阿帕替尼聯(lián)合多西紫杉醇對卵巢癌干細胞的影響及其作用機制

甘蕾，黃雅可，黃燕，謝榮凱

(陸軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400037)

卵巢癌作為目前致死率較高的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，具有起病隱匿、進展快速等特點。目前，提高卵巢癌患者生存率的方式仍以盡早發(fā)現(xiàn)、盡早手術切除并輔以化療為主[1]。但相關研究顯示，化療藥物可導致難以耐受的不良反應及化療過程中產(chǎn)生的耐藥性，疾病治愈率較低、復發(fā)率較高，嚴重影響患者預后[2-3]。阿帕替尼是抗腫瘤血管生成的靶向治療藥物，多西紫杉醇是新一代紫杉類化合物抗腫瘤藥物，兩者目前已被用于乳腺癌、肺癌、胃癌等多種惡性腫瘤的臨床治療，效果良好[4-6]，部分學者將其應用于卵巢癌的治療，并取得了一定的臨床療效[7-8]，但具體作用機制尚不明確。近年來，隨著卵巢癌發(fā)生、發(fā)展研究的不斷深入，部分學者發(fā)現(xiàn)，占卵巢癌發(fā)病率80%～90%的上皮來源卵巢癌是一種干細胞相關性腫瘤，其中分離中的卵巢癌干細胞與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)、耐藥等密切相關[9-11]。而對卵巢癌干細胞的生物學特性、相關信號通路、靶向定位等的深入研究為此類患者的臨床治療提供了更多有價值的理論依據(jù)[12-13]。本研究主要分析阿帕替尼聯(lián)合多西紫杉醇對卵巢癌干細胞的影響及其作用機制，以期為卵巢癌的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料 人卵巢漿液性乳頭狀腺癌細胞(SKOV3)株由陸軍軍醫(yī)大學附屬新橋醫(yī)院中心實驗室提供；阿帕替尼(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號：180102KC，二甲基亞砜溶解后使用)、多西紫杉醇(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號：180406AF，二甲基亞砜溶解后使用)；重組人堿性成纖維細胞生長因子(美國Pepro Tech公司生產(chǎn)，批號：AF-100-18B)、重組人表皮生長因子(美國Pepro Tech公司生產(chǎn)，批號：AF-100-15)；達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)/F12培養(yǎng)基(美國Hyclone公司生產(chǎn)，批號：SH300023)；胎牛血清(批號：11011-6123)、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、 Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒、RIPA蛋白裂解液(美國Gibco公司生產(chǎn))；兔Oct-4單抗、兔CD133單抗、兔Nanog單抗、兔上皮鈣黏素(E-cadhefin)單抗、兔波形蛋白(Vimentin)單抗、兔扭曲蛋白(Twist)單抗、兔甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)單抗(英國Abcam公司生產(chǎn))；流式凋亡檢測試劑盒、Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(real time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)試劑盒(日本TaKaRa公司生產(chǎn))；引物設計及合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；4 ℃低溫高速離心機(德國Beckman公司)；酶標儀、流式細胞儀(美國Molecular Devices公司)。

1.2細胞培養(yǎng)

1.2.1SKOV3細胞的復蘇與傳代 ①用紫外線照射超凈工作臺臺面30 min 后，迅速取出液氮中的人卵巢癌SKOV3細胞凍存管，并置于37 ℃恒溫水浴箱中快速解凍；②待其完全融解后用移液器吹打細胞液使細胞分散，并將細胞液置于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基內(nèi)混勻，放在37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；③待細胞貼壁生長良好、融合度達80%左右時，去除培養(yǎng)液，加入0.25%胰蛋白酶潤洗，再次加入適量胰蛋白酶，待光學顯微鏡下觀察細胞折光性增強且出現(xiàn)明顯細胞間隙時吸去胰蛋白酶，加入10%胎牛血清終止胰蛋白酶消化；④吸管吹打液體至細胞形成懸液后，以離心半徑10 cm，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌2次，將細胞重懸于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基內(nèi)混勻；⑤計數(shù)板計數(shù)后，以2×105個/mL的細胞密度分別接種于新的培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，隔天更換1次培養(yǎng)基，行傳代培養(yǎng)。

1.2.2卵巢癌干細胞樣細胞的培養(yǎng)及傳代 ①取對數(shù)生長期SKOV3細胞，更換新鮮培養(yǎng)液1 d后，按1.2.1所述方式進行細胞消化制備細胞懸液，以離心半徑10 cm，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌2次，將細胞懸于無血清培養(yǎng)基(DMEM/F12培養(yǎng)基+重組人表皮生長因子20 ng/mL+重組人堿性成纖維細胞生長因子10 ng/mL+胰島素5 μg/mL配置而成)中；②計數(shù)板計數(shù)后，以2×105個/mL的細胞密度分別接種于新的培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，隔天補充0.25 mL無血清培養(yǎng)基；③7～10 d后收集懸浮球細胞，以離心半徑10 cm，800 r/min離心2 min，棄上清，機械吹打，PBS洗滌1次，將細胞懸液重懸于無血清培養(yǎng)基中；④計數(shù)板計數(shù)后，以2×105個/mL的細胞密度分別接種于新的培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，隔天補充0.25 mL無血清培養(yǎng)基；⑤6～8 d后，進行1∶2傳代擴增培養(yǎng)；⑥培養(yǎng)7 d后取干細胞樣細胞，PBS洗滌2次后，在含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至細胞融合度達80%左右時進行消化(同1.2.1)，并重新接種于無血清培養(yǎng)基中。

1.3卵巢癌干細胞的鑒定 qRT-PCR法檢測卵巢癌干細胞相關標志基因Oct-4、CD133及Nanog的表達。具體步驟如下：①取SKOV3貼壁細胞及傳代培養(yǎng)至第7代的SKOV3干細胞樣細胞，以離心半徑10 cm，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌1次，加入Trizol，移液槍吹打至細胞全部裂解后靜置5 min，加入Trizol及氯仿作用5 min；② 4 ℃、離心半徑10 cm、12 000 r/min離心15 min，取上層信使RNA(messenger RNA，mRNA)，加入Trizol及異丙醇靜置10 min；③ 4 ℃、離心半徑10 cm、12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入75%乙醇洗滌；④ 4 ℃、離心半徑10 cm、9 000 r/min離心10 min，棄上清，吹干；⑤加焦碳酸二乙酯水溶解、重懸后，60 ℃作用10 min；⑥取少量mRNA，檢測其在260 nm及280 nm波長的光密度(optical density，OD)值，若A260/A280值為1.8～2.0視為mRNA提取合格；⑦按照qRT-PCR試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成互補DNA，內(nèi)參采用GAPDH，結(jié)果使用公式F=2-ΔΔCt轉(zhuǎn)換。Oct-4引物序列為F：GGCCCGAAAGAGAAAGCGAACC，R：ACCCAGCAG-CCTCAAAATCCTCTC；CD133引物序列為F：TGGA-TGCAGAACTTGACAACGT，R：ATACCTGCTACGACAGTCGTGGT；Nanog引物序列為F：TTCCTTCCTCCATGGATCTC，R：TCTGCTGGAGGCTGAGGTAT；GAPDH引物序列為F：CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT，R：AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC，實驗重復3次，取平均值。

1.4四甲基偶氮唑鹽比色法檢測細胞增殖 將第7代SKOV3干細胞樣細胞經(jīng)胰蛋白酶消化重新形成單細胞懸液后分為對照組、5 μg/mL組、10 μg/mL組、20 μg/mL組、40 μg/mL組、80 μg/mL組，將細胞濃度為6×104個/mL的干細胞分別接種于96孔板中(每組設定5個復孔)培養(yǎng)24 h；對照組僅加入無血清培養(yǎng)基，其他各組分別加入相應濃度的阿帕替尼后置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h；培養(yǎng)后，每孔加20 μL MTT孵育4 h，棄培養(yǎng)基后每孔加150 μL二甲基亞砜。最后用酶標儀測定OD值(450 nm)，計算細胞增殖抑制率及半數(shù)抑制濃度(IC50，經(jīng)計算為58.98 μg/mL，后續(xù)實驗藥物濃度取整數(shù)值60 μg/mL)，增殖抑制率(%)=(1-藥物作用組OD值/對照組OD值)×100%。

1.5流式細胞術檢測細胞凋亡情況 將第7代SKOV3干細胞樣細胞經(jīng)胰蛋白酶消化重新形成單細胞懸液后分為對照組、阿帕替尼組、多西紫杉醇組與聯(lián)合組，將細胞濃度為5×105個/mL的干細胞分別接種于96孔板中(每組設定5個復孔)，對照組僅加入無血清培養(yǎng)基，阿帕替尼組加入無血清培養(yǎng)基和阿帕替尼(60 μg/mL)，多西紫杉醇組加入無血清培養(yǎng)基和多西紫杉醇(60 μg/mL)，聯(lián)合組加入無血清培養(yǎng)基、阿帕替尼(60 μg/mL)和多西紫杉醇(60 μg/mL)，作用48 h后，以離心半徑10 cm、2 000 r/min離心5 min，胰蛋白酶消化后，以2 000 r/min、離心半徑10 cm離心5 min，棄上清，PBS洗滌2次，以離心半徑10 cm、2 000 r/min離心5 min，棄上清。按照流式磷脂結(jié)合蛋白V-熒光基團異硫氰酸熒光素/碘化丙啶雙染細胞凋亡檢測試劑盒說明書檢測，F(xiàn)lowjo軟件分析處理。

1.6Transwell細胞遷移實驗檢測細胞侵襲遷移情況 4組干細胞同1.5所述方式加入培養(yǎng)基及藥物作用48 h后，每個Transwell小室的上室加入200 μL各組細胞懸液(細胞濃度均為25×104個/mL)，下室加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基(侵襲實驗還需預先在小室內(nèi)鋪Matrigel基質(zhì)膠)；將Transwell小室放入24孔板中，置入37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其中遷移實驗培養(yǎng)16 h，侵襲實驗培養(yǎng)48 h；取出Transwell，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，用棉簽輕輕擦去內(nèi)層未遷移細胞，將小室倒置于載玻片上，于正置顯微鏡下隨機選取4個視野計算穿膜細胞數(shù)(每組設定5個復孔，觀察4個視野，即20個復孔的情況)。

1.7qRT-PCR法檢測E-cadhefin、Vimentin及Twist mRNA的表達水平 4組干細胞按1.5所述方式加入培養(yǎng)基及藥物作用48 h后，Trizol法提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄合成互補DNA、檢測E-cadhefin、Vimentin及Twist mRNA表達水平(方法同1.3)。E-cadhefin引物序列為F：CTGGACGCTCGGGCCTGAAGT，R：GGGTCAGTATCAGCCGCTTT；Vimentin引物序列為F：ACAGGCTTTAGCGAGTTATT，R：GGGCTCCTAGCGGTTTAG；Twist引物序列為F：TGTCCGCGTCCCACTAGC，R：TG-TCCATTTTCTCCTTCTCTGGA。

1.8Western blotting法檢測E-cadhefin、Vimentin及Twist蛋白的表達水平 4組干細胞同1.5所述方式加入培養(yǎng)基及藥物作用48 h后，加入細胞裂解液冰浴15 min，以離心半徑10 cm、12 000 r/min離心15 min后，提取總蛋白，并采用BCA法測定總蛋白濃度。取蛋白上樣行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉后，分別加入GAPDH、E-cadherin、Vimentin、Twist一抗4 ℃孵育過夜；PBS洗滌3次，加入二抗，室溫孵育60 min；PBS洗滌3次，電化學發(fā)光顯影；最后用Image J圖像分析軟件檢測蛋白條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1卵巢癌干細胞的鑒定 SKOV3干細胞相關標志基因Oct-4、CD133及Nanog的表達水平顯著高于卵巢癌SKOV3貼壁細胞(P<0.05)，見表1。

表1 SKOV3干細胞與SKOV3貼壁細胞Oct-4、CD133及Nanog mRNA表達水平比較

2.2不同濃度阿帕替尼對卵巢癌干細胞的增殖抑制率比較 阿帕替尼濃度處于5～80 μg/mL時，隨著阿帕替尼濃度的增加，卵巢癌干細胞增殖抑制率明顯增高(P<0.01)，見表2，IC50值為58.98 μg/mL。

表2 不同濃度阿帕替尼對卵巢癌干細胞的增殖抑制率比較 (n=5)

2.3阿帕替尼及多西紫杉醇對卵巢癌干細胞凋亡的影響 對照組、阿帕替尼組、多西紫杉醇組、聯(lián)合組流式細胞術檢測的卵巢癌干細胞凋亡率分別為(5.58±1.55)%、(21.97±2.21)%、(21.70±2.26)%、(59.56±3.68)%，各組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=404.100，P<0.001)，與對照組比較，阿帕替尼組、多西紫杉醇組及聯(lián)合組卵巢癌干細胞凋亡率均明顯升高(P<0.05)，其中聯(lián)合組的卵巢癌干細胞凋亡率最高，見圖1。

2.4阿帕替尼及多西紫杉醇對卵巢癌干細胞侵襲、遷移的影響 4組卵巢癌干細胞穿膜細胞數(shù)比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，與對照組比較，阿帕替尼組、多西紫杉醇組及聯(lián)合組卵巢癌干細胞穿膜細胞數(shù)均明顯減少(P<0.05)，且聯(lián)合組卵巢癌干細胞穿膜細胞數(shù)少于阿帕替尼組和多西紫杉醇組(P<0.05)，見表3。

2.5阿帕替尼及多西紫杉醇對卵巢癌干細胞E-cadhefin、Vimentin及Twist mRNA表達的影響 各組卵巢癌干細胞E-cadhefin、Vimentin及Twist mRNA表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，與對照組比較，阿帕替尼組、多西紫杉醇組及聯(lián)合組卵巢癌干細胞E-cadhefin mRNA表達水平均顯著升高，聯(lián)合組高于阿帕替尼組、多西紫杉醇組(P<0.05)；與對照組比較，阿帕替尼組、多西紫杉醇組及聯(lián)合組卵巢癌干細胞Vimentin及Twist mRNA表達水平均顯著降低(P<0.05)，聯(lián)合組低于阿帕替尼組、多西紫杉醇組(P<0.05)。見表4。

2.6阿帕替尼及多西紫杉醇對卵巢癌干細胞E-cadhefin、Vimentin及Twist蛋白表達的影響 各組卵巢癌干細胞E-cadhefin、Vimentin及Twist蛋白表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，與對照組比較，阿帕替尼組、多西紫杉醇組及聯(lián)合組卵巢癌干細胞E-cadhefin蛋白表達水平均顯著升高，聯(lián)合組高于阿帕替尼組、多西紫杉醇組(P<0.05)；與對照組比較，阿帕替尼組、多西紫杉醇組及聯(lián)合組Vimention和Twist蛋白水平均降低，聯(lián)合組低于阿帕替尼組、多西紫杉醇組(P<0.05)，見表5、圖2。

FITC：異硫氰酸熒光素；PI：碘化丙啶；對照組：僅加入無血清培養(yǎng)基；聯(lián)合組：加入無血清培養(yǎng)基、阿帕替尼、多西紫杉醇圖1 對照組(1a)、阿帕替尼組(1b)、多西紫杉醇組(1c)、聯(lián)合組(1d)卵巢癌干細胞凋亡率流式細胞圖

表3 各組卵巢癌干細胞穿膜細胞數(shù)比較 (n=20，個，

表4 各組卵巢癌干細胞E-cadhefin、Vimentin及Twist mRNA表達水平比較

表5 各組卵巢癌干細胞E-cadhefin、Vimentin及Twist蛋白表達水平比較

E-cadhefin：上皮鈣黏素；Vimentin：波形蛋白；Twist：扭曲蛋白；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶圖2 各組卵巢癌干細胞E-cadhefin、Vimentin及Twist蛋白表達條帶圖

3 討 論

卵巢癌作為女性生殖系統(tǒng)致死率較高的惡性腫瘤，由于發(fā)病隱匿且缺乏有效的早期篩查手段，嚴重威脅著女性的生命健康。阿帕替尼作為一種特異性靶向血管內(nèi)皮生長因子受體2的小分子血管生成抑制劑，能夠高選擇性地結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子受體2胞內(nèi)酪氨酸ATP結(jié)合位點，阻斷其下游信號轉(zhuǎn)導通路，抑制腫瘤血管內(nèi)皮細胞的增殖，阻止腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤生長[14]。多西紫杉醇是新一代紫杉類抗腫瘤藥物，可通過加強微管蛋白聚合、抑制微管解聚破壞腫瘤細胞的有絲分裂，將腫瘤細胞阻滯在G2/M期，從而抑制腫瘤生長[15]，兩者對卵巢癌的治療均有一定的作用，但具體作用機制尚不完全明確。

卵巢癌干細胞作為腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、復發(fā)的根源，對卵巢癌高致死率、高復發(fā)率、高耐藥性等的研究具有重要意義。作為全能性或多能性干細胞標志物，Oct4在保持胚胎干細胞自我更新及全能性方面具有重要作用[16]；CD133為多種組織腫瘤干細胞表面獨立表達的特異性標記分子，可通過其表達水平分選干細胞、前體細胞和腫瘤干細胞[17]；Nanog是公認的腫瘤干細胞標志性基因，去除或使該基因失活能夠抑制腫瘤細胞增殖和侵襲[16]。本研究中，通過分離獲取的卵巢癌干細胞的Oct-4、CD133及Nanog mRNA的表達水平均明顯高于卵巢癌SKOV3貼壁細胞，可見獲取的卵巢癌干細胞質(zhì)量較佳，為后續(xù)的增殖、凋亡、侵襲遷移等實驗提供了基礎。經(jīng)增殖、凋亡、侵襲遷移等實驗研究發(fā)現(xiàn)，阿帕替尼為5～80 μg/mL時，隨著阿帕替尼濃度的增加，其對卵巢癌干細胞增殖的抑制作用明顯增強；與單純用藥相比，阿帕替尼與多西紫杉醇聯(lián)合應用可顯著促進卵巢癌干細胞的凋亡，抑制卵巢癌干細胞的侵襲及遷移。由此推測，增加卵巢癌干細胞的凋亡率可能是兩藥聯(lián)合應用協(xié)同抗癌的主要原因之一。

E-cadhefin作為一種鈣離子依賴的細胞黏附分子，不僅可參與細胞形態(tài)的維持，還可介導細胞間的同源性黏附，其表達水平下調(diào)會降低同源細胞間的黏附力，有利于腫瘤細胞脫離原發(fā)部位向細胞外基質(zhì)擴散[18-19]。Vimentin作為一種細胞骨架蛋白，可與胞質(zhì)中的整合素和膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1結(jié)合，下調(diào)細胞表面黏附分子的表達，為腫瘤細胞的遠處轉(zhuǎn)移提供有利條件[20-21]。Twist作為一種常染色體的堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子，能夠抑制E-cadhefin mRNA的轉(zhuǎn)錄，從而改變細胞形態(tài)，降低細胞黏附性，并能誘導細胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，增加腫瘤細胞的遷移及侵襲能力[22-23]。E-cadhefin、Vimentin、Twist均為上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要標志物，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮細胞惡性轉(zhuǎn)變的重要過程，即極性上皮細胞在部分因素作用下轉(zhuǎn)變成為運動能力較強的間葉性表皮細胞是上皮細胞惡性轉(zhuǎn)變的部分機制[24]。本研究結(jié)果顯示，阿帕替尼與多西紫杉醇聯(lián)合應用組細胞內(nèi)E-cadhefin的表達水平明顯升高，而Vimentin及Twist的表達水平明顯降低，推測E-cadhefin水平上調(diào)、Vimentin及Twist水平下調(diào)可能是阿帕替尼與多西紫杉醇聯(lián)合應用抑制卵巢癌干細胞侵襲及遷移的部分分子生物學作用機制，即阿帕替尼與多西紫杉醇聯(lián)合應用可能干預卵巢癌干細胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，進而抑制卵巢癌干細胞的侵襲及遷移，但其機制仍需進一步深入研究。

綜上所述，阿帕替尼聯(lián)合多西紫杉醇可顯著抑制卵巢癌干細胞的增殖、侵襲及遷移，并能促進卵巢癌干細胞的凋亡。