納米細菌對HK-2細胞的損傷機制及其防治＊

王敬珅，王議鶴，郝志強，楊 恒，汪 淵，李永樂，王勤章，錢 彪

泌尿系結石是泌尿外科最常見的疾病之一［1］，該病的成因非常復雜，納米細菌（nanobacteria，NB）感染被認為是導致結石形成的主要原因之一［2，3］，其在腎結石患者的血液、尿液和結石中的陽性檢出率均在 90%以上［4，5］。 NB 是一種具有超微結構的人體病原菌，具有較強的感染能力，能在菌體外周形成羥磷灰石結晶外殼，黏附并損害集合管上皮細胞及腎乳頭細胞，從而形成結石［6，7］。

隨著醫(yī)學技術的發(fā)展，結石的診斷和治療都有了長足的進步，但碎石治療后患者的結石復發(fā)率仍然很高［8］。因此，探究泌尿系結石的形成機制以尋找新的治療手段是當前臨床中亟待解決的難題。四環(huán)素是為數(shù)不多的能在生理濃度下殺滅NB的抗菌藥物之一，Shoskes等研究了四環(huán)素對NB相關慢性前列腺結石患者的治療效果，其中80%患者的癥狀在治療3個月后得到了極大改善，10例患者的結石縮小50%［9］。然而，目前尚不清楚NB是如何在腎結石形成的過程中發(fā)揮其獨特作用的，更遑論治療。

該研究旨在通過NB損傷人腎小管上皮細胞HK-2導致晶體滯留的機制研究以及四環(huán)素對這一過程的抑制作用，以期為泌尿系結石的預防和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器永生化人腎小管上皮細胞系HK-2細胞購自武漢大學保藏中心。DMEM培養(yǎng)基，1640培養(yǎng)基，胎牛血清，PBS緩沖液 （美國Hyclone公司），一水草酸鈣 （Calcium oxalate monohydrate，COM）， 納米級羥基磷灰石（Nanograde hydroxuapatite，nHAP），四環(huán)素，F(xiàn)ITC-phalloidin（英國Abcam公司）。二氧化碳細胞培養(yǎng)箱 （美國Thermo公司），掃描儀（日本Canon公司），激光掃描共聚焦顯微鏡（德國蔡司）。

1.2方法

1.2.1 NB培養(yǎng)與鑒定 于新疆石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院泌尿外科收集臨床確診腎結石且未應用藥物或手術治療患者的尿液，將無菌條件下獲得的尿液2 ml用生理鹽水稀釋5倍，4℃離心45 min（14 000 g）；取管底 2 ml混勻，以 0.45 μm 濾紙過濾后，再以生理鹽水稀釋5倍，4℃離心45 min（14 000 g）；取管底 1 ml液體充分混勻后，經(jīng) 0.22 μm的濾紙加壓過濾。將濾液1 ml注入含DMEM培養(yǎng)液、10%γ-FBS和1%HEPES緩沖液的細胞培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，5～7 d換 1次液。倒置相差顯微鏡觀察NB生長，篩選出無污染的標本，用吸管吹打均勻后，吸入EP管。12 000 r/min，離心20 min，棄上清液，再加入無菌注射用水1.5 ml吹打混勻。重復上面步驟共計清洗NB 3次，采用NB鈣染色（Von KOSSA法）和應用透射電鏡掃描（負染法）鑒定。

1.2.2 實驗分組 選取HK-2細胞，隨機分為5組，NB組（NB菌液、胎牛血清、1640培養(yǎng)液+HK-2細胞），陰性對照組（胎牛血清、1640培養(yǎng)液+HK-2細胞），陽性對照組（5 mmol/L COM懸液、胎牛血清、1640 培養(yǎng)液+HK-2 細胞），nHAP 組 （nHAP、胎牛血清、1640培養(yǎng)液+HK-2細胞）和四環(huán)素干擾組（四環(huán)素、NB菌液、胎牛血清、1640培養(yǎng)液+HK-2細胞）。

1.2.3 各組細胞透射電子顯微鏡觀察 分別于6 h、12 h、24 h提取各組細胞制成細胞懸液，離心后轉移至EP管內(nèi)，PBS浸泡10 min后棄上清；加入預冷的3%戊二醛固定2 h，PBS洗2次，3 min/次；再加入1%鋨酸固定2 h，PBS洗2次，3 min/次；梯度乙醇脫水，經(jīng) Epon812∶環(huán)氧丙烷=1∶1浸透，包埋后 80℃聚合過夜。行超薄切片、染色。于40透射電子顯微鏡下觀察細胞形態(tài)與超微結構變化。

1.2.4 激光共聚焦顯微鏡檢測晶體滯留實驗 將HK-2細胞接種于鋪有清潔蓋玻片的24孔板內(nèi)，共同培養(yǎng)6 h、12 h、24 h后取出各組樣本，加入COM懸液（每孔內(nèi) COM 濃度 200 mg/L），輕搖 5～10 s，使COM晶體與底部細胞充分接觸。3 min后吸凈蓋玻片上方液體，加入飽和草酸鈉溶液漂洗3次。將蓋玻片從孔板中取出，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗2次，5 min/次，搖床輕晃；加入5 mg/L的phalloidin-FITC 50 μl， 室溫避光孵育 20 min；PBS洗2次，5 min/次；甘油封片。在488 nm和633 nm激發(fā)光下逐一觀察各組玻片并進行圖像采集。

1.3統(tǒng)計學方法運用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件（SPSS Inc.，Chicago，IL）進行統(tǒng)計學分析，計量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1各組細胞透射電子顯微鏡觀察結果電鏡結果見圖1。實驗過程中，空白對照組（圖1A，B，C和D）細胞膜結構完整正常，膜外微絨毛（黑色箭頭）數(shù)量豐富，排列規(guī)則；雙層核膜（黃色箭頭）結構正常，核間隙正常；線粒體（紅色箭頭）形態(tài)正常，未見腫脹或萎縮；細胞亞顯微結構正常。

實驗開始12 h后，NB組細胞膜結構完整，微絨毛結構稍紊亂，局部絨毛消失（黑色箭頭，圖1E）；細胞核畸形，染色質(zhì)輕度分布不均，局部染色質(zhì)凝集（黃色箭頭，圖1E）；核外膜局部區(qū)域降解（藍色箭頭，圖1E）；部分線粒體結構輕度腫脹，脊結構模糊不清（紅色箭頭，圖1F）；胞質(zhì)中偶見髓樣小體（圖1F）。nHAP組細胞膜局部區(qū)域結構破損，微絨毛結構消失（黑色箭頭，圖1M），絨毛結構消失；部分線粒體結構輕度腫脹，脊結構模糊不清（紅色箭頭圖1N）。胞質(zhì)中見髓樣小體（綠色箭頭，圖1N）。四環(huán)素組細胞膜結構完整，微絨毛結構稍紊亂，局部絨毛消失（圖1Q，黑色箭頭），絨毛結構消失；細胞核畸形，染色質(zhì)輕度分布不均，局部染色質(zhì)凝集（圖1Q，黃色箭頭）；核外膜局部區(qū)域降解（圖1R，藍色箭頭）；部分線粒體結構輕度腫脹，脊結構模糊不清（圖1R，紅色箭頭）。胞質(zhì)中偶見髓樣小體（圖1R，綠色箭頭）。COM組細胞膜局部區(qū)域結構紊亂，微絨毛分布不均，局部區(qū)域絨毛消失（圖1I，黑色箭頭）；細胞核染色質(zhì)邊集（圖1I，藍色箭頭）；線粒體結構正常，脊結構清晰。胞質(zhì)中胞質(zhì)中偶見自噬小體。

實驗開始24 h后，NB組細胞膜結構破損，胞核裸露在外（粉色箭頭，圖1G）；微絨毛基本消失（黑色箭頭，圖1G），線粒體數(shù)量較少，結構腫脹，脊模糊不清（紅色箭頭，圖1H）；胞質(zhì)中可見較多髓樣小體（綠色箭頭，圖1H），胞質(zhì)中自噬小體數(shù)量較多（棕黃色箭頭，圖1H）。nHAP組細胞膜結構完整，核膜結構正常；微絨毛分布不均，局部區(qū)域絨毛消失（圖1O，黑色箭頭）；細胞核染色質(zhì)邊集（圖1O，藍色箭頭）；線粒體結構腫脹，脊結構模糊不清，局部區(qū)域降解（圖1P，藍色箭頭）。胞質(zhì)中偶見髓樣小體（圖1P，綠色箭頭）；胞質(zhì)中可見自噬小體（圖1P，棕黃色箭頭）。四環(huán)素組細胞膜結構完整，微絨毛基本消失（圖1S，黑色箭頭）；線粒體數(shù)量較少，結構腫脹，脊模糊不清（圖1S，紅色箭頭）。胞質(zhì)中可見較多髓樣小體（圖1T，綠色箭頭）；胞質(zhì)中自噬小體數(shù)量較多（圖1T，棕黃色箭頭）。COM組細胞膜結構破損，微絨毛分布紊亂，絨毛消失；細胞核膜階段性溶解，核膜結構模糊不清（圖1L，藍色箭頭）；線粒體結構腫脹，脊模糊不清（圖1L，紅色箭頭）。胞質(zhì)中見髓樣小體（圖 1L，綠色箭頭）及自噬小體（圖 1L，黃色箭頭）。

圖1見封三。

2.2激光共聚焦顯微鏡觀察結果如圖2所示，培養(yǎng)6 h時，NB組、COM組可觀察到少量晶體黏附，隨著共培養(yǎng)時間延長，兩組細胞晶體黏附量進一步增加。共培養(yǎng)6 h和12 h時，nHAP組未觀察到明顯的晶體黏附現(xiàn)象，當共培養(yǎng)24 h時，可觀察到少量晶體黏附。各時間點，干擾組中晶體黏附量均顯著少于NB組。

圖2見封三。

3 討論

腎結石的病因非常復雜，其涉及遺傳、環(huán)境、生活膳食習慣等多種因素［10］。以往認為腎結石是由于pH升高而引起磷酸鹽沉積所致，而芬蘭科學家CIFTCIOGLU團隊通過檢測患者的結石成分，發(fā)現(xiàn)97.2%的腎結石中含有NB，67%～90%的草酸鈣結石核心含有類似NB礦化生成的羥磷灰石，從而認為NB 是腎結石礦化的核心［4，11］。 研究證實，NB 在生長增殖過程中能分泌羥磷灰石類的鈣化物，形成鈣化生物膜，刺激機體產(chǎn)生以NB為核心的鈣化病變［12，13］。

3.1實驗研究的分組有文獻報道，含鈣結石占腎結石的大多數(shù)，且約有23.7%的患者合并尿鈣代謝異常［14］。近年來，大量文獻報道了COM對動物腎小管上皮細胞的損傷作用。李成文等［15］研究發(fā)現(xiàn)，將5 mmol/L COM晶體加入Wistar大鼠腎小管上皮細胞的培養(yǎng)液中8 h后，可以觀察到大量晶體黏附現(xiàn)象發(fā)生。因此，該研究將COM組（5 mmol/L）設為陽性對照組。NB廣泛存在于人體血液、尿液及組織器官中，可形成磷酸鈣外殼，該外殼成分與nHAP相似。nHAP是一種與人體硬組織的無機成分相類似的生物活性材料，在替代骨組織方面應用潛力較大，但過高濃度的nHAP（200 mg/L以上）會對細胞DNA及大分子物質(zhì)造成不可逆轉的損傷，最終導致細胞凋亡［16］。該研究設置了高濃度nHAP組（300 mg/L）與NB進行各項損傷指標的比較。同時，筆者設置干擾組來檢驗四環(huán)素的殺菌作用，并將其與NB對HK-2細胞的損傷進行對比。

3.2NB損傷人腎小管上皮細胞HK-2導致晶體滯留的機制該研究結果與既往文獻報道相一致，用透射電子顯微鏡觀察HK-2細胞的形態(tài)學變化發(fā)現(xiàn)，NB組和nHAP組對HK-2細胞膜可產(chǎn)生類似的損傷［12］。實驗開始后12 h，兩組細胞膜結構均完整，線粒體結構出現(xiàn)病變，但NB組細胞核已經(jīng)出現(xiàn)畸形；實驗開始后24 h，NB組細胞膜結構已經(jīng)出現(xiàn)破損，胞核裸露，且胞質(zhì)中可見較多髓樣小體。結果提示NB組破壞程度比nHAP組嚴重。既往研究認為高濃度的nHAP（>200 mg/L）可導致細胞大量凋亡或者壞死，該研究中其對HK-2的破壞程度小于NB，提示可能NB的nHAP外殼并不是損傷HK-2的主要物質(zhì)。隨著COM作用時間的推移，胞質(zhì)中線粒體腫脹加重，胞核逐漸溶解消失。NB和nHAP對細胞的損傷程度也隨著作用時間而加重，但主要表現(xiàn)為刷狀緣排列紊亂，細胞膜則較完整。通過透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，nHAP在HK-2細胞中的分布密度比NB高，但對細胞的損傷程度卻低于NB。損傷HK-2細胞后，NB組中細胞晶體黏附程度遠遠高于nHAP組。綜合以上結果表明，NB對HK-2細胞的損傷程度及晶體滯留的影響遠大于nHAP，提示在損傷HK-2細胞及后續(xù)晶體黏附的過程中起主導作用的可能并非NB的磷酸鈣外殼，而是其菌體本身。

3.3四環(huán)素的抑菌作用得益于礦化生物被膜的保護，NB不僅能夠耐高溫，脫水、冰凍、紫外線及γ輻射，青霉素、頭孢菌素及大環(huán)內(nèi)酯等普通抗生素也對其無效［7，17，13］。 殺滅 NB 的藥物有氨芐西林、甲氧芐啶和強力毒素等，但是其對人體產(chǎn)生毒害甚至致死劑量時才發(fā)揮藥效，因此不能應用于臨床［18］。四環(huán)素是為數(shù)不多的能在生理濃度下殺滅NB的抗菌藥物之一，它可以穿透NB的鈣質(zhì)外殼，同時抑制其鈣化，從而發(fā)揮抗菌作用。有文獻報道，四環(huán)素在治療 NB 相關的慢性前列腺炎［9，19］、間質(zhì)性膀胱炎［20］等方面均取得了不錯的效果。Zhou［9］為探討納米桿菌感染與Ⅲ型前列腺炎的關系，選取48例慢性盆腔疼痛綜合征患者，隨機分為兩組，一組接受四環(huán)素抗NB治療，另一組接受安慰劑治療。在治療前后，分別從患者的前列腺液和尿液中分離培養(yǎng)NB，記錄其形態(tài)學特征，檢測16SrRNA基因的表達，用國家衛(wèi)生研究院的NB陽性率和癥狀變化評價療效。經(jīng)抗NB治療后，前列腺液中NB陽性率由62.5%下降到16.7%，前列腺按摩后尿標本則從12.5%下降到0%，而安慰劑組無明顯變化。結果顯示治療前后慢性疼痛綜合征患者的16SrRNA基因序列并無差別，而治療后慢性前列腺炎癥狀指數(shù)評分明顯下降，而安慰劑治療后慢性前列腺炎癥狀指數(shù)評分無明顯變化?？梢哉J為，四環(huán)素是抗NB治療的有效方法。該研究在損傷HK-2細胞后，電鏡顯示NB組中細胞晶體黏附程度遠遠高于四環(huán)素干擾組；提示四環(huán)素可以抑制NB對HK-2細胞的損傷并減少損傷后的晶體滯留，這一結果進一步確認了四環(huán)素在腎結石的預防和治療方面的有效性，對于該病在臨床上的診治具有積極的意義。

綜上所述，NB可損傷HK-2細胞，損傷程度和晶體滯留程度與NB作用時間成正比，四環(huán)素可以抑制這一過程。因此，NB可能通過以下途徑導致腎結石的形成：NB感染損傷腎小管上皮細胞后，晶體向暴露的基底膜黏附，與NB和壞死細胞碎片共同形成結石。因此運用四環(huán)素或其他抗菌藥物滅殺NB可能是預防和治療結石的一個新的方向。