姜黃素和姜黃素聯(lián)氨基抗肝癌作用比較及機(jī)制研究

趙冀安 崔麗敏 董梁 聶文佳 劉文聰 李增寧

摘 要 目的：比較姜黃素（CUR）和其衍生物聯(lián)氨基姜黃素（HZC）的體內(nèi)外抗肝癌作用及機(jī)制。方法：采用MTT法檢測CUR或HZC（2.5、5、10、20、40、80 μmol/L）對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CUR或HZC（10、20、40 μmol/L）對HepG2細(xì)胞周期分布和凋亡情況的影響;采用Western blotting法檢測CUR或HZC（10、20、40 μmol/L）對HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。將雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組（n=10）、CUR對照組（n=10）、HZC對照組（n=10）、肝癌模型組（n=30）、CUR防護(hù)組（n=30）、HZC防護(hù)組（n=30）。CUR對照組和HZC對照組大鼠分別腹腔注射CUR或HZC（劑量均為80 mg/kg）;模型組、CUR防護(hù)組和HZC防護(hù)組大鼠均腹腔注射對二乙基亞硝胺（50 mg/kg）建立肝癌模型，同時2種藥物防護(hù)組大鼠分別腹腔注射CUR或HZC（劑量均為80 mg/kg），每周2次，連續(xù)給藥12周。給藥期間，記錄大鼠體質(zhì)量變化和死亡情況;24周后，計算大鼠肝臟指數(shù)并觀察其外觀，統(tǒng)計肝癌結(jié)節(jié)數(shù);采用蘇木精-伊紅染色法觀察大鼠肝組織病理學(xué)變化并計算肝癌細(xì)胞核分裂指數(shù);采用免疫組化法檢測大鼠肝組織增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）指數(shù)。結(jié)果：CUR和HZC均能顯著升高HepG2細(xì)胞的增殖抑制率、G0/G1期細(xì)胞周期百分比和凋亡率（P<0.05）;均能顯著降低細(xì)胞中磷酸化蛋白酪氨酸激酶2（p-JAK2）、磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（p-STAT3）、B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2）、Bcl-xl蛋白的表達(dá)水平，顯著升高Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、細(xì)胞色素C（Cyt-c）、胱天蛋白酶9（Caspase-9）、Caspase-3、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PAPR）蛋白的表達(dá)水平（P<0.05）;且HZC的上述作用均顯著強(qiáng)于CUR（P<0.05）。動物實驗結(jié)果顯示，3個對照組大鼠無死亡，未發(fā)生肝臟癌變，肝臟外觀和組織切片未見病理變化;體質(zhì)量及增量、肝臟指數(shù)、癌細(xì)胞核分裂指數(shù)、肝組織PCNA指數(shù)組間比較差異均均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與肝癌模型組比較，CUR防護(hù)組和HZC防護(hù)組大鼠的存活率均顯著升高，肝癌發(fā)生率和癌結(jié)節(jié)數(shù)均顯著降低（P<0.05）;體質(zhì)量及增量均顯著升高，肝臟指數(shù)、癌細(xì)胞核分裂指數(shù)、肝組織PCNA指數(shù)均顯著降低（P<0.05）;肝臟外觀和組織切片均有一定程度病變，可見癌灶伴局灶性壞死或伴大斑片狀壞死;但2種藥物防護(hù)組上述指標(biāo)的改善程度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：HZC能通過抑制JAK2/STAT3信號通路和調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)源性通路的活化，發(fā)揮抑制HepG2細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡的作用，且比CUR具有更強(qiáng)的體外抗肝癌活性;但與CUR比較，HZC對肝癌模型大鼠各項抗肝癌指標(biāo)的改善未見顯著差異。

關(guān)鍵詞 肝癌;姜黃素;聯(lián)氨基姜黃素;蛋白酪氨酸激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3信號通路;HepG2細(xì)胞;大鼠;核分裂指數(shù);增殖細(xì)胞核抗原指數(shù)

中圖分類號 R735.7;R979.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）22-2741-10

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.22.10

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To compare the anti-hepatocarcinoma effects of curcumin（CUR） and its derivative hydrazincurcumin（HZC）， and to explore the mechanism. METHODS： MTT assay was used to detect the effects of CUR or HZC （2.5， 5， 10， 20， 40， 80 μmol/L） on the proliferation of HepG2 cells. Flow cytometry was used to detect the effects of CUR or HZC （10， 20， 40? ? μmol/L） on cell cycle distribution and apoptosis of HepG2 cells. Western blotting assay was used to detect the effects of CUR or HZC （10， 20， 40 μmol/L） on the expression of apoptosis-related protein in HepG2 cells. The male SD rats were randomly divided into normal control group （n=10）， CUR control group （n=10）， HZC control group （n=10）， model group （n=30）， CUR protection group （n=30） and HZC protection group （n=30）. CUR control group and HZC control group were given CUR or HZC （80 mg/kg） intraperitoneally. Model group， CUR protection group and HZC protection group were given diethylnitrosamine （50 mg/kg）intraperitoneally to establish hepatocarcinoma model; at the same time， 2 protection groups were given CUR or HZC （80 mg/kg） intraperitoneally， twice a day， for consecutive 12 weeks. During medication， the change of body weight and death of rats were recorded. Twenty four weeks later， liver index of rats was calculated and appearance was observed; the number of cancer nodules was counted; HE staining was used to observe the pathological changes of liver tissue and calculate the nuclear division index of hepatocarcinoma; the proliferating cell nuclear antigen （PCNA） index was detected by immunohistochemistry. RESULTS： CUR and HZC could increase the inhibitory rate of HepG2 cells （P<0.05）， and increased the percentage at G0/G1 phase and apoptotic rate of HepG2 cells （P<0.05）. CUR and HZC could significantly decrease the protein expression of p-JAK2， p-STAT3， Bcl-2 and Bcl-xl， while increased the protein expression of Bax， Cyt-c， Caspase-9， Caspase-3 and PAPR （P<0.05）. Above effects of HZC were significantly better than those of CUR （P<0.05）. The results of animal experiment showed that there was no death， no liver canceration and no pathological changes in liver appearance and tissue section of the three control groups; there was no statistical significance in body weight and its increased weight， liver index， nuclear division index of carcinoma or PCNA index （P>0.05）. Compared with model group， survival rate of rats were increased significantly in CUR protection group and HZC protection group， while hepatocarcinoma incidence and the number of cancer nodules were decreased significantly （P<0.05）; body weight and its increased weight were increased significantly， while liver index， nuclear division index of carcinoma and PCNA index were decreased significantly （P<0.05）. There were some pathological changes in liver appearance and tissue section; cancerous lesions with focal necrosis or cancerous lesions with patchy necrosis were observed. There was no statistical significance in the improvement of above indexes in 2 protection groups （P>0.05）. CONCLUSIONS： HZC could inhibit the proliferation and induce apoptosis of HepG2 cells by inhibiting JAK2/STAT3 signaling pathway and regulating the activation of mitochondrial endogenous pathway， which shows stronger anti-hepatocarcinoma effect in vitro than CUR. On the other hand， there was no significant difference in the improvement of liver caner indexes in hepatic cancer model rats between HZC and CUR.

KEYWORDS? ?Hepatocarcinoma;Curcumin;Hydrazinocurcumin;JAK2/STAT3 signaling pathway; HepG2 cells; Rats; Nuclear division index; PCNA index

肝細(xì)胞癌（HCC）是世界上導(dǎo)致癌癥死亡性相關(guān)疾病的第三大主要原因，每年約有70萬新診斷病例，并有超過25萬例死亡[1]。在肝癌早期，可以通過手術(shù)切除、射頻消融（RFA）和經(jīng)導(dǎo)管動脈化療栓塞（TACE）等方法進(jìn)行治療，可能提供治愈的機(jī)會，但這只能在腫瘤病灶小、遠(yuǎn)離大血管且沒有轉(zhuǎn)移到肝外器官的特定患者中進(jìn)行[2]。過去常用的全身化療已被相關(guān)研究證實對肝癌患者的治療效果有限，且在臨床對照試驗中發(fā)現(xiàn)，其對正常細(xì)胞有害且容易使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性[3]。

大量體外研究證明，姜黃素（Curcumin，CUR）在許多肝癌細(xì)胞系中可以阻滯細(xì)胞周期，發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，并參與抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4]。雖然，CUR具有很好的抗癌活性且無明顯毒性，但臨床前和臨床研究均表明，其在生理學(xué)條件下不穩(wěn)定、生物利用度較差，故使得其在抗癌治療中的應(yīng)用受到了限制[5]。有研究指出，對CUR進(jìn)行結(jié)構(gòu)類似物的合成改造是解決其生物利用度差并保留或進(jìn)一步提高其藥效作用的一種方法[6]。聯(lián)氨基姜黃素（Hydrazinocurcumin，HZC）是CUR的吡唑類衍生物（兩者結(jié)構(gòu)式見圖1），與CUR相比，HZC具有更好的水溶性和穩(wěn)定性，且具有較高的細(xì)胞通透性、抗腫瘤活性、生物利用度以及良好的腸道通透性[7];其對多種腫瘤細(xì)胞系都具有毒性，尤其是對人肝癌HepG2細(xì)胞，在所有姜黃素類似物中，HZC的半數(shù)有效濃度最低[8];此外，HZC能更有效地抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（STAT3）磷酸化、下調(diào)STAT3蛋白表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖、集落形成、遷移和侵襲并誘導(dǎo)其凋亡[9]?；诖?，本研究通過考察HZC和CUR對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，以及對二乙基亞硝胺（DEN）誘導(dǎo)的大鼠肝腫瘤的抑制作用，比較兩者的體內(nèi)外抗肝癌作用，旨在為姜黃素類衍生物應(yīng)用于肝癌的臨床治療提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

SW-CJ-2F型超凈工作臺（上海蘇凈實業(yè)有限公司）;TC2323型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國SHELLAB 公司）;30RF型低溫高速離心機(jī)（德國Hettich公司）;TC20型細(xì)胞計數(shù)儀（美國Bio-Rad公司）;AE31倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)（德國Motic公司）;Accuri C6型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）;ELX800型酶標(biāo)儀（美國Bio Tek公司）;DYCZ-24DN型垂直電泳儀（北京市六一儀器廠）;BOX型成像分析系統(tǒng)（英國Syngene公司）;BS210S型電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 藥品和試劑

CUR原料藥（批號：78246，純度：99.5%）、DEN（批號：93861，純度：>99.0%）、DMEM培養(yǎng)基、MTT試劑均購自美國Sigma公司;HZC原料藥（河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院劉守信教授合成并鑒定，純度：>99.5%）;兔源增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）抗體、兔抗人磷酸化蛋白酪氨酸激酶2（p-JAK2）、磷酸化STAT3（p-STAT3）、B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2）、Bcl-xl、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、細(xì)胞色素C（Cyt-c）、胱天蛋白酶9（Caspase-9）、Caspase-3、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PAPR）、β-肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（美國Santa Cruz公司，批號：sc-71858、sc- 16566、sc-293059、sc-130307、sc-8392、sc-65532、sc- 33371、sc-81663、sc-65496、sc-74470、sc-8432、sc-2025）;胎牛血清（美國Gibco公司）;山羊血清（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）;BCA蛋白定量試劑盒（英國Abcam公司，批號：ab102536）;異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)素V/碘化丙啶（Annexin V/PI）細(xì)胞凋亡試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司）;蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）;ECL發(fā)光檢測試劑盒（美國Millipore公司）;二甲基亞砜（DMSO）等其余試劑均為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ靡?guī)格，水為蒸餾水。

1.3 細(xì)胞

人肝癌HepG2細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。

1.4 動物

健康清潔級SD大鼠120只，雄性，4周齡，體質(zhì)量100～110 g，由河北醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（冀）2018-003。大鼠在溫度23 ℃、相對濕度55%、12 h光/12 h暗循環(huán)、墊料干燥清潔的通風(fēng)室中飼養(yǎng)，籠具等均經(jīng)高壓滅菌處理后使用;所有大鼠均自由攝取市售顆粒大鼠飼料與清潔飲用水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實驗。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物溶液配制

將人肝癌HepG2細(xì)胞解凍、復(fù)蘇并接種至含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（以下細(xì)胞培養(yǎng)條件相同），約3 d傳代1次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗。HZC和CUR均以0.1%DMSO溶液為溶劑配制成適當(dāng)濃度的藥液，用于細(xì)胞試驗和動物實驗;DEN以水為溶劑配制成適當(dāng)濃度的藥液，用于動物實驗。

2.2 CUR和HZC對HepG2細(xì)胞增殖的影響考察

采用MTT法檢測。取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，按5×105個/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜。將細(xì)胞隨機(jī)分為不同濃度的CUR或HZC組以及對照組，每組設(shè)6個復(fù)孔。各給藥組分別加入不同濃度的CUR或HZC藥液（終濃度均為2.5、5、10、20、40、80 μmol/L，濃度根據(jù)前期預(yù)試驗結(jié)果設(shè)置），對照組加入磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4，下同），培養(yǎng)48 h。然后向各孔中加入5 mg/mL MTT試液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄各孔MTT試液，加入0.1%DMSO溶液100 ?L，振蕩10 min待充分溶解后，采用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定各孔光密度（OD）值，并計算細(xì)胞增殖抑制率：抑制率=（1-給藥組OD值/對照組OD值）×100%。以抑制率為縱坐標(biāo)、藥物濃度為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖抑制曲線，并采用SPSS 13.0軟件計算CUR和HZC的半數(shù)抑制濃度（IC50）。上述試驗重復(fù)3次。

2.3 CUR和HZC對HepG2細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響考察

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測。取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，常規(guī)消化后，按5×105個/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，將細(xì)胞隨機(jī)分為不同濃度的CUR組或HZC組以及對照組，每組設(shè)6個復(fù)孔。各給藥組分別加入相應(yīng)CUR或HZC藥液（終濃度均為10、20、40 μmol/L，濃度根據(jù)前期預(yù)試驗結(jié)果設(shè)置），對照組均加入PBS，培養(yǎng)48 h。收集、洗滌細(xì)胞，先后加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI染色試劑，混勻，在室溫下避光反應(yīng)15 min后，用流式細(xì)胞儀分別檢測細(xì)胞周期分布和凋亡情況。上述試驗重復(fù)3次。

2.4 CUR和HZC對HepG2細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

采用Western blotting法檢測。按“2.3”項下方法取HepG2細(xì)胞接種、培養(yǎng)，分為不同濃度的CUR組或HZC組以及對照組，每組設(shè)6個復(fù)孔。各給藥組分別加入相應(yīng)CUR或HZC藥液（終濃度均為10、20、40 μmol/L，濃度根據(jù)前期預(yù)試驗結(jié)果設(shè)置），對照組加入DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。在各孔中加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液冰浴裂解25 min，收集細(xì)胞，在4 ℃條件下以15 000 r/min離心25 min。取上清，采用BCA法進(jìn)行總蛋白定量。將蛋白變性處理后取適量，采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3、PAPR、β-actin抗體（稀釋度均為1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過夜;然后加入二抗（稀釋度為1 ∶ 500），室溫孵育2 h，以ECL發(fā)光檢測試劑顯色，在成像分析系統(tǒng)中采集圖像。以β-actin為內(nèi)參，采用Image J 5.0軟件分析目標(biāo)蛋白條帶的相對灰度值，用來表示相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平。上述試驗重復(fù)3次。

2.5 CUR和HZC對肝癌模型大鼠的抑瘤作用考察

2.5.1 分組與給藥 取大鼠120只，隨機(jī)分為正常對照組（CON組，n=10）、CUR對照組（CUR組，n=10）、HZC對照組（HZC組，n=10）、肝癌模型組（DEN組，n=30）、CUR防護(hù)組（DEN+CUR組，n=30）、HZC防護(hù)組（DEN+HZC組，n=30）。CON組大鼠腹腔注射生理鹽水0.5 mL;CUR組和HZC組大鼠分別腹腔注射CUR或HZC（劑量為80 mg/kg）藥液0.5 mL;DEN組、DEN+CUR組和DEN+HZC組大鼠均腹腔注射DEN（劑量為50 mg/kg）藥液0.5 mL，同時DEN+CUR組和DEN+HZC組大鼠分別腹腔注射CUR或HZC（劑量為80 mg/kg）藥液0.5 mL。生理鹽水、DEN、CUR和HZC均每周給藥2次（給藥間隔2～3 d），12周后停藥;劑量均根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果設(shè)置。

2.5.2 大鼠一般情況觀察及肝臟指數(shù)計算 實驗從給藥起到第24周末時結(jié)束。給藥期間觀察大鼠的飲食、活動及死亡情況，并記錄體質(zhì)量。所有大鼠按照《中國實驗動物學(xué)會學(xué)術(shù)道德規(guī)范實施細(xì)則》進(jìn)行麻醉和處死后，測定最終體質(zhì)量，并計算其與實驗開始時體質(zhì)量的差值作為體質(zhì)量增量;然后立即切除肝臟，測定肝質(zhì)量，并計算肝臟指數(shù)[肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量（g）/最終體質(zhì)量（g）×100%]來間接反映肝腫瘤的生長情況。如果發(fā)生大鼠死亡，則即刻進(jìn)行稱量、解剖，按實驗結(jié)束計算其體質(zhì)量增量、肝臟指數(shù)，并進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)檢測。

2.5.3 大鼠肝臟外觀及肝癌發(fā)生情況觀察 肉眼觀察大鼠肝臟大體形態(tài)、結(jié)節(jié)大小，判斷肝癌發(fā)生情況并計算其發(fā)生率（由于大鼠肝癌多為彌散性癌結(jié)節(jié)，故根據(jù)文獻(xiàn)規(guī)定以出現(xiàn)直徑>6 mm的結(jié)節(jié)判斷為發(fā)生肝癌[10]），同時對肝癌結(jié)節(jié)（直徑>6 mm）進(jìn)行計數(shù)。

2.5.4 大鼠肝組織病理學(xué)觀察及癌細(xì)胞分裂指數(shù)計算 將大鼠肝組織進(jìn)行常規(guī)固定，石蠟包埋，切片（4 μm），進(jìn)行HE染色，置于顯微鏡下觀察并尋找肝癌結(jié)節(jié)組織中癌細(xì)胞的核分裂象。隨機(jī)統(tǒng)計20個高倍視野（HPF，×400倍）中肝癌細(xì)胞核分裂總數(shù)，換算成平均每10個HPF的核分裂數(shù)（個/10 HPF），作為大鼠肝癌細(xì)胞核分裂指數(shù)。

2.5.4 大鼠肝組織PCNA指數(shù)測定 采用免疫組化法檢測。取大鼠肝組織石蠟切片，經(jīng)脫蠟、脫水，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性后，在0.01%枸櫞酸鹽緩沖液中進(jìn)行抗原熱修復(fù)。修復(fù)完畢后，滴加10%山羊血清封閉，再加入PCNA一抗（稀釋度為1 ∶ 50），4 ℃孵育過夜;加入二抗（稀釋度為1 ∶ 200），室溫下孵育1 h;然后進(jìn)行DAB顯色、蘇木精復(fù)染、脫水透明封片，置于顯微鏡下觀察并拍照。鏡下可見，肝癌組織的PCNA陽性染色呈棕黃色，定位于細(xì)胞核，呈現(xiàn)顆粒狀或彌散性分布。PCNA陽性表達(dá)強(qiáng)度由染色強(qiáng)度積分（陰性：0分;弱：1分;中：2分;強(qiáng)：3分）和陽性細(xì)胞百分比積分（0%：0分;≤25%：1分;>25%～50%：2分;>50%：3分）相加后表示，最高為6分;評分≥3分則表示細(xì)胞為PCNA表達(dá)陽性。在顯微鏡下對10個視野內(nèi)PCNA陽性表達(dá)細(xì)胞及所有腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，計算PCNA指數(shù)：PCNA指數(shù)=PCNA陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞總數(shù)×100%[11]。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以用率表示，采用卡方檢驗進(jìn)行組間比較;計量資料以x±s表示，若滿足正態(tài)分布且方差齊性則采用方差分析進(jìn)行組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 CUR和HZC對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用

經(jīng)不同濃度CUR（2.5～80 μmol/L）處理后，細(xì)胞增殖抑制率分別為（3.85±0.88）%、（6.59±0.39）%、（21.62±1.64）%、（44.36±2.27）%、（64.26±2.37）%、（83.34±2.43）%;經(jīng)相應(yīng)濃度HZC處理后，細(xì)胞增殖抑制率分別為（5.70±1.30）%、（18.28±1.25）%、（38.66±1.98）%、（57.81±2.32）%、（74.25±2.40）%、（90.78±3.45）%。結(jié)果表明，隨著CUR和HZC濃度的升高，其對細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，且呈濃度依賴趨勢，詳見圖2。經(jīng)計算，CUR和HZC的IC50值分別為（25.43±2.86）、（15.84±0.97）μmol/L。兩種藥物對細(xì)胞的抑制率和IC50比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明相同濃度的HZC比CUR對HepG2細(xì)胞具有更強(qiáng)的抑制作用。

3.2 CUR和HZC對HepG2細(xì)胞周期分布和凋亡的影響

與對照組比較，隨著藥物濃度的升高，各給藥組G0/G1期細(xì)胞百分比均顯著升高、S期和G2/M期細(xì)胞百分比均顯著降低（P<0.05），且相同藥物的不同濃度組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與相同濃度的CUR組比較，相應(yīng)HZC組G0/G1期細(xì)胞百分比均顯著升高、S期細(xì)胞百分比均顯著降低（P<0.05）。這表明，CUR和HZC均可將HepG2細(xì)胞阻滯在G0/G1期，并呈濃度依賴性，且HZC阻滯細(xì)胞周期的能力強(qiáng)于CUR。與對照組比較，隨著藥物濃度的升高，各給藥組細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P<0.05），且相同藥物的不同濃度組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與相同濃度的CUR組比較，相應(yīng)HZC組細(xì)胞的凋亡率顯著升高（P<0.05）。這表明，CUR和HZC均可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡，并呈濃度依賴性，且HZC誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用強(qiáng)于CUR。各組細(xì)胞周期分布和凋亡的流式細(xì)胞圖見圖3、圖4，細(xì)胞周期分布百分比和凋亡率測定結(jié)果見表1。

3.3 CUR和HZC對HepG2細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，各給藥組隨著藥物濃度的升高，細(xì)胞中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2、Bcl-xl蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），Bax、Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3、PAPR蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），且相同藥物不同濃度組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與相同濃度的CUR組比較，相應(yīng)HZC組細(xì)胞中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2、Bcl-xl蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），Bax、Cyt-c、Caspase-3、Caspase-9、PAPR蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）。各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖見圖5，蛋白表達(dá)水平的檢測結(jié)果見表2。

3.4 CUR與HZC對肝癌模型大鼠的抑瘤作用

3.4.1 大鼠一般情況 給藥期間，3個對照組大鼠進(jìn)食飲水均良好，體質(zhì)量正常增長，且實驗結(jié)束時其體質(zhì)量及增量、肝臟指數(shù)組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;DEN組、DEN+CUR組和DEN+HZC組大鼠飲水和進(jìn)食逐漸減少，體質(zhì)量及增量均顯著低于CON組（P<0.01），肝臟指數(shù)均顯著高于CON組（P<0.01）;與DEN組比較，DEN+CUR組和DEN+HZC組大鼠上述癥狀均明顯減輕，上述指標(biāo)均顯著改善（P<0.05或P<0.01）。實驗結(jié)束時，3個對照組大鼠均未見死亡;DEN組、DEN+CUR組和DEN+HZC組均有大鼠死亡，其中DEN組大鼠存活率最低（僅60%），顯著低于CON組（P<0.05）;與DEN組比較，DEN+CUR組和DEN+HZC組大鼠存活率顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與DEN+CUR組比較，DEN+HZC組大鼠存活率更高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠存活率、體質(zhì)量及增量、肝臟指數(shù)的檢測結(jié)果見表3。

3.4.2 大鼠肝臟外觀及肝癌發(fā)生情況 3個對照組大鼠肝臟外觀均正常，表面光滑，色澤紅潤，無增生結(jié)節(jié)或肝癌發(fā)生;DEN組大鼠肝臟邊緣不整齊，色暗或淡，表面散在大小不一的灰白色癌結(jié)節(jié)，有的癌結(jié)節(jié)呈結(jié)節(jié)型和（或）融合在一起的巨塊型，結(jié)節(jié)切面有壞死及出血，結(jié)節(jié)數(shù)顯著多于CON組（P<0.05）;DEN+CUR組和DEN+HZC組大鼠肝臟也可見白色癌結(jié)節(jié)，但與DEN組比較直徑較小且數(shù)量較少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;DEN+CUR組和DEN+HZC組癌結(jié)節(jié)數(shù)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠肝臟外觀見圖6。

3個對照組大鼠均無肝癌發(fā)生;DEN組大鼠肝癌發(fā)生率為100%，顯著高于CON組（P<0.01）;DEN+CUR組和DEN+HZC組大鼠肝癌發(fā)生率分別為36.7%和20.0%，均顯著低于DEN組（P<0.01）;與DEN+CUR組比較，DEN+HZC組大鼠肝癌發(fā)生率更低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠肝癌結(jié)節(jié)數(shù)和肝癌發(fā)生率的檢測結(jié)果見表4。

3.4.3 大鼠組織病理學(xué)改變及癌細(xì)胞核分裂象 CON組大鼠肝組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，無變性壞死，細(xì)胞核清晰;肝索周圍規(guī)整，且圍繞中央靜脈呈放射狀排列。CUR組大鼠肝組織雖具有正常的小葉組織，但可見中度至重度的肝竇和靜脈充血。HZC組大鼠肝組織可見中央靜脈和肝血竇輕到中度的充血。DEN組大鼠肝組織細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞核大而深染;肝小葉結(jié)構(gòu)嚴(yán)重紊亂，有大小不等的再生結(jié)節(jié);肝細(xì)胞變性，結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞呈多形性，核分裂象及胞質(zhì)內(nèi)分泌顆粒增多。DEN+CUR組大鼠肝組織可見與肝竇相鄰的無序細(xì)胞，但與DEN組比較可見癌灶局灶性壞死和較少的核分裂象。DEN+HZC組大鼠肝組織失去了正常的肝小葉組織，可見癌灶的大斑片狀壞死。與CON組比較，DEN組、DEN+CUR組和DEN+HZC組大鼠肝癌細(xì)胞的核分裂指數(shù)均顯著升高（P<0.01）;與DEN組比較，DEN+CUR組和DEN+HZC組大鼠肝癌細(xì)胞的核分裂指數(shù)均顯著降低（P<0.01）;與DEN+CUR組比較，DEN+HZC組大鼠肝癌細(xì)胞的核分裂指數(shù)雖有所降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠肝組織病理學(xué)顯微圖見圖7，肝癌細(xì)胞核分裂指數(shù)的檢測結(jié)果見表5。

3.4.4 大鼠肝組織PCNA指數(shù) 3個對照組大鼠肝組織中沒有或極少出現(xiàn)PCNA陽性細(xì)胞;DEN組大鼠肝組織細(xì)胞呈明顯的PCNA陽性染色，核深染，提示細(xì)胞分裂和增殖旺盛;DEN+CUR組和DEN+HZC組大鼠肝組織PCNA陽性染色較DEN組顯著減少。與CON組比較，DEN組、DEN+CUR組和DEN+HZC組大鼠肝組織PCNA指數(shù)均顯著升高（P<0.01）;與DEN組比較，DEN+CUR組和DEN+HZC組大鼠肝組織PCNA指數(shù)均顯著降低（P<0.01）;與DEN+CUR組比較，DEN+HZC組肝組織PCNA指數(shù)雖有所降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠肝組織PCNA陽性染色顯微圖見圖8，PCNA指數(shù)的檢測結(jié)果見表5。

4 討論

肝癌是一種惡性程度很高的腫瘤，目前認(rèn)為其發(fā)生發(fā)展是多基因突變和多步驟演進(jìn)的過程，有眾多信號通路涉及其中[12]。CUR具有抗肝癌活性，但其在水中的溶解度和穩(wěn)定性差，實際用于肝癌治療的效果有限[13]。而CUR的吡唑類衍生物HZC具有高效價、高水溶性和遞送性的優(yōu)點[14]。已有研究發(fā)現(xiàn)，HZC可通過降低STAT3通路的一系列下游靶點的表達(dá)，在體外抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]?；谶@些發(fā)現(xiàn)，本研究通過體內(nèi)外實驗來進(jìn)一步對CUR和HZC的抗肝癌作用進(jìn)行比較。

本研究發(fā)現(xiàn)，CUR和HZC均可有效地抑制HepG2細(xì)胞的增殖，可使其阻滯于G0/G1期，并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，其作用呈濃度依賴性，且HZC的上述作用均顯著強(qiáng)于CUR。為了解其作用機(jī)制，本研究對細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白（p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3、PAPR）的表達(dá)變化進(jìn)行了檢測。眾所周知，JAK/STAT信號通路的失調(diào)可能導(dǎo)致免疫缺陷和癌癥發(fā)生，活化的JAK2/STAT3信號通路已被廣泛證實為治療人類腫瘤的新型分子靶標(biāo)[16]?；罨腏AK2/STAT3信號通路可以調(diào)節(jié)涉及各種生理功能的靶因子的表達(dá)，包括抗凋亡蛋白（如Bcl?xl、Bcl?2）、促凋亡蛋白（如Bax）和線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白（如Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3、PAPR）[17]。很多藥物對細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用是通過JAK2/STAT3信號通路和內(nèi)源性線粒體通路實現(xiàn)的[18]。內(nèi)源性線粒體通路是在Bcl-2家族（包括Bax和Bcl-2）的調(diào)節(jié)下在線粒體水平啟動的[19]。線粒體通過激活細(xì)胞死亡起始因子Caspase-9介導(dǎo)的凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活的Caspase-9切割執(zhí)行者Caspase-3使后者活化，活化的Caspase-3再裂解PARP（一種與程序性細(xì)胞死亡過程相關(guān)的核蛋白）使其活化[20]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)CUR和HZC作用后，細(xì)胞中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2和Bcl-xl蛋白的表達(dá)水平均顯著降低，Bax、Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3和PAPR蛋白的表達(dá)水平均升高，提示CUR和HZC的處理均可降低細(xì)胞JAK2和STAT3磷酸化水平，通過激活內(nèi)源性線粒體通路Caspase家族蛋白誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，促使Cyt?c釋放以及Caspase?9、Caspase?3、PARP活化，進(jìn)而使得Bcl-2、Bcl-xl的蛋白表達(dá)水平均顯著升高;而且，與相同濃度的CUR比較，HZC對上述蛋白表達(dá)的影響更顯著（差異均有統(tǒng)計學(xué)意義）。這些結(jié)果表明，HZC可通過抑制JAK2/STAT3信號通路介導(dǎo)的內(nèi)源性線粒體通路誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，發(fā)揮體外抗腫瘤作用，且作用強(qiáng)于CUR。

本研究進(jìn)一步通過動物實驗比較了CUR與HZC的抗腫瘤作用。DEN是一種強(qiáng)大的致癌物質(zhì)，已知可誘發(fā)包括人類在內(nèi)的所有動物物種的癌癥[21]。該化合物可以通過改變DNA結(jié)構(gòu)誘發(fā)肝癌，且其誘導(dǎo)大鼠肝臟細(xì)胞染色體突變形成肝癌的過程與人肝癌的發(fā)生過程相似[10]。HZC是一種新型的CUR衍生物，先前已被證明具有在納米摩爾濃度（IC50=520 nmol/L）下抑制牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖而不引起細(xì)胞毒性的潛力[13]。Arif M等[22]研究發(fā)現(xiàn)，HZC減緩口腔癌裸鼠腫瘤生長的作用是由于其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡所致。本研究以DEN誘導(dǎo)建立大鼠肝癌模型，并比較了CUR和HZC的體內(nèi)毒性和抗肝癌活性。結(jié)果顯示，兩者在大鼠體內(nèi)幾乎沒有毒性;且給予CUR和HZC治療后大鼠體質(zhì)量及增量和存活率均較DEN組顯著升高，肝臟指數(shù)、肝癌發(fā)生率和肝臟癌結(jié)節(jié)數(shù)均顯著降低，組織病理學(xué)變化明顯減輕，表明兩者均有抗肝癌的作用;HZC的上述作用雖比CUR更強(qiáng)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

細(xì)胞核分裂象在腫瘤病理診斷中的作用十分重要，核分裂指數(shù)能夠用于區(qū)別腫瘤良惡性、鑒別瘤樣病變與惡性腫瘤、評估腫瘤惡性程度和患者預(yù)后等[23]。此外，PCNA作為反映細(xì)胞增殖狀態(tài)和惡性程度的指標(biāo)，一般認(rèn)為其指數(shù)值越高，則腫瘤細(xì)胞的增殖能力越活躍、分化程度越低、惡性程度越高、越容易發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移[24]。已有研究證實，PCNA在肝癌細(xì)胞核中的表達(dá)明顯增強(qiáng)[25]，故PCNA表達(dá)的顯著增強(qiáng)表明肝組織細(xì)胞的異常增殖。本研究結(jié)果顯示，DEN+CUR組和DEN+HZC組的肝癌細(xì)胞核分裂指數(shù)和PCNA指數(shù)均較DEN組顯著降低，其中DEN+HZC組上述指標(biāo)的下降程度雖較DEN+CUR組更明顯，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這表明，CUR和HZC干預(yù)均能減弱肝癌模型大鼠癌細(xì)胞的增殖及其惡性程度，但兩者未表現(xiàn)出顯著差異。

綜上所述，與CUR比較，HZC在抑制HepG2細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡、抑制JAK2/STAT3信號通路和調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)源性通路活化方面具有更強(qiáng)的作用，其體外抗肝癌活性顯著更優(yōu);但在肝癌模型大鼠體內(nèi)，與CUR比較，HZC對各項肝癌指標(biāo)的改善作用雖更明顯，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。對此，筆者分析原因可能為：大鼠飼養(yǎng)密度偏高，使得其容易發(fā)生相互撕咬，影響自身抵抗力;采用腹腔注射可能存在將藥物直接注射到腸管上的情況，導(dǎo)致藥物無法被腹膜充分吸收入血，從而影響藥效;大鼠樣本量偏小，導(dǎo)致抽樣誤差偏大，不易發(fā)現(xiàn)實際存在的差異;實驗時間偏短，使得CUR和HZC的體內(nèi)抗肝癌作用未能充分發(fā)揮。后續(xù)，本課題組擬針對上述問題進(jìn)一步優(yōu)化實驗設(shè)計進(jìn)行深入研究，以明確HZC作為抗肝癌有效候選藥物的療效。

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（收稿日期：2020-06-14 修回日期：2020-10-17）

（編輯：段思怡）