滇黃芩醇提物及其不同溶劑萃取部位對CCl4致小鼠肝損傷的保護(hù)作用研究

付勝男 李欣坪 虎春艷 薛詠梅 林玉萍

摘 要 目的：研究滇黃芩醇提物及不同溶劑萃取部位對四氯化碳（CCl4）致小鼠肝損傷的保護(hù)作用。方法：用95%乙醇提取滇黃芩得到醇提物浸膏;再經(jīng)乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，得不同溶劑萃取部位。從48只小鼠中隨機(jī)選取8只為正常組，其余40只為造模組。正常組小鼠腹腔注射給予等體積橄欖油，每3日1次，連續(xù)6周;造模組小鼠腹腔注射給予30%CCl4橄欖油溶液，首次劑量為5 mL/kg，以后每次3 mL/kg，每3日1次，連續(xù)6周，造成肝損傷模型。將造模成功后的小鼠隨機(jī)分為模型組（生理鹽水）、水飛薊賓組（陽性對照，20 mg/kg）、滇黃芩醇提物組（100 mg/kg）、滇黃芩乙酸乙酯組（100 mg/kg）、滇黃芩正丁醇組（100 mg/kg），每組8只。每日灌胃1次，連續(xù)給藥6周。觀察各組小鼠實(shí)驗(yàn)期間的一般狀態(tài);末次給藥1 h后，采用酶標(biāo)儀檢測其血清中總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）的含量;經(jīng)蘇木精-伊紅染色后，觀察其肝組織病理形態(tài)學(xué)變化并進(jìn)行Ishak評分。結(jié)果：正常組小鼠活動(dòng)正常，毛發(fā)濃密有光澤，體質(zhì)量正常增長，肝組織未見明顯病理形態(tài)學(xué)改變;模型組小鼠精神萎糜，毛發(fā)蓬亂無光澤，體質(zhì)量（給藥前及給藥第1、2周）均較正常組顯著減輕（P<0.05或P<0.01）;與正常組比較，模型組小鼠血清中TC、TG、ALT和AST含量均顯著升高（P<0.01或P<0.05）;肝小葉結(jié)構(gòu)受到破壞嚴(yán)重，炎癥細(xì)胞浸潤嚴(yán)重，肝索組織排列紊亂，Ishak評分顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組小鼠上述癥狀及肝組織病理損傷均有不同程度的改善;水飛薊賓組、滇黃芩乙酸乙酯組小鼠血清中TC、ALT、AST含量，各給藥組小鼠血清中TG含量以及水飛薊賓組、滇黃芩醇提物組、滇黃芩乙酸乙酯組小鼠肝組織Ishak評分均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：滇黃芩醇提物及其不同溶劑萃取部位對CCl4致肝損傷模型小鼠均有不同程度的肝保護(hù)作用，乙酸乙酯部位可能是其護(hù)肝活性部位。

關(guān)鍵詞 滇黃芩;醇提物;萃取部位;四氯化碳;肝損傷;小鼠

中圖分類號(hào) R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2020）22-2731-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.22.08

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the protective effects of Scutellaria amoena enthanol extract and its different solvent parts on liver injury induced by CCl4. METHODS： S. amoena was extracted with 95% ethanol to obtain ethanol extract， and then was respectively extracted with ethyl acetate and n-butanol to obtain corresponding polar parts. Totally 48 mice were randomly divided into normal group （8 mice）and modeling group （40 mice）. Normal group was given constant volume of olive oil intraperitoneally， 3 times a day， for consecutive 6 weeks. Model group was given 30%CCl4-olive oil solution intraperitoneally to induce liver injury model， with initial dose of 5 mL/kg after each 3 mL/kg， 3 times a days， for 6 consecutive weeks. After modeling， the mice were randomly divided into model group （normal saline）， sylibin group （positive control， 20 mg/kg）， S. amoena ethanol extract group （100 mg/kg）， S. amoena ethyl acetate group （100 mg/kg）， and S. amoena n-butanol group （100 mg/kg）， with 8 mice in each group. After they were given relevant medicine intragastrically once a day，for consecutive 6 weeks. The general information during experiment of mice was observed. 1 h after last medication， the serum contents of TC， TG， ALT and AST were determined by Enzyme-labelled meter. After HE staining， the pathological changes of liver tissue were observed and Ishak score was performed. RESULTS： In normal group， mice had normal activity， thick and glossy hair， and the body weight was increased. The liver tissue had no obvious pathological changes. The model group had sparse hair， and they were emaciated and listlessness; and body weight （before medication， 1， 2 week after medication） was significantly lower than normal group （P<0.05 or P<0.01）. Compared with normal group， the contents of TC， TG， ALT and AST in serum were increased significantly （P<0.01 or P<0.05）. The structure of hepatic lobule was severely damaged and had more inflammatory cell infiltration;the arrangement of hepatic cord was disordered and the Ishak score was significantly increased （P<0.001）. Compared with model group， above symptom and liver injury of mice in different administration groups were improved to different extents. The serum contents of TC， ALT and AST in silybin group and S. amoena ethyl acetate group， serum contents of TG in administration groups as well as Ishak scores of liver tissue were decreased significantly in silybin group， S. amoena ethanol extract group and S. amoena ethyl acetate group （P<0.05 or P<0.001）. CONCLUSIONS： S. amoena ethanol extract and its different solvent parts can protect liver tissue of CCl4-induced liver injury model mice， and active part is the ethyl acetate part of S. amoena.

KEYWORDS? ?Scutellaria amoena; Ethanol extract; Solvent parts; CCl4;Liver injury; Mice

肝損傷是多種慢性肝臟疾病的共同病理過程，表現(xiàn)為肝內(nèi)細(xì)胞外間質(zhì)成分過度堆積，并影響肝臟功能[1]。肝損傷的病因較多，主要包括化學(xué)性、免疫性、藥物性、酒精性肝損傷等，是肝硬化、肝癌發(fā)生的重要始動(dòng)因素，現(xiàn)已成為一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病[2-3]。四氯化碳（CCl4）肝損傷模型是一個(gè)較為經(jīng)典的模型，其損傷機(jī)制與人類病毒性肝炎類似，主要是因CCl4進(jìn)入機(jī)體后，產(chǎn)生氯仿自由基（CCl3·），繼而引起肝組織細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，最終對細(xì)胞膜和細(xì)胞器造成損傷[4-5]。

中藥具有歷史悠久、來源豐富、毒性較低等特點(diǎn)，是緩解肝損傷的研究熱點(diǎn)之一[6]。滇黃芩為唇形科黃芩屬植物滇黃芩Scutellaria amoena C. H. Wright的干燥根莖，分布在云南、四川、貴州等地區(qū)，是西南地區(qū)廣泛使用的民族藥[7]。在彝醫(yī)古籍《聶蘇諾期》《啟谷屬》以及《云南本草》《云南民族藥大辭典》中都有記載。該藥性寒、味苦，歸肺、肝、膽、胃、大腸經(jīng)，具有清肺胃熱、燥濕氣、消炎、解毒、安胎、止血等功效，彝醫(yī)常用于治療泄痢、腮腫、肺咳、肝痛、傳染性肝炎等[8-9]。目前，有關(guān)滇黃芩藥理活性的研究報(bào)道有限。劉海鷗等[10]發(fā)現(xiàn)，滇黃芩總黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化活性;何曉山等[11-12]研究發(fā)現(xiàn)，滇黃芩醇提物具有抗心律失常的作用，能阻滯豚鼠心肌細(xì)胞鈉通道，有望成為穩(wěn)定的豚鼠心肌組織鈉通道阻斷劑。為進(jìn)一步探尋滇黃芩的活性成分，本研究采用CCl4致肝損傷大鼠模型，研究滇黃芩醇提物及其不同溶劑萃取部位對肝損傷模型大鼠的保護(hù)作用，為闡明民間用藥依據(jù)及開發(fā)具有保肝作用的民族藥用資源提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

Infinite M200 PRO型酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司）;RM2016型組織切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）;Nikon ECLIPSE C1正置顯微鏡、Nikon Digital Sight DS-FI2型成像系統(tǒng)（日本Nikon公司）。

1.2 藥品與試劑

滇黃芩藥材采自云南省新平縣，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院藥用植物教研室普春霞副教授鑒定為唇形科植物滇黃芩Scutellaria amoena C. H. Wright的干燥根莖。

總膽固醇（TC，批號(hào)：20180919）、三酰甘油（TG，批號(hào)：20180919）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST，批號(hào)：20180919）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT，批號(hào)：20180921）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;水飛薊賓膠囊（陽性對照，天津天士力圣特制藥有限公司，批號(hào)：20180813，規(guī)格：35 mg）;橄欖油[上海益民食品一廠（集團(tuán)）有限公司，批號(hào)：20170515，規(guī)格：750 mL];蘇木精-伊紅（HE）染色試劑（武漢賽維爾科技有限公司，批號(hào)：G1005）;0.9%氯化鈉注射液（廣西裕源藥業(yè)有限公司，批號(hào)H180616，規(guī)格：500 mL ∶ 4.5 g;作生理鹽水用）;CCl4、乙酸乙酯、正丁醇均為分析純，乙醇為工業(yè)級(jí)（云南楊林工業(yè)開發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司），水為蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性昆明種小鼠48只，周齡6～8周，體質(zhì)量20～24 g，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2015-030。所有小鼠均飼養(yǎng)于溫度22～24 ℃、相對濕度50%～60%的環(huán)境中，自由飲水、攝食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 滇黃芩提取物及其不同溶劑萃取部位的制備

取滇黃芩藥材，粉碎成粗粉;取粗粉200 g，用95%乙醇2 000 mL 加熱回流提取3次，每次2.5 h;合并提取液，經(jīng)減壓蒸餾回收得乙醇浸膏（浸膏得率為7.62%），經(jīng)冷凍干燥，即得醇提物（SA）。取上述醇提物適量，加適量水溶解，形成混懸液后依次用乙酸乙酯、正丁醇各200 mL進(jìn)行萃取，分別萃取5次;合并相同萃取部位，回收萃取試劑得相應(yīng)浸膏（浸膏得率分別為45.24%、16.15%），經(jīng)冷凍干燥，得到乙酸乙酯部位（SA-A）、正丁醇部位（SA-B）。上述提取物及萃取部位均于室溫下保存，實(shí)驗(yàn)前用生理鹽水稀釋至相應(yīng)濃度。

2.2 分組、給藥與造模

從48只小鼠中隨機(jī)選取8只為正常組，其余40只為造模組。正常組小鼠腹腔注射等體積橄欖油，每3日1次，連續(xù)6周;造模組小鼠腹腔注射30%CCl4橄欖油溶液，首次劑量為5 mL/kg，以后每次3 mL/kg，每3日1次，連續(xù)6周以建立肝損傷模型（根據(jù)肝組織病理切片染色情況進(jìn)行判斷）[13]。將造模成功后的小鼠隨機(jī)分為模型組（生理鹽水）、水飛薊賓組（陽性對照，20 mg/kg）、滇黃芩醇提物組（SA組，100 mg/kg）、滇黃芩乙酸乙酯組（SA-A組，100 mg/kg）、滇黃芩正丁醇組（SA-B組，100 mg/kg），每組8只，各藥物組根據(jù)前期研究確定相應(yīng)的劑量[14]。各藥物組小鼠每日灌胃相應(yīng)藥物1次，連續(xù)給藥6周，每周根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥量;正常組和模型組小鼠同法灌胃等體積生理鹽水。

2.3 一般情況觀察

記錄各組小鼠實(shí)驗(yàn)期間一般情況的變化。

2.4 血清TC、TG、AST、ALT檢測

末次給藥后1 h，各組小鼠摘眼球取血，將收集到的血液標(biāo)本于37 ℃保溫30 min，以3 000 r/min離心10 min，分離血清，用酶標(biāo)儀檢測各組小鼠血清中TC、TG、AST、ALT的含量。嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書操作。

2.5 肝組織形態(tài)學(xué)觀察

采血后迅速處死小鼠，取出肝臟，剪取相同位置的肝組織適量，用4%多聚甲醛溶液固定24 h以上，經(jīng)常規(guī)石蠟包埋，切片（厚度約5～8 μm），以HE染色后置于顯微鏡下觀察并采集圖像。根據(jù)Ishak評分系統(tǒng)[15]對門管區(qū)周圍或周圍間隔區(qū)交界面肝炎（碎片狀壞死）、 融合性壞死、局灶性（斑狀）溶解性壞死、凋亡及局灶性炎癥、門管區(qū)炎癥等4個(gè)項(xiàng)目進(jìn)行評分，總分最高18分。其中，總分0～6分為輕度、7～12分為中度、13～18分為重度，詳見表1。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5.0和SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析;方差性齊時(shí)組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，不齊性時(shí)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 滇黃芩醇提物及其不同溶劑萃取部位對CCl4致肝損傷模型小鼠一般情況的影響

造模前，小鼠活動(dòng)正常，反應(yīng)迅速，毛發(fā)濃密有光澤。造模后（給藥前），隨著造模時(shí)間的延長，除正常組外其余各組小鼠活動(dòng)逐漸減少，精神萎糜，毛發(fā)蓬亂無光澤，常蜷縮于墊料中而臥且飲食量減少;其中以模型組小鼠最為明顯，主要表現(xiàn)為精神萎糜、行動(dòng)遲緩、毛發(fā)稀疏無光澤、體型消瘦其給藥前及給藥第1、2周體質(zhì)量均較正常組顯著降低（P<0.05或P<0.01）。而經(jīng)藥物干預(yù)2周后，各給藥組小鼠的攝食和飲水量開始恢復(fù)正常，體質(zhì)量開始增加，毛發(fā)密度有所增加，行動(dòng)較為敏捷;其中SA-A組較其他組別改善較為明顯，肉眼觀察更接近于正常組，但各藥物各時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量與模型組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組小鼠體質(zhì)量變化見表2。

3.2 滇黃芩醇提物及其不同溶劑萃取部位對CCl4致肝損傷模型小鼠血清TC、TG、ALT、AST含量的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清中TC、TG、ALT、AST含量均顯著增高（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，水飛薊賓組和SA-A組小鼠血清中TC、ALT、AST含量以及各藥物組小鼠血清中TG含量均顯著降低（P<0.01或P<0.05）;而SA組小鼠血清中TC、ALT、AST含量以及SA-B組小鼠血清中TC、TG、ALT、AST含量與模型組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見圖1。

3.3 滇黃芩醇提物及其不同溶劑萃取部位對CCl4致肝損傷模型小鼠肝組織形態(tài)學(xué)的影響

3.3.1 肝組織形態(tài)學(xué)觀察 正常組小鼠肝組織未見明顯病理形態(tài)學(xué)改變，肝小葉內(nèi)細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰完整，未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤;肝細(xì)胞大小均勻，以中央靜脈為中心呈放射狀排列，匯管區(qū)無纖維組織增生。模型組小鼠肝組織出現(xiàn)明顯的病理形態(tài)改變，肝索排列紊亂，細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞，結(jié)構(gòu)不清晰，炎癥細(xì)胞浸潤明顯，部分可見假小葉形成及不同程度局部灶性壞死，有明顯的脂肪變性。水飛薊賓組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，出現(xiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞未見局部灶性壞死，肝組織損傷程度明顯輕于模型組。SA組、SA-B組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)出現(xiàn)輕度紊亂，出現(xiàn)部分炎癥細(xì)胞浸潤，有少量局部灶性壞死及脂肪變性，但肝損傷程度明顯輕于模型組。SA-A組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索排列基本整齊，炎癥細(xì)胞浸潤較少，肝損傷程度明顯輕于模型組，詳見圖2。

3.3.2 Ishak評分 模型組小鼠的評分結(jié)果為10～14分，水飛薊賓組小鼠的評分為8～11分，SA組小鼠的評分為9～12分，SA-A組小鼠的評分為7～11分，SA-B組小鼠的評分為9～12分。與正常組比較，模型組小鼠Ishak評分顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，水飛薊賓組、SA組和SA-A組小鼠的Ishak評分均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;而SA-B組小鼠的Ishak評分與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見表3。

4 討論

民族藥藥用歷史悠久，但基礎(chǔ)研究薄弱，缺乏對相關(guān)藥物有效成分、藥理活性的研究，且很多藥材無相應(yīng)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)[16]。云南省民族藥藥用資源豐富，可以通過對民族藥的活性進(jìn)行研究，挖掘其物質(zhì)基礎(chǔ)并驗(yàn)證民間應(yīng)用，從而助力于民族藥利用價(jià)值的進(jìn)一步開發(fā)[17-18]。滇黃芩極性、毒性實(shí)驗(yàn)的研究表明，其醇提物對小鼠有一定的急性毒性，但用量遠(yuǎn)超臨床劑量[12]，說明滇黃芩醇提物是較為安全的。

肝臟是機(jī)體代謝和調(diào)節(jié)、貯存血液的主要器官，當(dāng)CCl4進(jìn)入機(jī)體后可產(chǎn)生大量自由基，攻擊細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸，誘發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使脂肪過度氧化并浸潤，進(jìn)一步致使細(xì)胞膜通透性增加，引起血液中 TC、TG、ALT、AST含量升高[19]。Ishak評分系統(tǒng)是臨床中評價(jià)病毒性肝炎最常見的半定量評分體系，能較好地反映病毒性肝炎的炎癥活動(dòng)度與纖維化程度[19]。本研究中，筆者主要研究了滇黃芩乙醇提取物及乙酸乙酯、正丁醇等不同溶劑萃取部位的保肝作用;并以水飛薊賓（其具有明顯保護(hù)和穩(wěn)定肝細(xì)胞的作用，可防止脂肪過度氧化及浸潤，促進(jìn)肝臟代謝而達(dá)到護(hù)肝作用[18]）為陽性藥。結(jié)果顯示，滇黃芩醇提物及不同溶劑萃取部位對小鼠的攝食、飲水量減少，體質(zhì)量減輕，毛發(fā)無光澤等癥狀均具有不同程度的改善，其中SA-A組較其余萃取物組改善較為明顯;滇黃芩醇提物及不同極性部位均可降低小鼠血清TC、TG、ALT、AST的含量，其中SA-A組的效果更為顯著。HE染色結(jié)果顯示，與模型組比較，SA、SA-A、SA-B組小鼠肝組織損傷均有不同程度的減輕，Ishak評分（除SA-B組外）均顯著降低。這提示滇黃芩醇提物及其不同溶劑萃取部位對CCl4致肝損傷小鼠均有一定的改善作用，其有效部位是乙酸乙酯部位。同時(shí)，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，滇黃芩乙酸乙酯部位主要含有黃芩素、漢黃芩素、去甲漢黃芩素、白楊素、千層紙素A等黃酮類及其苷類成分，其中游離黃酮的抗氧化活性明顯高于黃酮苷類[14]，而CCl4致小鼠肝損傷機(jī)制與脂質(zhì)過氧化有關(guān)，說明滇黃芩乙酸乙酯部分中具有保肝作用可能為游離黃酮類成分。因此，在后續(xù)研究中，本課題組將對游離黃酮成分群或單一成分的保肝作用進(jìn)行研究，闡明其保肝作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。

綜上所述，民族藥從整體、異病同治的理論進(jìn)行治療肝病具有悠久的歷史和獨(dú)特的優(yōu)勢，具有療效好、不良反應(yīng)少等特點(diǎn)，在肝損傷方面具有較好的應(yīng)用前景[20-21]。本研究結(jié)果表明，滇黃芩乙酸乙酯部位可能是其保肝作用的有效部位，為后期滇黃芩保肝作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)，也為該藥資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了依據(jù)。

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（收稿日期：2020-07-19 修回日期：2020-10-21）

（編輯：羅 瑞）