環(huán)狀RNA及其在豬上的研究進展

閆尊強，姜天團，孫文陽，王鵬飛，黃曉宇，楊巧麗，胡慧艷，李守湖，滾雙寶,

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省現(xiàn)代養(yǎng)豬工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730070；3.河北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，河北 保定 071000；4.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070)

circRNA是一類新發(fā)現(xiàn)的不編碼蛋白質(zhì)的內(nèi)源性RNA分子，是非編碼RNA(如miRNA、lncRNA、piRNA)重要成員之一，廣泛存在于自然界中的各種生物體內(nèi)，如人[1]、豬[2]、小鼠[3]、秀麗隱桿線蟲[4]、古細菌[5]等.研究發(fā)現(xiàn)circRNA與生物體正常發(fā)育、疾病的發(fā)生與發(fā)展等生物學過程密切相關(guān)，已成為生物學研究的熱點[6-8].本文將從circRNA的發(fā)現(xiàn)、生成、分類、特征、功能及其在豬上的研究進展作一綜述.

1 circRNA的發(fā)現(xiàn)

1976年Sanger等[9]使用電子顯微鏡研究植物類病毒(viroids)時，發(fā)現(xiàn)4種類病毒顆粒中均含有閉合的環(huán)狀分子；1990年Matsumoto等[10]用電子顯微鏡在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中發(fā)現(xiàn)了無5’端和3’端且呈環(huán)形狀的20S，該研究首次從真菌單細胞生物體中發(fā)現(xiàn)了circRNA的身影；1991年Nigro等[11]發(fā)現(xiàn)抑癌基因DCC可轉(zhuǎn)錄出4個circRNA，表達量較低，主要存在于細胞質(zhì)中；1993年Capel等[12]使用寡核苷酸雜交技術(shù)及RNase H消化試驗研究了小鼠睪丸中的Sry基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是環(huán)狀分子；1993年Cocquerelle等[13]發(fā)現(xiàn)人ets-1基因轉(zhuǎn)錄出的產(chǎn)物可穩(wěn)定存在于細胞質(zhì)中，且呈環(huán)形，表明ets-1基因可轉(zhuǎn)錄出circRNA；1996至1997年Zaphiropoulos等[14-15]發(fā)現(xiàn)鼠細胞色素P4502C24基因及人細胞色素P-4502C1基因均可生成circRNA；2010年Burd等[16]用RACE(rapid amplification of cDNA ends)和RNase R消化試驗研究了人ANRIL基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)其中一產(chǎn)物呈環(huán)狀，即circular ANRIL(cANRIL).盡管在生物體中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了circRNA的影子，但由于circRNA表達豐度不高，及當時檢測技術(shù)水平的限制，一直認為circRNA是由外顯子轉(zhuǎn)錄而形成的異常產(chǎn)物，未引起科學家的關(guān)注.

近年來，隨著RNA測序(RNA sequencing,RNA-Seq)技術(shù)的快速發(fā)展以及生物信息學方法的不斷完善，科學家們已鑒定出了大量的circRNA.2011年Danan等[5]使用RNA-Seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)古細菌硫化葉菌P2(archaeon sulfolobus solfataricus P2)存在多個circRNA，并認為這些circRNA對古細菌的正常生命活動起重要作用；2012年Salzman等[17]對CD19+白細胞、CD34+白細胞及中性粒白細胞(neutrophils)進行RNA-Seq測序，發(fā)現(xiàn)人體細胞中普遍存在circRNA，從此circRNA才算正式進入了科學家的視野；2015年Abdelmohsen等[18]用RNA-Seq技術(shù)探究了恒河猴骨骼肌中的circRNA，共發(fā)現(xiàn)了12 007個circRNA，這些circRNA可能對肌肉的生長發(fā)育有重要影響；2015年Li等[19]使用RNA-Seq技術(shù)對肝臟MHCC-LM3癌細胞及其外泌體進行了circRNA的挖掘，在細胞及外泌體中分別發(fā)現(xiàn)了5 484個和6 751個circRNA，表明circRNA參與肝臟癌癥的發(fā)生發(fā)展過程，外泌體中的circRNA可能為肝癌的診斷標志物；2019年Liu等[20]對不同發(fā)育階段的斑馬魚胚胎進行了circRNA研究，從受精后4.5、8、24、48、72 h的胚胎中共發(fā)現(xiàn)了1 029個circRNA，該研究證實了circRNA對斑馬魚的正常發(fā)育起至關(guān)重要的作用.總之，各個學科領(lǐng)域中諸多circRNA的發(fā)現(xiàn)歸功于更新迭代的高通量測序技術(shù)和生物信息學方法.

2 circRNA的生成及分類

真核生物中普遍存在一種剪接方式，能通過共價鍵連接多個外顯子或內(nèi)含子的5’端和3’端，從而形成具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RNA分子，此種剪接方式被稱為反向剪接[21-22].目前，circRNA的形成有外顯子環(huán)化和內(nèi)含子環(huán)化兩種途徑[23].套索驅(qū)動環(huán)化(lariat-driven circularization)及內(nèi)含子配對環(huán)化(intron-pairing driven circularization)是外顯子環(huán)化的2種形式，套索驅(qū)動環(huán)化指在轉(zhuǎn)錄的過程中核不均一RNA(heterogeneous nuclear RNA，hnRNA)可折疊拉近非相鄰的外顯子，出現(xiàn)外顯子跳躍(exon skipping)，并產(chǎn)生套索中間體，套索中間體剪接后形成外顯子circRNA，而內(nèi)含子配對環(huán)化是指側(cè)翼內(nèi)含子通過堿基互補配對產(chǎn)生環(huán)狀結(jié)構(gòu)，最后剪接掉環(huán)狀結(jié)構(gòu)中的內(nèi)含子，保留的外顯子即可環(huán)化形成外顯子circRNA；一般情況下，由內(nèi)含子組成的套索結(jié)構(gòu)會被脫分支酶降解[24]，但在人胚胎干細胞及Hela細胞中找到了能避免被脫分支酶降解的內(nèi)含子套索結(jié)構(gòu)，這些內(nèi)含子5′端剪接點包含7個富集GU的基序及3′端分支點含有的11個富集C的基序，獨特的核苷酸序列可保護其在剪接之后免受脫分支酶的降解進而加工產(chǎn)生只包含內(nèi)含子的circRNA[25].研究發(fā)現(xiàn)兩個以上的外顯子在環(huán)化過程中，外顯子之間的內(nèi)含子很可能滯留其中，從而加工形成含有外顯子和內(nèi)含子的circRNA[26].

因此，外顯子環(huán)化和內(nèi)含子環(huán)化可產(chǎn)生分別由外顯子、內(nèi)含子以及外顯子和內(nèi)含子共同組成的3種不同類型的circRNA，即外顯子型circRNA(exonic circRNA,EciRNA)、內(nèi)含子型circRNA(intronic circRNA,IciRNA)和外顯子-內(nèi)含子型circRNA(exon-intron circRNA,EIciRNA)，這3種類型的circRNA的基本信息詳見表1.

表1 三種類型circRNA的基本信息

3 circRNA的特征

相比較于線性非編碼RNA，circRNA有以下特征[27-29]：

1)無5′端帽子結(jié)構(gòu)和3′端poly(A)尾巴，5′端和3′端序列緊密相連，形成了內(nèi)源性非編碼RNA；

2)大部分由外顯子構(gòu)成的circRNA序列保守性強，進化保守，然而部分內(nèi)含子構(gòu)成的circRNA序列保守性較差；

3)circRNA是共價鍵形成的環(huán)形結(jié)構(gòu)，不易被核酸酶降解，更加穩(wěn)定；

4)circRNA具有明顯的細胞和組織特異性以及階段特異性，還有種屬特異性，即有些circRNA只存在于人中，而其他物種(如豬、牛)中沒有；

5)大多數(shù)circRNA在生物體內(nèi)的表達量比較低.

4 circRNA的功能

4.1 circRNA可作為miRNA海綿

miRNA是一類長度為18～24 nt，且無蛋白編碼潛能的內(nèi)源性單鏈RNA，miRNA能夠通過堿基互補配對與蛋白編碼基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA結(jié)合，從而調(diào)控靶基因的表達[30].研究發(fā)現(xiàn)位于細胞漿的circRNA上有miRNA結(jié)合位點(binding sites)，circRNA可作為競爭性內(nèi)源性RNA(competitive endogenous RNA,ceRNA)來吸附miRNA，進而抑制miRNA活性，致使靶基因表達量升高[31].退行性相關(guān)蛋白基因1(cerebellar degeneration related 1,CDR1)轉(zhuǎn)錄出的ciRS-7存在于人和小鼠的大腦，ciRS-7含有70個miRNA-7的結(jié)合靶點，發(fā)現(xiàn)單個細胞中的所有ciRS-7分子可結(jié)合20 000個左右的miRNA-7分子，ciRS-7作為miRNA-7的海綿影響miRNA-7靶基因CDR1的表達，過表達ciRS-7可導致斑馬魚大腦發(fā)育受阻，腦體積變小，表明ciRS-7吸附miRNA-7參與動物大腦的正常發(fā)育過程[32]；由小鼠睪丸性別決定基因Sry產(chǎn)生的circSRY，特異性地表達于睪丸組織，其至少包含16個miRNA-138的結(jié)合靶點，因此circSRY可作為miRNA-138海綿體調(diào)控Sry基因參與睪丸發(fā)育過程[12,32]；在人宮頸癌中高表達的hsa_circRNA_101996可充當miRNA-8075的海綿來促進TPX2基因的表達，進而促進宮頸癌細胞的增殖和侵襲，說明hsa_circRNA_101996有促進宮頸癌的作用[33].

4.2 circRNA調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄

諸多研究表明，位于細胞核的circRNA可以調(diào)控其母基因的轉(zhuǎn)錄進而影響母基因的表達.人體細胞ankrd52基因序列中存在內(nèi)含子環(huán)化依賴的motif，該基因可轉(zhuǎn)錄出一個circRNA，即ci-ankrd52，能夠與RNA聚合酶II結(jié)合，進而促進ankrd52基因的轉(zhuǎn)錄[25-26]；由EIF3J(eukaryotic translation initiation factor 3J)基因轉(zhuǎn)錄出的circRNA，即EIciEIF3J，與U1小核核糖核蛋白(U1 small nuclear ribonucleoprotein，U1 snRNP)結(jié)合，然后EIciEIF3J-U1 snRNP復合體轉(zhuǎn)移并結(jié)合到EIF3J基因的啟動子區(qū)域，從而激活EIF3J基因的轉(zhuǎn)錄[26,34].

4.3 circRNA作為翻譯模板

circRNA作為哺乳動物基因組中一類轉(zhuǎn)錄本，已有報道發(fā)現(xiàn)一些circRNA可作為翻譯模板并生成執(zhí)行生物學功能的蛋白質(zhì).Zhang等[35]發(fā)現(xiàn)P53誘導轉(zhuǎn)錄長鏈非編碼RNA(LINC-PINT)的第二外顯子可形成circRNA(circPINTexon2)，分析circPINTexon2所有可能的開放閱讀框，推測circPINTexon2有2個sORFs具有潛在編碼67aa和87aa的肽，試驗結(jié)果證實只有87aa肽能夠正常表達，還發(fā)現(xiàn)在RNA circ-PINT以及翻譯的87aa蛋白在癌癥(如乳腺癌、肝癌)中低表達，而在正常組織中高表達.裸鼠體內(nèi)成瘤試驗也表明，PINT87aa高表達時成瘤能力減弱，動物的生存期延長，說明該circ-PINT編碼的肽產(chǎn)物可能在惡性腫瘤的治療、診斷、預后方面發(fā)揮重要調(diào)控功能；Yang等[36]發(fā)現(xiàn)著名的抑癌基因FBXW7的第3及第4外顯子環(huán)化后可形成一個620 nt的circRNA，即circ-FBXW7，該circRNA序列中存在內(nèi)部核糖體插入位點序列(internal ribozyme entry site，IRES)，推測可能具有編碼蛋白質(zhì)的潛能，雙熒光素酶試驗發(fā)現(xiàn)其可編碼185個氨基酸，這些氨基酸形成的蛋白質(zhì)的分子量約為21 ku，circ-FBXW7產(chǎn)生的蛋白質(zhì)具有抑制膠質(zhì)瘤的作用，可能會作為膠質(zhì)瘤患者的臨床預后的一個分子標記物；Zhang等[37]對神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和鄰近正常組織進行了circRNA-Seq，有5 498個circRNA存在顯著差異(FDR ≤ 0.01，fold-change ≥ 2)，其中circ-SHPRH長度為440 nt，該序列包含IRES元件，進一步使用分子克隆、質(zhì)譜等試驗發(fā)現(xiàn)，circ-SHPRH可翻譯出一個包含146個氨基酸的17 ku多肽產(chǎn)物，此外研究還發(fā)現(xiàn)circ-SHPRH序列中的ORF是跨過接口后形成終止密碼子的，終止密碼子和起始密碼子同時用了一個A堿基，circ-SHPRH生成的蛋白質(zhì)具有抑制膠質(zhì)瘤的作用，高表達circ-SHPRH蛋白產(chǎn)物的病人預后較好.

5 circRNA在豬上的研究進展

5.1 在大腦上的研究進展

2015年Veno等[38]采集第23天、第42天、第60天、第80天、第100天、第115天的豬胎兒腦組織，包括基底核(basal ganglia)、腦干(brain stem)、小腦(cerebellum)、皮質(zhì)(cortex)和海馬(hippocampus))樣本進行去核糖體RNA的cDNA文庫構(gòu)建，然后用高通量測序技術(shù)挖掘出了4 634個circRNA，大部分circRNA在第60天胎兒豬皮質(zhì)組織中有很高的豐度，呈現(xiàn)出明顯的差異表達趨勢，相比較于第80天、第60天胎兒豬皮質(zhì)組織中差異高表達circRNA的母基因(host gene)富集的前3名信號通路為Wnt、Axon guidance和TGF-beta，已證實這3條信號通路與神經(jīng)分化、神經(jīng)細胞遷移有關(guān)，說明這些差異表達circRNA在豬胚胎大腦發(fā)育的生物學過程中發(fā)揮著重要調(diào)控功能；Chen[39]研究了180日齡和8歲‘Yana豬’的大腦皮質(zhì)，共發(fā)現(xiàn)了9 541個circRNA，180日齡和8歲‘Yana豬’大腦皮質(zhì)共享2 091個circRNA，180日齡豬大腦皮質(zhì)特異circRNA有1 793個，而8歲豬大腦皮質(zhì)特異circRNA有5 657個，有148個差異表達circRNA(包括133個上調(diào)表達和15個下調(diào)表達)，發(fā)現(xiàn)了一些與豬大腦皮質(zhì)衰老密切相關(guān)的circRNA，如circRNA019168、circRNA008099、circRNA009918，表明circRNA參與豬大腦皮質(zhì)老化過程.

5.2 在肌肉上的研究進展

2014年馬繼登等[40]使用高通量測序技術(shù)從豬腰大肌和背最長肌中發(fā)現(xiàn)了56個circRNA，這些circRNA轉(zhuǎn)錄本長度分布不均，最長的為3 9645 nt，最短的是105 nt，48.12%的circRNA長度在6 000 nt以內(nèi)，此外，42個circRNA均有超過50個miRNA靶點，表明鑒定出的circRNA可能通過吸附miRNA參與調(diào)控豬肌肉的發(fā)育過程；2017年Sun等[41]在‘長白豬’和‘藍塘豬’背最長肌中分別鑒定到了3 826個、2 300個circRNA，共享的circRNA有916個，差異表達circRNA有4 360個，包括1 401個上調(diào)表達和2 959個下調(diào)表達，其中236個差異表達circRNA有93個與肌肉發(fā)育相關(guān)的基因編碼，表明circRNA參與調(diào)控肌肉發(fā)育過程，且對不同類型的豬肉品質(zhì)有影響；Chen等[42]研究了180日齡和8歲‘Yana豬’的心肌和骨骼肌，心肌和骨骼肌中分別發(fā)現(xiàn)了7 090及4 402個circRNA，180日齡與8歲‘Yana豬’心肌相比，有26個差異表達circRNA，180日齡與8歲‘Yana豬’骨骼肌相比，有62個差異表達circRNA，發(fā)現(xiàn)了一些與豬心肌和骨骼肌衰老密切相關(guān)的circRNA，如circRNA010618、circRNA005698、circRNA010340、circRNA003476，表明circRNA參與豬心肌和骨骼肌老化過程；Wang等[2]利用RNA-Seq方法研究了瘦肉型豬(杜長大)和脂肪型豬(Huainan)背最長肌中的circRNA，共檢測出了6 988個circRNA，其中有66個差異表達(32個上調(diào)表達和34個下調(diào)表達)，差異表達的circRNA主要富集在與骨骼肌發(fā)育及生長有關(guān)的GO功能和KEGG信號通路，如快慢肌轉(zhuǎn)化、細胞遷移等GO功能及Wnt等KEGG信號通路，表明circRNA參與豬背最長肌的生長.

5.3 在肝臟上的研究進展

Huang等[43]采集70日齡‘長白豬’和‘金華豬’肝臟組織進行了轉(zhuǎn)錄組測序，2種豬肝臟中共挖掘到了84 864個circRNA，共表達的circRNA有42 041個，差異表達circRNA有366個(包括116個上調(diào)和250個下調(diào))，這些差異表達circRNA主要富集在與脂肪代謝相關(guān)中信號通路上，表明circRNA調(diào)控了豬只的脂肪代謝；Chen等[44]研究了180日齡和8歲‘Yana豬’的肝臟，共發(fā)現(xiàn)了6 366個circRNA，180日齡和8歲‘Yana豬’肝臟共享1 074個circRNA，180日齡豬肝臟特異有circRNA有845個，而8歲豬肝臟特異circRNA有4 447個，發(fā)現(xiàn)了一些與豬肝臟衰老密切相關(guān)的circRNA，如circRNA020421、circRNA017214、circRNA006616，表明circRNA參與豬肝臟老化過程.

5.4 在脂肪上的研究進展

2019年Liu等[45]研究了‘二花臉豬’背最長肌內(nèi)脂肪(IAT)、背皮下脂肪(SAT)、腹膜脂肪(RPAT)和腸系膜脂肪(MAT)組織中的circRNA，4種不同部位的脂肪中共發(fā)現(xiàn)了13 746個circRNA，特異性表達的circRNA分別有3 386個、1 123個、1 332個和2 466個，差異表達circRNA共有3 176個，其中IAT與SAT有1 367個、IAT與RPAT有1 007、個、SAT與RPAT有999個、MAT與IAT有1 153個、MAT與SAT有1 256個、MAT與RPAT有837個，篩選出了一批與脂肪沉積及脂質(zhì)代謝有關(guān)的circRNA，如SAT中高表達的circ_0004917與circ_0007488、IAT中低表達的circ_0010483及高表達的circ_0007945，表明circRNA參與豬的脂肪沉積及脂質(zhì)代謝過程；李嬡等[46]使用高通量測序技術(shù)從180日齡‘大白豬’和‘萊蕪豬’背最長肌內(nèi)脂肪組織中發(fā)現(xiàn)了9 649個circRNA，差異表達circRNA有181個，包括上調(diào)表達102個和下調(diào)表達79個，這些差異表達circRNA富集的GO功能有膽固醇平衡、脂質(zhì)代謝平衡、甘油酯平衡等，富集的KEGG信號通路有過氧化物酶體、脂肪酸降解、不飽和脂肪酸的生物合成等，還鑒定出了參與脂肪沉積有關(guān)的2個circRNA，即ssc_circ_0002807和ssc_circ_0009352，該研究表明鑒定出的circRNA可能參與調(diào)控脂質(zhì)沉積和脂質(zhì)代謝；2018年Liu等[47]對‘Erhualian豬’的不同分化時間點(0、2、4和8 d)皮下前體脂肪細胞進行了circRNA分析，共鑒定出了8 623個circRNA，第2天與第0天、第4天與第2天、第8天與第4天、第4天與第0天和第8天與第0天各有902、787、710、932、850個差異表達circRNA，此外，發(fā)現(xiàn)了與皮下脂肪細胞分化最密切相關(guān)的297個差異表達circRNA，這些circRNA富集的GO功能有脂質(zhì)代謝調(diào)控、脂肪酸代謝過程等，該研究表明circRNA對豬皮下脂肪細胞分化及脂肪生成的生物學過程；2018年Li等[48]利用RNA-Seq技術(shù)研究了‘大白豬’和‘萊蕪豬’皮下脂肪組織中的circRNA，共檢測出了29 763個circRNA，其中275個差異表達(70個上調(diào)表達和205個下調(diào)表達)，差異表達的circRNA主要富集在了與脂肪沉積、脂質(zhì)代謝有關(guān)的GO功能和信號通路，如脂質(zhì)儲存的負調(diào)控、甘油三酯代謝、脂肪酸代謝、脂肪酸合成等GO功能及PPAR、TGF-β、MAPK等信號通路，并篩選出了兩個與脂肪沉積及脂質(zhì)代謝最密切相關(guān)的circRNA(circRNA_26852和circRNA_11897)，表明circRNA對豬的脂肪沉積及脂質(zhì)代謝有潛在影響，可用于豬的遺傳育種；左小元等[49]對‘長白豬’的脂肪干細胞(pADSCs)及誘導形成的完全重編程細胞(piPSCs)中的circRNA進行了解析，共鑒定到了27 005個circRNA，piPSCs和pADSCs共表達的circRNA有6 983個，特異性表達的circRNA有13 138個、6 884個，其中差異表達的circRNA有243個，包括上調(diào)表達的155個和下調(diào)表達的88個，差異表達circRNA共富集了137個KEGG信號通路，其中顯著富集的有22個，如MAPK、p53，這些通路與細胞多能性密切相關(guān)，說明差異表達circRNA可能參與了誘導豬脂肪干細胞形成豬完全重編程細胞這一生物學過程.

5.5 在生殖器官上的研究進展

2017年Ran等[50]對30和180日齡‘沙子嶺豬’的睪丸組織進行了測序，在未成熟和成熟睪丸中共鑒定出了14 108個circRNA，未成熟和成熟睪丸中共表達的circRNA有3 220個，特異性表達的circRNA有2 819和8 069個，差異表達circRNA有12 274個(包括3 510個上調(diào)和8 764個下調(diào))，這些差異表達circRNA主要富集在與睪丸發(fā)育、精子形成的信號通路上，如MAPK、Wnt、PI3K-Akt、Hedgehog信號通路，表明circRNA在睪丸成熟過程中發(fā)揮著重要功能；2019年謝蘇等[51-52]使用RNA-Seq技術(shù)對卵泡中的circRNA進行了研究，發(fā)現(xiàn)circ0001651在‘杜洛克豬’M2卵泡中的表達量極顯著低于‘梅山豬’，在‘梅山豬’M1卵泡中的表達量極顯著低于‘杜洛克豬’，circ0001651的潛在靶基因CCR2、EGFL7、TNFRSF12A等與豬的卵泡發(fā)育過程相關(guān)，此外還發(fā)現(xiàn)circ0015292在杜洛克豬S卵泡中的表達量極顯著低于‘梅山豬’，在‘梅山豬’M1、M2、L卵泡中的表達量均顯著低于杜洛克豬，circ0015292的潛在靶基因GADD45G、IL20RB、CFL1、LAMB3等與豬的卵泡發(fā)育過程相關(guān)，說明circ0001651和circ0015292可能調(diào)控靶基因間接參與卵泡發(fā)育過程，該研究為探究豬繁殖的分子機理提供了新視角；Hu等[53]采用RNA-Seq技術(shù)，分別對黃體期和卵泡期的高產(chǎn)仔數(shù)和低產(chǎn)仔數(shù)大白母豬卵巢組織circRNA進行了研究，共發(fā)現(xiàn)了21 386個circRNA，黃體期高產(chǎn)和低產(chǎn)組之間有1 079個差異表達circRNA(458個上調(diào)，621個下調(diào))，卵泡期鑒定到1 077個差異表達circRNA(347上調(diào)和730個下調(diào))，2個對比組間獲得了91個共有的差異表達circRNA，這些差異表達circRNA的母系基因大多顯著富集到與繁殖相關(guān)信號通路中，其中在黃體期主要富集到類固醇生物合成、FOXO、甲狀腺激素信號通路，而在卵泡期則主要富集到TGF-β、細胞周期和Wnt等信號通路，該研究發(fā)現(xiàn)circRNA參與調(diào)控了豬繁殖過程.

5.6 在豬感染性疾病上的研究進展

2018年Yan等[54]研究了C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染仔豬的脾臟組織中的circRNA表達譜，感染組和對照組共鑒定到了825個，其中有103個差異表達(50個上調(diào)表達和53個下調(diào)表達)，差異表達的circRNA主要富集在與免疫應答、炎癥反應有關(guān)的KEGG信號通路，如TNF、B細胞受體、NF-κB、凋亡、Toll-like受體信號通路，發(fā)現(xiàn)了與仔豬感染C型產(chǎn)氣莢膜梭菌密切相關(guān)的8個circRNA，包括circ_0002220、circ_0000821和circ_0002287，表明circRNA通過調(diào)節(jié)與免疫相關(guān)的信號通路進而影響仔豬感染C型產(chǎn)氣莢膜梭菌；2019年Chen等[55]研究了豬流行性腹瀉病毒感染豬腸上皮細胞(IPEC-J2)后circRNA表達譜，感染組和對照組共鑒定到了26 670個，36 h感染組與對照組相比，存在152個上調(diào)表達和158個下調(diào)表達circRNA，60 h感染組與對照組相比，存在191個上調(diào)表達和226個下調(diào)表達circRNA，72 h感染組與對照組相比，存在152個上調(diào)表達和199個下調(diào)表達circRNA，這些差異表達circRNA富集的GO功能主要有轉(zhuǎn)運活性、催化活性等，富集的KEGG信號通路有T細胞受體、MAPK等，表明circRNA可能通過調(diào)節(jié)與免疫相關(guān)的生物過程、信號通路進而影響豬流行性腹瀉病毒在IPEC-J2中的復制，本研究為探索circRNA在豬流行性腹瀉病毒感染機制中的作用提供了參考；2018年Ma等[56]對感染及未感染豬傳染性胃腸炎病毒的IPEC-J2細胞的circRNA進行了研究，差異表達circRNA有123個，包括上調(diào)表達69個和下調(diào)表達54個，富集的KEGG信號通路主要有RIG-I-like receptor，TNF，NOD-like receptor和NF-κB等，挖掘出了一個與豬傳染性胃腸炎病毒感染IPEC-J2關(guān)鍵circRNA，即ssc_circ_000380，發(fā)現(xiàn)ssc_circ_009380分子參與豬傳染性胃腸炎病毒激活NF-κB信號通路的過程.

5.7 在豬circRNA數(shù)據(jù)庫上的研究進展

2017年Liang等[57]使用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對240日齡貴州小型豬的9種器官(包括心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、卵巢、睪丸、背最長肌和脂肪)及2個不同發(fā)育階段(0和30日齡)的背最長肌進行了研究，共發(fā)現(xiàn)了5 934個circRNA，在240日齡豬只9種器官中均表達的circRNA有37個，這9個器官中特異性表達的circRNA有205、53、0、130、99、94、1 155、174和147個，0、30和240日齡背最長肌中共表達的circRNA有126個，說明circRNA對仔豬各器官的正常發(fā)育起至關(guān)重要的作用，該研究首次構(gòu)建了豬不同器官的circRNA數(shù)據(jù)庫(http://lnc.rnanet.org/circ/)，該數(shù)據(jù)庫的建立極大地方便了人類深入探究豬器官發(fā)育的生物學過程.

6 展望

circRNA作為一類新發(fā)現(xiàn)的分子，諸多學者對其形成機制、功能等做了大量研究，取得了一系列研究成果，但有關(guān)豬circRNA的研究較少，僅對不同生長發(fā)育階段、不同品種等豬組織及器官(如肌肉、脂肪、肝臟)進行了高通量測序，挖掘出了一些與豬經(jīng)濟性狀(如肌肉發(fā)育、脂肪沉積)密切相關(guān)的circRNA，具有廣闊的應用前景.由于此方面的研究時間短，還需要繼續(xù)完善豬的基因組，提高豬的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析水平及采用試驗手段找到和鑒定更多的circRNA，并探究其發(fā)揮功能的分子機制.此外，如何將這些高通量測序數(shù)據(jù)整合成可供查閱及分析的綜合數(shù)據(jù)庫是一件急需開展的事情.因此，繼續(xù)開展豬重要經(jīng)濟性狀相關(guān)circRNA的功能和調(diào)控機制研究對豬的遺傳改良具有重要的參考意義.