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    FOXP3基因多態(tài)性在廣西壯族女性人群中的分布

    2020-12-28 02:07石鳳陳志鴻龐曉霞仇雯麗凌永嫦李光景楊鳳蓮王俊利
    右江醫(yī)學 2020年11期
    關鍵詞:種族

    石鳳 陳志鴻 龐曉霞 仇雯麗 凌永嫦 李光景 楊鳳蓮 王俊利

    【摘要】 目的 探討FOXP3 單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)在廣西壯族女性人群的分布頻率,并與其他人群比較分析基因遺傳異質性。

    方法 運用iMLDR技術和DNA測序檢測200例廣西壯族女性人群中的rs2280883和rs3761549基因型和等位基因頻率,并與PubMed數(shù)據(jù)庫公布的千人基因組計劃人群進行比較。

    結果 在廣西壯族女性人群中,rs2280883主要以TT基因型(71.5%)為主,rs3761549主要以GG基因型(62.5%)為主。rs2280883基因型和等位基因與非洲人群、美國人群、歐洲人群和南亞人群分布頻率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。rs3761549基因型與非洲人群、美國人群、歐洲人群和南亞人群分布頻率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);rs3761549等位基因與美國人群、歐洲人群和南亞人群分布頻率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

    結論 在廣西壯族女性人群中,F(xiàn)OXP3存在rs2280883和rs3761549多態(tài)性,并且與其他種族地區(qū)(非洲、美國、歐洲和南亞)存在基因遺傳異質性。

    【關鍵詞】 FOXP3;單核苷酸多態(tài)性;種族

    中圖分類號:R737.9 ? 文獻標志碼:A ? DOI:10.3969/j.issn.1003-1383.2020.11.003

    【Abstract】 Objective To investigate the distribution frequency of FOXP3 single nucleotide polymorphism (SNP) among Zhuang women in Guangxi, and to analyze their genetic heterogeneity by comparing with ?populations from other ethnic regions.

    Methods iMLDR techniques and DNA sequencing were used to detect rs2280883 and rs3761549 genotypes and allele frequencies in 200 Zhuang women in Guangxi and compared with population of the 1000 Genomes Project published in PubMed database.

    Results Among Zhuang women in Guangxi, TT genotype (71.5%) was the main genotype of rs2280883, and GG genotype (62.5%) was the main genotype of rs3761549. The distribution frequency of rs2280883 genotypes and alleles were significantly different from those in Africa, the United States, Europe and South Asia (P < 0.05). The distribution frequency of rs3761549 genotype was significantly different from those of population in Africa, the United States, Europe and South Asia (P < 0.05). In addition, the distribution frequency of rs3761549 allele was significantly different from those of population in the United States, Europe and South Asia (P < 0.05).

    Conclusion Among Zhuang women in Guangxi, FOXP3 has rs2280883 and rs3761549 polymorphisms, and there are genetic heterogeneity with other ethnic regions (Africa, the United States, Europe and South Asia).

    【Key words】 FOXP3; SNP; ethnic

    叉頭/翼狀螺旋轉錄家族因子3 (Forkhead lineage-transcription factor, FOXP3) 定位于X染色體Xp11.23,含有11個編碼外顯子,屬于FOX家族蛋白,特征性地表達于調(diào)節(jié)性T細胞(Regulatory T cells, Treg),參與Treg細胞的增殖、分化和成熟,控制Treg細胞的基因表達和轉錄。Treg細胞在免疫調(diào)節(jié)中起著重要作用,參與外周免疫耐受,調(diào)節(jié)病原體特異性免疫應答,抑制移植排斥反應,促進腫瘤免疫逃逸。FOXP3是一種多結構域蛋白,氨基酸端包含亮氨酸拉鏈、鋅指蛋白和阻遏結構域,羧基端包含叉頭DNA結合結構域,F(xiàn)OXP3與Treg細胞啟動子區(qū)域結合,調(diào)節(jié)Treg細胞的基因表達,影響其轉錄水平。FOXP3對誘導和維持Treg細胞獨特的免疫抑制特性至關重要[1]。FOXP3基因突變導致Treg細胞表達異常,引起自身免疫性疾病[2~3]。FOXP3可抑制乳腺癌細胞的侵襲和轉移[4],促進胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力[5]。FOXP3在腫瘤細胞中發(fā)揮著促癌和抑癌作用,可能存在組織特異性。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)是指單個核苷酸堿基發(fā)生突變,包括堿基移碼、置換、缺失和倒位?;騿幼訁^(qū)域發(fā)生突變會引起RNA聚合酶Ⅱ識別異常,導致基因轉錄水平降低,基因內(nèi)含子區(qū)域突變影響mRNA的可變剪切[6]?;蛲蛔兣c腫瘤疾病的發(fā)病風險密切相關。HE等[7]研究發(fā)現(xiàn)TERT內(nèi)含子基因突變rs10069690與來自非洲人群的乳腺癌患者發(fā)病風險呈負相關(OR=0.86, 95%CI=0.75~0.97),而與來自歐洲人群的乳腺癌患者發(fā)病風險呈正相關(OR=1.19, 95%CI=1.13~1.25)。YANG等[8]研究展示UNC13A內(nèi)含子多態(tài)性rs12608932增加來自美國和歐洲的肌萎縮患者的發(fā)病風險,而與來自日本和中國肌萎縮患者發(fā)病風險無關。表明SNPs位點存在人群分布特征。本研究旨在探討FOXP3 SNPs在不同女性人群中的分布情況,為FOXP3 SNPs在不同人群中的疾病研究,尤其FOXP3 SNPs在女性腫瘤疾病中的研究提供理論基礎。

    1 資料與方法

    1.1 研究對象

    隨機選取2018~2019年在右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科進行健康體檢的正常女性共200例,年齡(37.21±12.89)歲,經(jīng)問卷調(diào)查,所研究人群戶籍所在地為廣西地區(qū),并長期居住于廣西地區(qū),研究群體之間無血緣關系,實驗室各項檢測指標均在正常范圍內(nèi),既往無慢性病史、腫瘤病史,所納入對象均未曾患有免疫性疾病。所研究人群均經(jīng)受試者知情同意并簽署知情同意書,該研究經(jīng)右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院倫理委員會討論批準。

    1.2 DNA提取

    清晨空腹采集志愿者全血2~5 mL于EDTA-K2+抗凝管,輕輕搖晃混勻,采用深圳亞能公司DNA提取試劑盒,按照操作說明書提取DNA,并于-70°冰箱保存待用。

    1.3 PCR引物設計及反應體系

    查閱NCBI數(shù)據(jù)庫中FOXP3基因rs2280883和rs3761549的堿基序列,根據(jù)在線primer3.0軟件設計FOXP3基因多態(tài)性位點的擴增引物序列,由上海天昊生物科技有限公司合成。rs2280883的上游引物為:5′-GAAGGAGTTGGGATGGGGTGAT-3′,下游引物為:5′-CCATCTCTGCACCTTGCCCTAA-3′;rs3761549上游引物為:5′-CGACACCACGGAGGAAGAGAAG-3′,下游引物為:5′-CAAACCTGGGTCCTCTCCACAA-3′。PCR反應體系包括(20 μL): 1 μL樣本DNA,0.3 mM dNTP,1 μL多重PCR引物,1 U HotStarTaq polymerase(Qiagen Inc.),2 U 3.0 mM Mg2+,1x HotStarTaq buffer,剩余體積用超純水補至20 μL。PCR反應程序:95℃ 2 min,94℃ 20 s,65℃ 40 s,72℃ 1.5 min,共計35個循環(huán)。在10 μL PCR產(chǎn)物中加入2 U Exonuclease I酶和5 U SAP酶,37℃水浴1 h, 然后75℃ 滅活15 min進行多重PCR純化。連接反應體系包括:10x連接緩沖液1 μL、純化后多重PCR產(chǎn)物2 μL、5′連接引物混合液(1 μM)0.4 μL,3′連接引物混合液(2 μM)0.4 μL、高溫連接酶0.25 μL、ddH2O 6 μL混勻。連接反應程序為94℃ 1 min,56℃ 4 min,共計38個循環(huán)。

    1.4 iMLDR多重SNP分型

    先采用多重PCR技術將rs2280883和rs3761549所在區(qū)段在反應體系中獲得擴增產(chǎn)物。擴增產(chǎn)物經(jīng)外切核酸酶及蝦堿酶 (ExoI/SAP)純化后用于后續(xù)連接酶反應的模板。在一個連接反應中,每個位點包含兩個5′端等位基因特異探針以及緊挨其后的一條3′端位點的熒光標記的特異探針。通過毛細管電泳鑒別連接產(chǎn)物。該試驗由上海天昊生物科技有限公司進行。

    1.5 不同種族人群分布頻率獲取

    通過千人基因組數(shù)據(jù)庫,提取北京漢族女性人群、非洲女性人群、美國女性人群、日本女性人群、歐洲女性人群和南亞女性人群的基因型和等位基因分布頻率。

    1.6 統(tǒng)計學方法

    采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行分析。hardy-Weinberg檢測研究人群的群體遺傳平衡定律。計數(shù)資料以百分率(%)表示,組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法,檢驗水準:α=0.05。

    2 結 ?果

    2.1 rs2280883和rs3761549基因分型

    在廣西壯族女性健康人群中,rs2280883多態(tài)性位點存在三種基因型,分別為TT、TC和CC;rs3761549多態(tài)性位點存在三種基因型,分別為GG、GA和AA。測序圖譜如圖1所示。

    2.2 FOXP3 SNPs在廣西壯族女性人群中的分布

    FOXP3 SNPs兩位點rs2280883和rs3761549在廣西壯族女性人群中的基因型和等位基因分布頻率如表1所示,rs2280883的基因型TT、TC和CC分布頻率分別為71.5%、25.5%和3.0%,其等位基因T和C分布頻率分別占84.2%和15.8%。rs3761549的基因型GG、GA和AA分布頻率分別為62.5%、33.5%和4.0%,其等位基因G和A分布頻率分別為79.2%和20.8%。兩多態(tài)性位點均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律,表明所選群體符合孟德爾遺傳平衡定律(P=0.549和P=0.793)。

    2.3 FOXP3 SNPs與其他人群的分布

    由于FOXP3定位于X染色體的特性,查詢千人基因組計劃不同種族人群,對數(shù)據(jù)進行二次整理,獲得女性健康人群分布規(guī)律。將廣西壯族女性健康人群與來自PubMed公布的千人基因組計劃的其他種族女性健康人群(包括北京漢族人群、非洲人群、美國人群、日本人群、歐洲人群和南亞人群)進行基因型和等位基因分布頻率比較。本研究結果顯示:廣西壯族女性人群rs2280883基因型和等位基因與非洲女性人群、美國女性人群、歐洲女性人群和南亞女性人群的基因型和等位基因分布頻率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而與來自北京漢族女性人群和日本女性人群差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。廣西壯族女性人群rs3761549基因型分布頻率與非洲女性人群、美國女性人群、歐洲女性人群和南亞女性人群差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05),而與中國北京漢族女性人群和日本女性人群差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);廣西壯族女性人群rs3761549等位基因分布頻率與美國女性人群、歐洲女性人群和南亞女性人群差異有統(tǒng)計學意義,而與中國北京漢族女性人群、非洲女性人群和日本女性人群差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2,表3。

    3 討 ?論

    Treg細胞是腫瘤微環(huán)境中免疫逃逸和免疫監(jiān)測的重要參與者,F(xiàn)OXP3作為Treg細胞的顯著特征因子,參與自身免疫耐受及腫瘤發(fā)病機制?;蚨鄳B(tài)性是遺傳變異的主要類型,LOU等[9]發(fā)現(xiàn)rs2280883增加中國漢族人群大腸癌的患病風險。JIANG等[10]進行Meta分析表明rs3761548和rs3761549 SNP與亞洲人群乳腺癌發(fā)病風險無關,而分別增加非小細胞肺癌和降低肝細胞癌的發(fā)病風險。CHEN等[11] Meta分析研究發(fā)現(xiàn)攜帶FOXP3 SNPs rs3761548的AA基因型和A等位基因與中國人群患癌風險增加有關,而與總體人群無關,表明該多態(tài)性位點可能存在種族遺傳差異。因此,本研究進一步探討FOXP3 rs2280883和rs3761549位點在種族人群中的差異,為以往關于FOXP3 SNPs在同一疾病不同種族人群的研究結論不一致提供合理解釋,并為日后研究的人群樣本選擇提供理論依據(jù)。

    本研究結果表明,在廣西壯族女性人群中,rs2280883存在TT、TC和CC三種基因型,分布頻率分別為71.5%、25.5%和3.0%,其兩等位基因T和C分布頻率分別為84.2%和15.8%;rs3761549存在GG、GA和AA三種基因型,分布頻率分別為62.5%、33.5%和4.0%,其兩等位基因G和A分布頻率分別為79.2%和20.8%,兩基因多態(tài)性位點基因型均符合孟德爾遺傳平衡定律。將本研究的廣西壯族女性人群與來自千人基因組計劃中的其他種族的女性人群進行比較,包括中國北京人群、非洲人群、美國人群、日本人群、歐洲人群和南亞人群,結果顯示:廣西壯族女性人群rs2280883基因型和等位基因與來自北京漢族女性人群和日本女性人群差異無統(tǒng)計學意義,而與非洲女性人群、美國女性人群、歐洲女性人群和南亞女性人群的基因型和等位基因分布頻率差異有統(tǒng)計學意義。廣西壯族女性人群rs3761549基因型分布頻率與中國北京漢族女性人群和日本女性人群差異無統(tǒng)計學意義,而與非洲女性人群、美國女性人群、歐洲女性人群和南亞女性人群差異有統(tǒng)計學意義;廣西壯族女性人群rs3761549等位基因分布頻率與中國北京漢族女性人群、非洲女性人群和日本女性人群差異無統(tǒng)計學意義,而與美國女性人群、歐洲女性人群和南亞女性人群差異有統(tǒng)計學意義。LI等[12]發(fā)現(xiàn)rs3761548和rs3761549 SNP增加亞洲人群甲狀腺功能亢進的風險,但與白高加索人群的甲亢疾病風險無關,表明rs3761549存在基因遺傳異質性,與本研究結論一致。日本國家與中國國家的地理位置相毗鄰,生活習性、環(huán)境以及通婚狀況越發(fā)普遍,可能是rs2280883和rs3761549基因型和等位基因與中國北京人群和日本人群差異不大的原因之一。

    綜上所述,F(xiàn)OXP3基因多態(tài)性位點rs2280883和rs3761549在不同人群中的分布差異有統(tǒng)計學意義。廣西與云南和越南毗鄰,少數(shù)民族較多,經(jīng)濟發(fā)展水平較北京和其他國家相對落后,是多種遺傳性疾病的高發(fā)地區(qū),如鼻咽癌和地中海貧血。本研究探討基因多態(tài)性在不同人群中的分布頻率,為日后研究基因多態(tài)性與疾病的相關性提供理論基礎,也為選擇研究人群多元化的必要性提供理論依據(jù)。但本研究存在兩點不足:第一,廣西作為一個少數(shù)民族地區(qū),本次研究均為廣西壯族女性人群,未納入其他少數(shù)民族進行分層分析;第二,本研究樣本例數(shù)相對較少,研究人群均基于醫(yī)院選擇,可能存在樣本選擇偏倚。因此,在本研究基礎上,本課題組將進一步跨區(qū)域選擇樣本研究該兩個基因多態(tài)性位點與疾病的關系并進行種族分層分析。

    參 考 文 獻

    [1] ?HUEHN J, BEYER M.Epigenetic and transcriptional control of Foxp3+regulatory T cells[J]. Semin Immunol, 2015, 27(1): 10-18.

    [2] ?HASHEMI V, FARROKHI A S, TANOMAND A, et al. Polymorphism of Foxp3 gene affects the frequency of regulatory T cells and disease activity in patients with rheumatoid arthritis in Iranian population[J]. Immunol Lett, 2018, 204: 16-22.

    [3] ?ZHANG Y, ZHANG J, LIU H, et al. Meta-analysis of FOXP3 gene rs3761548 and rs2232365 polymorphism and multiple sclerosis susceptibility[J]. Medicine (Madr), 2019, 98(38): e17224.

    [4] ?ZHANG C, XU Y, HAO Q, et al. FOXP3 suppresses breast cancer metastasis through downregulation of CD44[J]. Int J Cancer, 2015, 137(6):1279-1290.

    [5] ?ZHANG L, XU J, ZHANG X, et al. The role of tumoral FOXP3 on cell proliferation, migration, and invasion in gastric cancer[J]. Cell Physiol Biochem, 2017, 42(5): 1739-1754.

    [6] ?MUCAKI E J, SHIRLEY B C, ROGAN P K. Expression changes confirm genomic variants predicted to result in allele-specific, alternative mRNA splicing[J]. bioRxiv, 2020, 11:109.

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