Yi-js-O-98及FAM標(biāo)記的TaqMan熒光探針Yi-js-P-1進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光qRT-PCR。PCR體系如下：12.5 μL的 2×one step RT-PCR緩沖液、0.5 μL的Ex Taq HS、0.5 μL的RT Enzyme、7.0 μL的H2O、0.8 μL的Yi-js-O-97 (10 μmol/L, 終濃度400 nmol/L)、0.8 μL的Yi-js-O-98 (10 μmol/L,終濃度400 nmol/L)、0.4 μL的Yi-js-P-1熒光探針 (10 μmol/L，終濃度200 nmol/L)及2.0 μL RNA樣品。反應(yīng)程序如下：42 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min(同時(shí)收集熒光信號)，共 40個(gè)循環(huán)。樣本中病毒RNA的相對拷貝數(shù)以2-ΔCt方法進(jìn)行處理，比值由2-(處理組Ct-未處理組Ct)公式計(jì)算得出。各處理方法相對于未處理感染病毒組為對照。

1.5 口罩濾過截留效率的評價(jià)

采用抽濾瓶(蜀牛，GG-17)和PM2.5監(jiān)測儀(TSI，AM510)，評估一次性普通醫(yī)用口罩的烘干處理對其PM2.5濾過截留效果的影響。將口罩分為4組：①潔凈組(未使用過的口罩)；②未處理組(口罩正常使用4 h后未作任何處理)；③烘箱處理組(烘箱內(nèi)56 ℃、30 min干熱處理)；④吹風(fēng)機(jī)處理組。將口罩(N=3個(gè)/組)嚴(yán)密束縛在抽濾瓶瓶口，使用AM510粉塵儀同時(shí)檢測口罩正上方和抽濾瓶上嘴出口處的PM2.5濃度，抽濾時(shí)間為4 h。每隔30 min記錄PM2.5濃度數(shù)據(jù)，每次重復(fù)檢測3次。

2 結(jié)果

2.1 口罩表面的病毒滅活

將一次性醫(yī)用外科口罩置于錫箔紙上，在口罩藍(lán)色的防水層表面3個(gè)不同位置滴加流行性感冒病毒A/PR8懸液(圖1A)，每個(gè)位點(diǎn)滴加10 μL(含3.6×105pfu 病毒 )?？谡直砻娴牟《緦⒉捎孟率?種方法處理(每種方法3個(gè)口罩)。①用普通烘箱干烤：將滴加病毒的口罩(下墊錫箔紙)，放入鋁盒，加蓋后放入普通烘箱，56 ℃ 30 min干熱處理(56 ℃、30 min通常為滅活血清等標(biāo)本中病毒的條件)，見圖1A。干熱處理后，口罩表面可見病毒懸液斑痕，由于口罩表面的疏水性，待病毒洗脫后，病毒懸液斑痕溶于洗脫液，〔斑痕消失(圖1A)，口罩表面的疏水性無明顯改變(圖1A，向下箭頭所指)〕。②用家常用電吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)處理：將滴加有病毒的口罩用保鮮袋包裹，在口罩上方10～20 cm處電吹風(fēng)機(jī)加熱吹風(fēng)(最大檔)，電吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)處理1 min 30 s 后，風(fēng)口溫度可升至70 ℃，并持續(xù)維持在該溫度)，熱風(fēng)處理共30 min?？谡窒扔帽ｕr袋包裹是因?yàn)榭谡直砻媸杷詮?qiáng)，不便于熱風(fēng)處理。為防止吹風(fēng)將沾染的病原體散布，可將10 μL病毒懸液(含3.6×105pfu病毒 )滴加于口罩的褶皺層中，用保鮮袋包裹，然后加熱吹風(fēng)(圖1B)。30min熱風(fēng)處理后，洗脫滴加于口罩的病毒，發(fā)現(xiàn)電吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)處理不影響口罩表面的疏水性(圖1B，向右箭頭所指)。

A. The left, virus drops was doted onto the surface of medical mask before baking; The Right, after baking, the traces of virus drops was visible and disappeared after virus rescue. B. The left, virus drops was doted onto between the kink marks of mask; The Right, the mask was wrapped with a food storage bag and then heat treated with hair dryer by moving around over the surface of the wrapped mask vertically at a distance of about 10～20 cm. The virus was rescued as described above.

圖1 口罩的病毒滅活實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

Fig.1 Design of the heat inactivation of medical mask

2.2 電吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)處理滅活病毒的效果優(yōu)于烘箱干烤

將滴加于口罩上并經(jīng)滅活方法處理的流感病毒A/PR8洗脫后感染MDCK細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變及測定細(xì)胞上清液中的病毒基因組拷貝數(shù)，分別評價(jià)烘箱干烤和電吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)處理滅活病毒的效果。未經(jīng)滅活處理組的病毒洗脫液接種至MDCK細(xì)胞后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變；但經(jīng)烘箱干烤和電吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)處理，洗脫液接種的細(xì)胞均未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變(圖2A)。

收集感染細(xì)胞上清液，提取RNA，利用實(shí)時(shí)熒光qRT-PCR檢測病毒基因組拷貝數(shù)。電吹風(fēng)機(jī)30 min熱風(fēng)處理組的感染細(xì)胞上清液中病毒拷貝數(shù)降低至原來的1/1 000 000～1/10 000 000，接近未感染組水平。然而，烘箱干熱處理組感染細(xì)胞上清液中的病毒拷貝數(shù)降低至原來的1/10～1/100，但仍高于未感染組 (圖2B)，提示病毒未被充分滅活。

A.CPE of infected MDCK cells. B. Relative RNA copies of IVA RNA.

圖2 病毒滅活效果評價(jià)

Fig.2 Infectivity of the rescued virus after hair dryer treatment

2.3 熱處理后口罩濾過截留效率不變

為探討經(jīng)烘箱干烤和電吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)處理對口罩的濾過截留效率的影響，進(jìn)一步檢測了處理后的口罩濾過截留PM2.5的效果(圖3A)。將口罩分為4組：①潔凈組(未使用的口罩)； ②未處理組(口罩正常使用4h后未作任何處理)；③烘箱干熱處理組(烘箱內(nèi)56 ℃、30 min干熱處理)；④吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)處理組。將口罩(N=3個(gè)/組)嚴(yán)密束縛在抽濾瓶瓶口，使用AM510粉塵儀同時(shí)檢測口罩正上方和抽濾瓶上嘴出口處的PM2.5濃度，抽濾時(shí)間為4 h，每隔30 min記錄PM2.5濃度數(shù)據(jù)。

從圖3B中可見，4組口罩的PM2.5濾過截留效果隨抽濾時(shí)間的改變而有所變化，但其改變均不顯著。其中，潔凈口罩的PM2.5濾過截留效率隨抽濾時(shí)間的增長而略微降低；電吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)處理已使用的口罩PM2.5濾過截留效率隨抽濾時(shí)間的增長略有提升，但不顯著；另外2組(未處理組和烘箱干烤處理組)PM2.5濾過效率在4 h的抽濾過程中略有波動, 但基本保持穩(wěn)定。如圖3C所示，4 h內(nèi)口罩的平均PM2.5濾過效率表明，使用前、后的口罩濾過截留PM2.5的效率基本無變化，而烘箱干熱或電吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)處理后的口罩PM2.5濾過截留效率也基本無改變，整體維持在85%左右。結(jié)果提示，烘箱或電吹風(fēng)機(jī)熱處理基本不會影響普通一次性醫(yī)用口罩濾過截留大氣細(xì)顆粒物的效率。

A. Experiment set up. B. PM2.5 filtration rate change during the 4-hour suction process. C. Average PM2.5 filtration rate within the suction process.

圖3 口罩濾過截留效果評價(jià)

Fig.3 PM2.5 filterability of medical masks after heart treatment

3 討論

個(gè)人防護(hù)用品在滅活其表面潛在的病毒后再生利用可以節(jié)省資源，減少二次傳播。2006年我國臺灣地區(qū)行政院勞工安全衛(wèi)生研究所曾對N95等幾種口罩的重復(fù)利用做過報(bào)道，認(rèn)為70 ℃ 30 min干熱及250 nm 紫外線照射可殺滅大腸埃希菌而不損壞口罩本身，其可被重復(fù)利用(https://labor-elearning.mol.gov.tw/co_report_detail.php?rid=115)。報(bào)道發(fā)現(xiàn)，有機(jī)溶劑，如酒精、濕熱等均會損傷濾膜，不宜使用。最近，北京大學(xué)報(bào)道了用微波爐處理再生口罩的實(shí)驗(yàn)(https://www.sohu.com/a/370944754_803988)，但考慮到有些口罩含有金屬條，處理前需先去除口罩的金屬絲，處理后再將金屬絲復(fù)位。此外，各種報(bào)道的口罩再生方法是否影響濾過截留功能以及對病毒的滅活效果有待實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

再生一次性醫(yī)用口罩的方法還需考慮以下方面的因素：既不能影響過濾效率，還必須去除其可能沾染的病原體，且盡可能方便操作。醫(yī)用外科口罩由3部分組成，從外到內(nèi)分別由藍(lán)色的防水層、中間的過濾層及白色的無紡布舒適層。為評價(jià)口罩經(jīng)熱處理對其過濾效率的影響，首先，我們測試了處理前、后口罩對PM2.5的濾過截留效果。由于醫(yī)用外科口罩并不能阻擋納米級的病毒，采用了PM2.5的濾過截留效果作為參考。結(jié)果未觀察到熱處理對口罩PM2.5濾過截留效果產(chǎn)生影響。由于用過的醫(yī)用外科口罩上可能沾有病原體，為了模擬2019-nCoV，我們依據(jù)流感病毒與其都有包膜等相似理化性質(zhì)，以污染有流感病毒的醫(yī)用外科口罩作為模型，用常用的熱滅活方式(烘箱內(nèi)56 ℃、30 min干熱處理和比較有普及性及簡便的家用電吹風(fēng)機(jī)30 min熱風(fēng)處理)，評價(jià)2種熱處理對病毒的滅活效果。結(jié)果顯示, 電吹風(fēng)機(jī)30 min熱風(fēng)處理后病毒拷貝數(shù)降低至原來的 1/1 000 000～1/10 000 000，接近未感染水平。由于本研究中使用了高劑量的病毒懸液，電吹風(fēng)機(jī)30 min熱風(fēng)處理后仍然檢測到病毒RNA，可能為感染后未完全洗滌干凈的病毒殘留(我們認(rèn)為病毒已全部滅活)。但烘箱56 ℃ 30 min干熱處理僅降低病毒拷貝數(shù)至原來的1/10～1/100，顯示未能完全滅活病毒 (圖2B)。處于生物安全考慮，我們進(jìn)行烘箱干熱處理時(shí)，口罩置于封閉鋁質(zhì)飯盒內(nèi)，可能會影響飯盒內(nèi)口罩表面的實(shí)際溫度。適當(dāng)延長干烤時(shí)間可能有更好的效果，或口罩如直接放置于烘箱內(nèi)可能效果更佳。因此提示，用干熱滅活病原體時(shí)需要考慮熱滅活的穿透性能。

為解決當(dāng)前普通醫(yī)用口罩短缺的問題，課題組通過濾過截留及病毒滅活實(shí)驗(yàn)，檢驗(yàn)了用熱處理進(jìn)行普通醫(yī)用口罩的再生利用，將用過的口罩用保鮮袋包裹( 防止吹風(fēng)將沾染的病原體散布)，用家用簡便電吹風(fēng)機(jī)30 min熱風(fēng)處理即可安全、有效地再生醫(yī)用外科口罩。目前我們尚未測試一次性醫(yī)用外科口罩最多可再生幾次，有關(guān)研究正在進(jìn)行中。

然而，值得指出的是：在口罩匱乏的非常時(shí)期，普通人群可采用該簡便技術(shù)再生口罩后再次使用，但該方法再生的口罩不適合密切接觸患者的人群、醫(yī)護(hù)人員及實(shí)驗(yàn)室工作人員使用。

致謝

感謝實(shí)驗(yàn)參與人員在短期內(nèi)完成上述工作，感謝聞玉梅院士給予的指導(dǎo)！