血液凈化清除蛋白結(jié)合毒素的研究進(jìn)展

古曉燕 綜述 龔德華 審校

尿毒癥毒素可分為小分子水溶性化合物、中分子毒素和蛋白結(jié)合毒素(protein bound uremic toxins，PBUTs)三大類。PBUTs多為腸道細(xì)菌分解食物蛋白質(zhì)的產(chǎn)物，其與白蛋白(分子質(zhì)量68 000 D)結(jié)合后成為大分子質(zhì)量毒素，不易被常規(guī)血液透析(hemodialysis,HD)清除，因此被稱為蛋白結(jié)合毒素。常見的蛋白結(jié)合毒素有硫酸吲哚酚(indoxyl sulphate,IS)和硫酸對甲酚(p-cresyl sulphate,PCS)、馬尿酸(hippuric acid,HA)等。IS和PCS研究較多且有代表性，兩者的蛋白質(zhì)結(jié)合率分別為97% 和95%[1]，相對分子質(zhì)量分別為212 D和187 D。在健康腎臟中PBUTs的清除很大程度依賴于腎小管分泌，而常規(guī)HD主要模擬腎臟的濾過功能，只能清除游離的毒素部分，因此增加PBUTs吸附和增加游離分?jǐn)?shù)可提高清除率。吸附是清除PBUTs的主要方式，同時(shí)增加PBUTs的解離和改變透析參數(shù)，也可以增加其清除。本文擬就血液凈化清除PBUTs的研究進(jìn)展進(jìn)行簡述。

PBUTs的清除機(jī)制及其對機(jī)體影響

正常腎臟中PBUTs主要在腎小管清除。游離和蛋白質(zhì)結(jié)合的PBUTs被輸送到腎臟，游離的PBUTs從腎小管周圍毛細(xì)血管經(jīng)由基底外側(cè)膜上的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體分泌到近端小管細(xì)胞，然后通過頂膜上的膜基蛋白從近端小管細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到小管腔內(nèi)，近端腎小管細(xì)胞內(nèi)部的電位比管腔低，這一途徑由電驅(qū)動(dòng)，最后從尿液中排出。腎小管功能受損時(shí)， PBUTs在血液蓄積[2]，而常規(guī)HD只能模擬腎小球的濾過功能，與蛋白后結(jié)合的毒素分子質(zhì)量大，清除效果較差。研究表明，傳統(tǒng)的低通量HD不能清除色氨酸相關(guān)PBUTs[3]；與年齡匹配的健康對照組相比，HD患者IS和PCS水平分別高116倍和41倍，而尿素和肌酐的濃度分別僅高5倍和13倍[4]。

PBUTs潴留會(huì)對機(jī)體產(chǎn)生很多影響。Shafi等[5]研究發(fā)現(xiàn)血清白蛋白水平越低的患者，PCS、IS水平越高，發(fā)生心源性死亡和心源性猝死的風(fēng)險(xiǎn)越高。Sun等[6]以B-6小鼠半腎切除的小鼠和體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞為研究對象，發(fā)現(xiàn)IS和PCS在體內(nèi)和體外均損害有氧和無氧代謝，與慢性腎臟病(CKD)及其并發(fā)癥有關(guān)。除氧化應(yīng)激外，PBUTs還引起炎癥反應(yīng)并激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，增加腎纖維化[7]，同時(shí)還和血管鈣化和動(dòng)脈粥樣硬化[8]、認(rèn)知功能下降[9]、殘余腎功能下降[10]、凝血功能異常[11]相關(guān)，甚至PBUTs血清濃度升高直接與心血管、腎臟疾病的進(jìn)展及腎臟病患者的高死亡率相關(guān)[12]。

增加PBUTs血液凈化清除的方法

新型吸附材料吸附是清除蛋白結(jié)合毒素的重要的方式，新型吸附材料的研究、制備、驗(yàn)證是目前的熱點(diǎn)。Meyer等[13]從模型研究中預(yù)測，吸附可以增加PBUTs清除的驅(qū)動(dòng)力，提高清除率。Pavlenko等[14]研究開發(fā)了集透析和吸附于一體的新一代混合基質(zhì)膜(mixed matrix membranes,MMMs)，與第一代MMMs以及商用透析膜相比，它具有更小的直徑和優(yōu)化的特性，研發(fā)的M6膜對IS和PCS的清除率分別為367 mg/m2和380 mg/m2，能更好地去除IS和PCS。IS和PCS的游離部分通過內(nèi)選擇膜層，迅速被外層內(nèi)的顆粒吸附，增加了PBUTs的濃度梯度，并刺激游離部分的毒素從蛋白質(zhì)釋放至血漿，從而清除率更高。Geremia等[15]通過干濕法紡絲技術(shù)制備了含有活性炭顆粒的雙層中空纖維混合基質(zhì)膜，既不降低活性炭吸附能力，又同時(shí)完全去除透析液中的內(nèi)毒素以及高效去除血漿中的尿毒癥毒素。MMMs是由聚醚砜(polyethersulfone,PES)和聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)共混物組成的內(nèi)選擇層和嵌在PES/PVP基體中的活性炭微粒組成的外層組成的雙層中空纖維膜，具有同時(shí)結(jié)合彌散和對流以及AC顆粒的吸附能力。內(nèi)部無顆粒層避免了AC與患者血液的直接接觸，有較好的血液相容性。只需要0.15 m2的MMMs即可完全除去與每日產(chǎn)量相當(dāng)吲哚硫酸鹽和HA，同時(shí)應(yīng)用在可穿戴人工腎裝置中可去除內(nèi)毒素。Fu等[16]用活性炭、ZSM-5沸石和氧化石墨烯為吸附劑，采用非溶劑誘導(dǎo)相轉(zhuǎn)化法制備了多孔PES混合基膜，同時(shí)提出制備多孔膜的最佳條件，以提高PCS和IS高清除率的同時(shí)還保證足夠的機(jī)械強(qiáng)度，延長溶液與膜基體的接觸，且PES膜有一定的親水性，同時(shí)體外細(xì)胞驗(yàn)證混合基質(zhì)膜對成纖維細(xì)胞的細(xì)胞活性和血液相容性均無明顯影響。Yamamoto等[17]研究了活性炭通過體外直接血液灌流吸附循環(huán)PBUTs的效果，活性炭可劑量依賴性降低血液中PBUTs水平，并在體外有效吸附血液中的PBUTs?；钚蕴垦汗嗔骺汕宄颊哐褐械腜BUTs，可能是一種很有前景的治療策略。Sternkopf等[18]以多孔活性炭為芯材，親水性聚乙烯吡咯烷酮為表面涂層，制備了一種雙功能體外全血吸附器顆粒，該顆粒對疏水性、蛋白質(zhì)結(jié)合的尿毒癥毒素具有很高的吸附能力，對白蛋白結(jié)合或血液相容性無不良影響，對 CKD 5期患者血液中的疏水性、蛋白結(jié)合性毒性具有很高的清除率。這種方法產(chǎn)生了一種對疏水性尿毒癥毒素具有很高吸附能力的血液相容性吸附器。目前很多新型吸附材料體都提高了PBUTs的清除率，有望降低CKD患者的發(fā)病率和死亡率。

有機(jī)金屬也可用于清除PBUTs。Kato等[19]發(fā)現(xiàn)9種基于鋯的金屬有機(jī)骨架(metal-organic frameworks,MOF)對PCS、IS和HA等PBUTs具有吸附作用。NU-1000是一種基于苯并芘的金屬有機(jī)框架，在所有金屬有機(jī)框架中對PBUTs清除效率最高，NU-1000的高吸附容量可歸因于被兩個(gè)芘連接體和Zr6節(jié)點(diǎn)上的羥基和水分子夾在中間的高度疏水的吸附位，這些吸附位能夠與配體分子的極性官能團(tuán)發(fā)生氫鍵作用。NU-1000幾乎可以完全去除人血清白蛋白結(jié)合的PCS。

體外肝臟支持吸附透析裝置，即血漿分離、吸附和透析(fractionated plasma separation,adsorption,and dialysis,FPAD)系統(tǒng)，其清除蛋白結(jié)合的疏水性尿毒癥毒素的效能優(yōu)于傳統(tǒng)的高通量HD[20]。Sternkopf等[18]發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)的高通量HD相比，F(xiàn)PAD治療5h顯著增加疏水性尿毒癥毒素的清除，苯乙酸、PCS和IS清除率分別增加130%、127%和187%。但FPAD成本高，難以常規(guī)開展。

增加PBUTs游離分?jǐn)?shù)常規(guī)HD中PBUTs清除率低，主要與其結(jié)合白蛋白后分子量大、游離分?jǐn)?shù)低有關(guān)。增加PBUTs的游離分?jǐn)?shù)可增加清除率，目前可以通過電離或者競爭劑與其競爭結(jié)合白蛋白位點(diǎn)增加其游離分?jǐn)?shù)。

增加血液中PBUTs的電離度可提高游離分?jǐn)?shù)。Yen等[21]采用靜電紡絲法制備了導(dǎo)電的四元復(fù)合納米纖維墊，碳納米管/導(dǎo)電聚合物雜化納米纖維，將碳納米管結(jié)合到傳統(tǒng)的PES透析膜上，實(shí)現(xiàn)了PBUTs電解離，這種系統(tǒng)的透析設(shè)備可增加PBUTs清除的同時(shí)將蛋白質(zhì)損失降至最低，并且耐水性良好，有良好的抗凝能力，還可降低的補(bǔ)體激活，減少血小板吸附，并且很少產(chǎn)生紅細(xì)胞溶血。它們在開發(fā)生物電子藥物具有潛在前景。

競爭結(jié)合白蛋白位點(diǎn)同樣可以增加PBUTs游離，從而提高清除率。白蛋白結(jié)合配體可通過直接競爭結(jié)合位點(diǎn)或通過變構(gòu)機(jī)制影響白蛋白與其他配體的結(jié)合，特定配體與白蛋白的結(jié)合可能改變結(jié)合位點(diǎn)附近的構(gòu)象。使用具有與PBUTs相同結(jié)合位點(diǎn)的化合物來阻止其結(jié)合是增加這些尿毒癥毒素的游離分?jǐn)?shù)的直接方法。競爭劑必須安全、有效，不僅能夠競爭白蛋白上的毒素結(jié)合位點(diǎn)，還需有較短的半衰期，能被腎臟以外的器官清除，同樣重要的是要避免競爭劑導(dǎo)致具有相同白蛋白結(jié)合位點(diǎn)的自身有益物質(zhì)的損失。Tao等[22]進(jìn)行體外和離體研究表明，布洛芬可與白蛋白的Sudlow位點(diǎn)2結(jié)合，而IS和PCS被布洛芬取代，通過體外輸注PBUTs結(jié)合競爭物質(zhì)，可以顯著提高PBUTs的透析清除率。同樣地，Madero等[23]研究在常規(guī)HD中，通過向體外循環(huán)注入布洛芬，可以有效且可逆地將IS和PCS從它們的白蛋白結(jié)合位點(diǎn)置換出來，顯著增加IS和PCS清除率，透析后IS和PCS血清水平顯著下降。Maheshwari等[24]在計(jì)算機(jī)上比較HD、血液透析濾過(hemodiafiltration,HDF)、膜吸附和結(jié)合競爭去除PBUTs之間的差異，在透析中使用了PBUTs/置換器動(dòng)力學(xué)的數(shù)學(xué)模型，該模型包括一個(gè)三室患者模型，一個(gè)動(dòng)脈/靜脈管段模型和一個(gè)透析器模型，模型表明HD體外回路中的結(jié)合競爭比傳統(tǒng)的HD，HDF和膜吸附大大提高了PBUTs的清除，最終顯示競爭性結(jié)合是提高PBUT清除率的實(shí)用方法[24]。

改變透析參數(shù)

增加透析時(shí)間和頻率 由于PBUTs的蛋白結(jié)合率高，而常規(guī)HD只能清除游離部分，因此提高頻率和透析時(shí)長可能會(huì)提高其清除率。Eloot等[25]建立數(shù)學(xué)動(dòng)力模型研究發(fā)現(xiàn)，PBUTs的清除模式與其他尿毒癥毒素明顯不同，對于蛋白結(jié)合率高的PBUTs，透析充分性主要取決于每周處理血液量，而這由透析頻率和透析時(shí)間決定。對于固定類型的透析器，無論是延長透析時(shí)間還是頻繁透析，在保持與標(biāo)準(zhǔn)透析相同的處理血量的情況下，對于高蛋白結(jié)合的化合物來說，只會(huì)導(dǎo)致有限的溶質(zhì)濃度下降。同樣的，Sirich等[26]研究發(fā)現(xiàn)在高頻HD網(wǎng)絡(luò)(FHN)中隨著透析頻率和時(shí)間的增加，尿毒素溶質(zhì)濃度的降低的增幅較小。每周接受6次(平均14.6 h/周)治療的FHN患者溶質(zhì)的平均濃度僅比接受每周3次常規(guī)治療(平均10.9 h/周)的受試者平均濃度低15%，定量測量證實(shí)，IS和PCS的濃度并沒有顯著降低，溶質(zhì)濃度相對于提高透析時(shí)間和頻率的工作量而言，沒有下降到預(yù)期的程度。Maheshwari等[27]建立了一個(gè)綜合的PBUTs動(dòng)力學(xué)模型，顯示增加透析液的流速可以提高PCS和IS的清除率，然而隨著透析器性能的提高，PCS和IS的清除率增幅有限，考慮清除動(dòng)力是由血漿和透析液之間游離毒素濃度差驅(qū)動(dòng)的，PBUTs導(dǎo)致的較小擴(kuò)散梯度是清除率的限制因素。由此可得，提高透析的頻率、時(shí)間和透析液的流量對于PBUTs的清除率提升效果較工作量而言性價(jià)比不高。

提高透析液流速 Meyer等[28]建立了高蛋白結(jié)合率的PBUTs的動(dòng)力學(xué)模型，PBUTs的透析清除表達(dá)式是由游離毒素分?jǐn)?shù)決定，他們預(yù)測增加透析液流量并伴隨透析器表面積的增加將改善PBUTs的清除。然而有研究表明，增加了透析器的大小以及血液和透析液的流量，對PCS和IS血漿濃度水平的影響很小[29]。

調(diào)整透析液成分 Nerusu等[30]研究人血清白蛋白結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)PBUTs均可與白蛋白結(jié)構(gòu)域D2、D3和D2-3相互作用，親和力顯著，與其他結(jié)構(gòu)域相比，D3親和力較高。人血清白蛋白結(jié)構(gòu)域的解離常數(shù)(Kd值)與完全人血清白蛋白的Kd值有顯著差異。Kd值決定了配體的游離態(tài)和蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)濃度。提高透析液對PBUTs的親和力和特異性可以提高透析液的效率，透析液對PBUTs的特異性可以通過使用兩個(gè)結(jié)構(gòu)域(即D2和D3)的組合作為透析液并通過調(diào)整D2和D3的比例來實(shí)現(xiàn)。

改變透析方式 目前的常規(guī)的HD方式原理多為彌散和對流，而PBUTs分子量大限制了其清除，不同透析方式對PBUTs清除率差異不大。Maheshwari等[24]發(fā)現(xiàn)與常規(guī)HD相比，HDF僅稍增加PBUTs的清除。van Gelde等[31]研究發(fā)現(xiàn)與低通量HD相比，HDF治療6個(gè)月僅降低了IS的血漿濃度，而PCS、HA濃度無顯著改變。膜的孔徑及其超濾系數(shù)對與白蛋白結(jié)合的PBUTs的清除率幾乎沒有影響[32]。

降低PBUTs的其他方法

減少PBUTs產(chǎn)生通過腸道干預(yù)可控制尿毒素產(chǎn)物在腸道的產(chǎn)生和吸收，Chen等[33]對八項(xiàng)研究的系統(tǒng)回顧發(fā)現(xiàn)，口服含碳吸附劑AST120可有效降低IS血清水平，但在減緩疾病進(jìn)展和全因死亡率方面仍存在爭議。

保護(hù)殘余腎功能PBUTs分子量很大，正常多不能經(jīng)過腎小球?yàn)V過，主要以腎小管分泌方式清除[34]。Leong等[35]發(fā)現(xiàn)了有殘余功能每周兩次透析的患者的HA、苯乙酰谷氨酰胺、IS和PCS濃度，并不顯著高于無尿每周三次透析的患者，前組患者血漿HA和苯乙酰谷氨酰胺的水平低于后組患者，由此可知?dú)堄嗄I功能可有助于減少尿毒癥毒素的積累，對于經(jīng)腎小管分泌清除的毒素可能尤為重要，這種功能不能被HD模擬。van Gelde等[31]研究發(fā)現(xiàn)，殘余腎功能與犬尿酸(P<0.001)、吲哚硫酸鹽(P=0.001)、吲哚-3-乙酸(P=0.024)、對甲酚葡萄糖醛酸(P=0.004)和HA(P<0.001)血漿濃度呈負(fù)相關(guān)。故保護(hù)HD患者殘余腎功能對減少PBUTs血漿濃度起重要作用。

小結(jié):PBUTs對心血管和腎臟具有多種危害， 降低PBUTs對減少CKD患者并發(fā)癥以及提高其生存率具有重要意義。提高血液凈化對PBUTs的清除能力是目前的研究熱點(diǎn)，尤其是新型吸附材料的研制及開發(fā)，仍需深入開展相關(guān)臨床研究。