外周血Treg細(xì)胞與IDO檢測(cè)對(duì)慢性乙型肝炎病毒感染者罹患原發(fā)性肝癌的預(yù)測(cè)價(jià)值

蔡溪巍，孫世忠，王秋野，王沈峰

(1.遼寧省金秋醫(yī)院檢驗(yàn)科，沈陽 110016； 2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，沈陽 110034)

原發(fā)性肝癌(primary liver cancer，PLC)是臨床常見的惡性腫瘤之一，其惡性程度極高，為癌癥致死的主要原因之一，且乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染為PLC的首要致病因素。流行病學(xué)研究顯示，HBV感染的患者最終發(fā)展為肝癌的風(fēng)險(xiǎn)是未感染者的5～10倍[1-2]。臨床研究證實(shí)，隨著HBV感染治療手段的不斷提高，PLC的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)雖得到了顯著抑制，但尚不能完全消除，PLC治療手段的提高雖然改善了患者的生命質(zhì)量，但5年生存率并未明顯提高[3]。因此，早期篩查并診斷PLC仍是最有可能延長患者生存時(shí)間的有效手段。然而，目前常用的血清甲胎蛋白、腹部超聲檢測(cè)等篩查手段準(zhǔn)確率及敏感性并不理想，探尋新的PLC預(yù)測(cè)方法迫在眉睫。研究發(fā)現(xiàn)，抗腫瘤免疫應(yīng)答缺陷是HBV感染患者發(fā)展為肝癌的主要作用機(jī)制之一，且具有免疫調(diào)節(jié)功能的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg細(xì)胞)、吲哚胺2，3-雙加氧酶(indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)可能與腫瘤免疫逃逸密切相關(guān)，參與惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[4-5]。王星月等[6]的研究顯示，PLC患者Treg細(xì)胞、IDO水平均較HBV感染者及健康人群明顯升高；程源[7]的研究顯示，Treg細(xì)胞、IDO與HBV感染發(fā)展為肝癌密切相關(guān)。但有關(guān)Treg細(xì)胞與IDO檢測(cè)對(duì)慢性HBV感染者罹患PLC預(yù)測(cè)價(jià)值的報(bào)道較少。本研究旨在分析外周血Treg細(xì)胞與IDO檢測(cè)對(duì)慢性HBV感染者罹患PLC的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2019年12月遼寧省金秋醫(yī)院收治的188例慢性HBV感染者作為研究對(duì)象，其中84例單純慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者作為CHB組，104例合并PLC患者作為PLC組，選取同期60名健康體檢者作為對(duì)照組。其中，CHB組男45例、女39例，年齡27～67歲，平均(42±15)歲；PLC組男59例、女45例，年齡22～74歲，平均(43±15)歲；對(duì)照組男33名、女27名，年齡26～71歲，平均(43±15)歲。三組受試者的性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)遼寧省金秋醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均簽署了知情同意書。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①CHB患者符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》[8]中CHB的診斷標(biāo)準(zhǔn)，乙型肝炎表面抗原和(或)HBV DNA陽性，且持續(xù)時(shí)間在6個(gè)月以上，伴有肝功能異常及丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶>38 IU/L；②PLC患者符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版)》[9]中PLC的診斷標(biāo)準(zhǔn)，乙型肝炎表面抗原陽性且甲胎蛋白≥400 μg/L；③年齡18～75歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并心、肺、腎等重要臟器功能障礙；②合并惡性腫瘤、脂肪肝、卵巢囊腫等可影響本研究結(jié)果的疾?。虎酆喜⑺幬镄愿窝?、酒精性肝病、其他類型病毒性肝炎、自身免疫性肝病；④處于月經(jīng)期、妊娠期或哺乳期女性。

1.3主要試劑與儀器 鼠抗人單克隆抗體CD4-CP(批號(hào)：P0116057)、CD25-PE(批號(hào)：P0140484)、CD127-FITC(批號(hào)：P011537)購自北京靈寶科技有限公司生產(chǎn)；流式細(xì)胞儀(型號(hào)：EPICS XL)由美國Beckman Instruments公司生產(chǎn)；高速離心機(jī)(型號(hào)：Allegra 21R)由美國Beckman公司生產(chǎn)；Trizol試劑(批號(hào)：17694-031)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：RR047A)、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒(批號(hào)：RR420A)購自日本TaKaRa公司；引物設(shè)計(jì)及合成由生工生物工程(上海)股份有限公司生產(chǎn)。

1.4檢測(cè)方法

1.4.1Treg細(xì)胞 抽取各組受試者晨起空腹靜脈血3 mL，在100 μL抗凝全血中加入5 μL鼠抗人單克隆抗體(CD4-CP、CD25-PE、CD127-FITC)混勻，室溫下避光孵育15 min；加入1 mL溶血素混勻，室溫下避光作用12 min；以離心半徑15 cm、1 500 r/min離心5 min，棄上清后，加入2 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)；離心半徑15 cm、1 500 r/min離心5 min，棄上清后，再次加入300 μL PBS重懸細(xì)胞；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Treg細(xì)胞水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，并用Flowjo軟件分析處理。

1.4.2IDO 信使RNA(messenger RNA，mRNA) 抽取各組受試者晨起空腹靜脈血5 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管內(nèi)，加入淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll-Paque)22 ℃、離心半徑10 cm、3 300 r/min密度梯度離心20 min，獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞；離心半徑15 cm、1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌后，加入Trizol至細(xì)胞全部裂解后靜置5 min，加入Trizol及氯仿作用5 min；4 ℃、離心半徑10 cm、12 000 r/min離心15 min，取上層mRNA，加入Trizol及異丙醇作用10 min；4 ℃、離心半徑10 cm、12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入75%乙醇洗滌；4 ℃、離心半徑10 cm、9 000 r/min離心10 min，棄上清，吹干；加入二乙基焦碳酸酯水溶解、重懸后，60 ℃作用10 min，獲取總mRNA(A260/A280值為1.8～2.0視為mRNA提取合格)；按照實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA，內(nèi)參采用β-Actin，結(jié)果使用公式F=2-△△Ct轉(zhuǎn)換，IDO引物序列：上游5′-TTAATGTAACCCAACAAGAG-3′，下游5′-GTATTAGTTTGTGGCTCTGT-3′；β-Actin引物序列：上游5′-CCTCGCCTTTGCCGATCC-3′，下游5′-GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC-3′。

2 結(jié) 果

2.1三組受試者外周血Treg細(xì)胞及IDO mRNA水平比較 三組受試者外周血Treg細(xì)胞及IDO mRNA水平

比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，CHB組和PLC組外周血Treg細(xì)胞及IDO mRNA水平均顯著高于對(duì)照組，且PLC組高于CHB組(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 三組受試者外周血Treg細(xì)胞及IDO mRNA水平比較

2.2外周血Treg細(xì)胞及IDO mRNA水平與HBV感染嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，外周血Treg細(xì)胞及IDO mRNA水平與HBV感染嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(r=0.397、r=0.425，均P<0.001)。

2.3外周血Treg細(xì)胞及IDO mRNA在CHB患者罹患PLC中的預(yù)測(cè)價(jià)值分析 外周血Treg細(xì)胞預(yù)測(cè)CHB患者罹患PLC的AUC為0.815(95%CI0.703～0.928)，臨界值為9.31%時(shí)，靈敏度為86.5%，特異度為72.2%；外周血IDO mRNA預(yù)測(cè)CHB患者罹患PLC的AUC為0.818(95%CI0.703～0.934)，臨界值為2.38時(shí)，靈敏度為87.4%，特異度為71.3%。見圖2。

3 討 論

HBV感染是我國主要的病毒感染類型，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)顯示，我國HBV攜帶者約1.2億[10]。臨床研究證實(shí)，HBV感染是引發(fā)PLC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，患者感染HBV后易逐漸發(fā)展為PLC，且大部分PLC患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已進(jìn)展為中晚期[11]。因此，尋找一種較為理想的PLC早期篩查方法，對(duì)改善患者預(yù)后、延長患者生存期具有重要意義。近年來有研究提出，抗腫瘤免疫應(yīng)答缺陷與HBV感染患者發(fā)展為肝癌的主要作用機(jī)制密切相關(guān)，且證實(shí)Treg細(xì)胞具有免疫抑制與免疫無能兩種免疫特性，可抑制自身T淋巴細(xì)胞的增殖，參與自身腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[12]；具有免疫調(diào)節(jié)功能的IDO可通過抑制自然殺傷細(xì)胞及T細(xì)胞活性而阻斷免疫反應(yīng)過程，以利于惡性腫瘤組織細(xì)胞的分裂、增殖[13-14]。楊峻等[15]通過觀察HBV感染肝癌患者外周血Treg細(xì)胞和IDO的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，PLC患者的Treg細(xì)胞、IDO均呈高表達(dá)。

CHB：慢性乙型肝炎；PLC：原發(fā)性肝癌；Treg：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞圖1 對(duì)照組(1a)、CHB組(1b)、PLC組(1c)外周血Treg細(xì)胞流式圖

Treg：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；IDO：吲哚胺2，3-雙加氧酶；CHB：慢性乙型肝炎；PLC：原發(fā)性肝癌；ROC：受試者工作特征曲線圖2 外周血Treg及IDO預(yù)測(cè)CHB罹患PLC的ROC曲線

肝癌在發(fā)生發(fā)展過程中可逃避機(jī)體免疫監(jiān)視，致使腫瘤細(xì)胞免于被宿主的自身免疫系統(tǒng)清除。Treg細(xì)胞為特殊的T細(xì)胞亞群，可調(diào)控自身免疫反應(yīng)，參與機(jī)體對(duì)感染性疾病、腫瘤等免疫耐受過程，不僅可分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β、白細(xì)胞介素-10、白細(xì)胞介素-12等細(xì)胞因子，進(jìn)而抑制效應(yīng)細(xì)胞的抗腫瘤免疫功能，還可以半乳糖凝集素為媒介與T細(xì)胞表面的糖蛋白受體發(fā)生反應(yīng)而抑制T細(xì)胞分泌γ干擾素[16-17]。IDO為色氨酸-犬尿氨酸代謝途徑中的限速酶，表達(dá)于具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在機(jī)體免疫抑制中具有重要調(diào)節(jié)功能，可通過分解代謝色氨酸而抑制T細(xì)胞的免疫功能。IDO水平升高可導(dǎo)致細(xì)胞微環(huán)境中的色氨酸消耗量增大直至耗竭，致使機(jī)體處于色氨酸饑餓狀態(tài)，尤其是對(duì)病原微生物、迅速分裂期細(xì)胞中的色氨酸剝脫效應(yīng)明顯[18]。而當(dāng)色氨酸濃度較低時(shí)，T細(xì)胞分化靜止在G1期，其增殖被抑制，處于靜息狀態(tài)的T細(xì)胞較正常T細(xì)胞更易凋亡造成T細(xì)胞缺乏，進(jìn)而使機(jī)體形成免疫豁免區(qū)，使腫瘤細(xì)胞免遭機(jī)體免疫系統(tǒng)的攻擊[19]。部分學(xué)者認(rèn)為，IDO水平升高導(dǎo)致局部微環(huán)境色氨酸耗竭而引發(fā)的T細(xì)胞強(qiáng)效免疫抑制可能是肝癌發(fā)生發(fā)展過程中形成免疫耐受，肝癌細(xì)胞逃避機(jī)體免疫攻擊的關(guān)鍵[20-21]。本研究結(jié)果顯示，CHB組和PLC組的外周血Treg細(xì)胞及IDO mRNA水平均顯著高于對(duì)照組，且PLC組高于CHB組(P<0.05)，說明HBV感染早期病毒可通過上調(diào)IDO水平而抑制機(jī)體免疫反應(yīng)，協(xié)助病毒在機(jī)體內(nèi)持續(xù)存在，并形成惡性循環(huán)，最終利于PLC細(xì)胞的免疫逃逸，促使其向PLC發(fā)生發(fā)展。HBV感染后，機(jī)體啟動(dòng)細(xì)胞免疫抵御病毒感染，如T淋巴細(xì)胞可啟動(dòng)非溶細(xì)胞或溶細(xì)胞機(jī)制清除病毒控制感染。然而，一旦感染者對(duì)HBV的細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)不足，即會(huì)表現(xiàn)為免疫耐受，致使機(jī)體免疫功能降低[22]。本研究通過ROC曲線分析顯示，外周血Treg細(xì)胞及IDO mRNA預(yù)測(cè)慢性HBV感染者罹患PLC的靈敏度分別為86.5%、87.4%，特異度分別為72.2%、71.3%，與苗海霞等[23]的研究結(jié)果基本一致。

綜上所述，外周血Treg細(xì)胞、IDO mRNA檢測(cè)在預(yù)測(cè)慢性HBV感染者罹患PLC中具有較高的靈敏度及特異度，應(yīng)用價(jià)值較高。通過生物醫(yī)學(xué)手段下調(diào)慢性HBV感染者體內(nèi)的Treg細(xì)胞及IDO水平，可能重建患者的主動(dòng)免疫功能，從而抑制腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。