子宮內(nèi)膜異位癥動物模型制備方法研究概況

孫瑞英，崔軼凡

（山西中醫(yī)藥大學，山西 晉中030619）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMT）是一種具有活性的子宮內(nèi)膜組織在宮腔被覆蓋的黏膜外生長的雌激素依賴性疾病。在中醫(yī)學里并無EMT的病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，本病多歸于“不孕癥”“月經(jīng)病”“癥瘕”等范疇。目前對于該病的發(fā)病機制尚不清楚，且手術(shù)及西藥治療效果不徹底，具有較高的復(fù)發(fā)率，極大地降低了患者的生活質(zhì)量。由于倫理學等方面的原因，很難在EMT患者身上觀察發(fā)病的全過程，不能對人類進行對照研究，也不能進行損傷性研究。因此，創(chuàng)建理想的動物模型模擬人類EMT，有助于進一步研究其病因?qū)W、治療學，對明確其發(fā)病機制、研發(fā)治療新藥、探索中藥作用機制均起到了不可或缺的作用，有益于盡快攻克該疾病。

EMT動物模型的復(fù)制，雖然取得了階段性進展，但由于EMT的發(fā)病機制尚未完全闡明，給模型的復(fù)制也帶來了一定的困難。并且EMT動物模型存在一些急需解決的問題，不同動物模型適用范疇和潛在的限制性都要充分考慮。本研究總結(jié)近20年來EMT動物模型的發(fā)展經(jīng)驗，對各種EMT動物模型的現(xiàn)狀和問題作出簡述。

1 EMT動物模型造模方法

1.1 自發(fā)性

除人類外，只有雌性靈長類動物，包括恒河猴、狒狒、南美獼猴等會出現(xiàn)天然自發(fā)的EMT。它們具有規(guī)律的月經(jīng)周期和子宮內(nèi)膜脫落過程，與人類的月經(jīng)、性周期和妊娠現(xiàn)象相似，是理想的EMT模型動物。挑選具有規(guī)律的月經(jīng)周期及生育能力的雌性靈長類動物，通過腹腔鏡排除無EMT的動物用于實驗。1991年，D′Hooghe TM等［1］通過腹腔鏡檢查發(fā)現(xiàn)狒狒自發(fā)性EMT，且其組織學方面和骨盆病變的位置與女性相似，是用于研究EMT的良好動物模型。2017年，Gruber-Dujardin E等［2］選取自發(fā)性EMT獼猴模型研究子宮內(nèi)膜異位的形態(tài)和免疫組化特征。然而，非人靈長類動物自發(fā)性EMT周期長且概率很低，約為1%［3］，一般都采用人為誘導產(chǎn)生EMT模型。

1.2 誘發(fā)性

誘發(fā)性是利用手術(shù)把自身子宮內(nèi)膜移植到宮腔之外的部位，或者封閉其宮頸或陰道口，使其經(jīng)血逆流進入腹腔，最終導致疾病的發(fā)生。誘發(fā)性非人靈長類動物模型與自發(fā)性模型相比，具有實驗周期短、成模率高的明顯優(yōu)勢，并能耐受多次手術(shù)操作。雖然非人靈長類動物在EMT研究中具有自身特有的優(yōu)勢，但在現(xiàn)實操作中，靈長類動物數(shù)量較少且價格昂貴，不適合用于科學研究。目前我國廣泛采取的是誘發(fā)性造模方法，此類方法普遍適用于非人靈長類和嚙齒類動物。

2006年，Hastings JM等［4］采用自體內(nèi)膜手術(shù)移植的方式，將狒狒子宮內(nèi)膜接種到腹腔導致子宮內(nèi)膜異位病變的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)其形態(tài)特征與人類相似。Harirchian P等［5］利用手術(shù)將狒狒的子宮內(nèi)膜種植到腹膜內(nèi)，成功誘導狒狒形成EMT。D′Hooghe TM等［6］采用阻塞宮頸方法，導致狒狒的逆行月經(jīng)量增加，最終參與實驗的5只狒狒均發(fā)生EMT。采用手術(shù)誘導病灶形成與阻塞宮頸或陰道口模仿經(jīng)血逆流人工誘導EMT相比，其具有操作簡單、可控性較好的特點，故實際實驗中多選用手術(shù)自體內(nèi)膜移植誘導非人靈長類動物形成子宮內(nèi)膜異位病灶。目前國內(nèi)關(guān)于非人靈長類誘發(fā)EMT動物模型報道較少。2003年，宗利麗等［7］采用手術(shù)將獼猴的子宮內(nèi)膜移植到盆腔宮腔以外的部位成功建立了EMT模型。2015年，朱峰城等［8］選取食蟹猴采用自體內(nèi)膜移植成功誘導了EMT模型。

嚙齒類中常用動物為大鼠、兔。大鼠為多發(fā)情動物，發(fā)情周期短，有超強的生命力，可經(jīng)受多次手術(shù)，性成熟早，能夠迅速孕育出后代，且成本較低，普遍適用于科學研究。常用的有Wistar大鼠和SD大鼠，造模原理多依據(jù)EMT種植學說進行自體內(nèi)膜移植誘導。能夠進行自體內(nèi)膜移植的部位很多，如腹壁、腸系膜、卵巢附近等，多選擇在腹壁處進行移植，方便操作且不易形成粘連［9-10］。SD大鼠與Wistar大鼠對比，其對性激素的感受性更高，體質(zhì)更強，造模成功率更高。聶曉博等［11］采用自體內(nèi)膜種植法制備EMT SD大鼠模型研究莪術(shù)醇對EMT大鼠腹腔液中炎癥因子的影響。黃艷輝等［12］成功構(gòu)建了EMT Wistar大鼠模型來探討溫經(jīng)止痛方對EMT大鼠AKT/mTOR通路相關(guān)分子表達的影響。但有研究發(fā)現(xiàn)采用自體內(nèi)膜皮下移植法更有優(yōu)勢，認為皮下種植法操作簡單，觀察直觀，避免二次開腹，便于實驗研究［13］。此外，在查閱大量文獻過程中發(fā)現(xiàn)實驗中多選用動情期大鼠的子宮內(nèi)膜進行移植造模，但有研究發(fā)現(xiàn)選用非發(fā)情期或發(fā)情期的大鼠進行造模，兩組造模的成功率并無顯著區(qū)別［14-15］。因此，可取消動情周期的監(jiān)測，直接造模，這樣不僅有利于實驗的同步性，還可以減少實驗的周期。

兔為刺激排卵動物，無發(fā)情期、月經(jīng)，以誘發(fā)性EMT模型為主。1980年，Schenken RS等［16］選用兔采取自體內(nèi)膜移植成功誘導了EMT模型，并發(fā)現(xiàn)其異位灶能持續(xù)長達12周。2010年，Rosae-Silva JC等［17］采用自體內(nèi)膜移植成功構(gòu)建了兔EMT模型，并發(fā)現(xiàn)其異位病灶的增殖指數(shù)比在位內(nèi)膜高，與人體EMT的前期研究相似。2016年，Saad-Hossne R等［18］對兔進行手術(shù)誘導構(gòu)建腹膜EMT模型，研究20%阿司匹林注射液在實驗性腹膜EMT中的治療效果。兔不僅具有價廉、成功率高及體型適于手術(shù)操作等優(yōu)點，還擁有完整的內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)，不需要補充外源性類固醇激素。不足之處在于其異位病灶形成時間較長且刺激反射性排卵控制困難。

1.3 種植性

1.3.1 同種異體種植 在一種動物腹腔中種植同一種或與之基因相同的動物子宮或子宮內(nèi)膜，稱為同種異體種植。常用嚙齒類大鼠和小鼠作為實驗載體。張薇等［19］對24只Wistar雌性大鼠行異體子宮組織移植手術(shù)，30只行自體子宮組織移植手術(shù)，結(jié)果Wistar大鼠異體移植成模率（83.3%）高于自體移植成模率（76.7%）。崔金秀等［20］采用同種異體皮下移植法成功建立了大鼠EMT模型。

小鼠體形小，易于控制，生長繁殖快，基因與人類高度相似，遺傳背景清晰，對于雌孕激素較其他嚙齒類敏感，且已培育出大量的近交系、封閉群和轉(zhuǎn)基因動物，給EMT的研究提供了更豐富的資源，常用有BALB/c、C57BL/6等。Somigliana E等［21］通過在具有免疫能力的C57BL/6和BALB/c小鼠中采用同種異體移植成功構(gòu)建了EMT小鼠模型，適用于探討使用免疫系統(tǒng)療法治療EMT的可能性。崔陽陽等［22］通過“腹腔+皮下”同種異體子宮內(nèi)膜注射法成功建立了EMT小鼠模型。李冰冰等［23］采用腹腔注射含供體小鼠子宮碎片的生理鹽水法成功建立BALB/c小鼠EMT動物模型，操作簡便、成模率高，異位病灶有纖維化生成，可作為EMT纖維化機制和藥物療效研究的可靠動物模型。

1.3.2 異種種植 將人的子宮內(nèi)膜組織或EMT病變植入到具有免疫缺陷的小鼠體內(nèi)，構(gòu)建EMT模型，稱為異種種植。常用的動物為具有免疫缺陷的裸鼠和SCID小鼠，無異種移植免疫排斥反應(yīng)，成模率高。裸鼠是T淋巴細胞功能缺陷的動物，B細胞功能基本正常。把人的子宮內(nèi)膜移植于裸鼠體內(nèi)后，能夠維持固有的組織形狀和生化特性，基本保存了其遺傳學，對各種藥物的敏感性不會發(fā)生變化［24-26］。而SCID小鼠同時具備先天性T、B淋巴細胞聯(lián)合免疫缺陷，是嚴重聯(lián)合免疫缺陷動物，較裸鼠可以更好地克服異種間的免疫排斥反應(yīng)，接受人類正?；蚰[瘤組織移植，使得移植后的組織仍保持原有組織形態(tài)及生化特征。但裸鼠和SCID小鼠抵抗力差，手術(shù)過程中易死亡，不能用來研究免疫、炎癥相關(guān)方面的機制。

組織塊種植模型被廣泛使用，但容易產(chǎn)生炎性囊腫，進而導致盆腔微環(huán)境受到影響，在移植時組織塊比較小，實驗歷程繁瑣，降低成模率。與組織塊移植模型相比，細胞移植接種便利，細胞類別明晰，成模率較高。Banu SK等［27］將EMT患者的子宮內(nèi)膜細胞注入裸鼠腹腔，形成EMT病灶，造模成功率為100%。有研究表明SCID小鼠的建模形成率遠遠高于裸鼠，4周后觀察病灶仍保持其固有的內(nèi)膜組織形態(tài)［28-29］。

2 EMT動物模型的分類

2.1 病證結(jié)合動物模型

隨著中醫(yī)學的發(fā)展，將病與證結(jié)合起來構(gòu)造動物模型逐漸受到了研究者的青睞。崔陽陽等［30］為了使動物模型的辨證更具備切實性，運用中醫(yī)四診辨證的基礎(chǔ)上，根據(jù)辨證結(jié)果采取“以方測證”的措施來進一步證明動物造模是否成功。崔軼凡等［31］運用“寒凝血瘀、墮胎傷腎”中醫(yī)病因理論成功構(gòu)建了腎虛血瘀型EMT大鼠模型，并采用《金匱要略》溫經(jīng)湯加減和《傅青主女科》調(diào)肝湯以方測證進一步評判所建造的腎虛血瘀型EMT動物模型。賈云波等［32］模擬婦科“冒雨涉水，感受寒邪”的病因，依據(jù)“寒邪傷陽”的中醫(yī)理論，與傳統(tǒng)的“自體移植”EMT動物模型相結(jié)合，建立病證結(jié)合的腎陽虛血瘀證EMT動物模型。運用病證相結(jié)合的動物模型，更加符合中醫(yī)疾病發(fā)生的特點，且具有一定的定量性和客觀性，為中醫(yī)與世界接軌奠定了堅實的基礎(chǔ)，成功跨出了飛躍性的一步。

2.2 EMT體外三維模型

現(xiàn)有的EMT體外模型的主要局限性在于它們采取二維模型，即通過在組織培養(yǎng)上以單層形式培養(yǎng)內(nèi)異癥上皮細胞而建立的模型。近年來，三維模型逐漸成了新的研究方向，三維模型在二維的基礎(chǔ)上引進了細胞外基質(zhì)，為多方向細胞生長創(chuàng)造了微環(huán)境，從而可以更完美地察看細胞的侵犯性，再現(xiàn)異位子宮內(nèi)膜細胞的局部粘連、侵襲和遷移過程，有利于EMT發(fā)病機制的研究。Tsuno A等［33］構(gòu)建的體外EMT基質(zhì)細胞培育模型，為探索內(nèi)膜細胞與基質(zhì)細胞間的彼此影響機制提供了更好的平臺。Mehasseb MK等［34］在體外三維模型的創(chuàng)建中，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細胞浸潤的深淺受到子宮肌層細胞的影響，揭示EMT的發(fā)病與子宮肌層可能有關(guān)。Brueggmann D等［35］以聚甲基丙烯酸2-羥基乙酯作為支架，建立體外三維培養(yǎng)模型，所采用的子宮內(nèi)膜異位表皮細胞系16與12Z于組織形態(tài)學和基因表達方面與EMT表現(xiàn)更相似。

2.3 熒光EMT動物模型

目前，熒光EMT動物模型在EMT的基礎(chǔ)研究方面應(yīng)用日益廣泛。EMT動物模型的光學成像技術(shù)主要采用熒光染料法和熒光素酶生物發(fā)光，如熒光染料標記內(nèi)膜、基因轉(zhuǎn)染以及熒光轉(zhuǎn)基因動物在體內(nèi)膜進行構(gòu)建EMT動物模型［24］。劉斌等［36］成功采用Ad-eGFP轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜腺上皮細胞和基質(zhì)細胞混懸液建造了裸鼠皮下人EMT活體熒光觀察模型，形成率高，體外熒光時間更長。袁華等［37］構(gòu)建了一種可以使學者們于同一動物體內(nèi)利用綠色熒光蛋白在一定時段內(nèi)非侵入性動態(tài)監(jiān)測EMT病變發(fā)生發(fā)展情況的EMT動物模型，為EMT病因及治療的研究提供有效的工具。關(guān)綺蕙等［38］運用慢病毒載體將熒光素酶和紅色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)入內(nèi)膜組織并培養(yǎng)48 h，將等體積的人子宮內(nèi)膜腺上皮細胞和基質(zhì)細胞混懸液注射到BALB/C雌性裸鼠腹腔內(nèi)，成功構(gòu)建了人子宮內(nèi)膜異位癥的可示蹤裸鼠模型。

疾病的發(fā)生常是由于六淫、癘氣、七情、飲食、勞逸、創(chuàng)傷等多方面因素相互作用的結(jié)果，說明引起疾病的原因具有復(fù)雜多樣性。因此采取多因素造模方法，更有可能復(fù)制出與臨床疾病證候相符的動物模型。造模過程中首要分析該證候病因的主次，嚴格監(jiān)控各項因素，保障動物模型的的一致性和統(tǒng)一性。

體外三維模型在研究細胞的增長、黏附、侵襲性以及不同細胞之間的相互影響方面比體內(nèi)模型有著更明顯的優(yōu)勢。構(gòu)建EMT體外三維細胞模型有助于保持內(nèi)膜細胞的生物學特征，更好地仿制致病的微環(huán)境，察看細胞的生長狀況，但體外三維模型在EMT遠處遷移特點的觀測方面有著一定的限定性，另外檢測系統(tǒng)有待進一步完善。EMT動物模型通過熒光轉(zhuǎn)染技術(shù)建立，雖然其定位準確，但目前無定量植入和觀察病變的客觀標準。其熒光表達時間可持續(xù)長達4周，卻僅限于EMT早期相關(guān)的研究。再者熒光表達靈敏度高，特異性好，適用于異位病灶的探測觀察與研究，但不宜用于盆腹腔深部病灶的觀察。

3 小結(jié)

在體研究的局限性推動了動物模型的多樣化，構(gòu)建可重復(fù)的、可控的EMT動物模型是研究EMT的發(fā)病機制、治療方法以及藥物療效評價的主要實驗載體。各種動物模型在EMT的研究中各有特點，但同時存在一些問題，不能完全滿足實驗需求。如采用動物模型的品系不統(tǒng)一，建模時間不同步，延誤了整個實驗的建模時間，導致模型的完成、藥物的給予、病變的觀察以及材料的提取等具有不均一性，為實驗增加了非處理因素，使得模型在效果上存在一定的差異，進而導致實驗結(jié)果不能受到國際上廣泛認可。在以后的EMT動物模型研究中，我們應(yīng)該逐步形成一個完善的評價系統(tǒng)，以中醫(yī)理論為支撐，運用多學科知識采取現(xiàn)代化手段建造合適的EMT動物模型，為研究EMT構(gòu)建一個與臨床實際更貼切的實驗載體。