口蹄疫滅活疫苗生產(chǎn)工藝中新生牛血清的應用進展

張峰宇

（中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅蘭州 730046）

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的偶蹄動物（牛、羊、豬等）一種急性、熱性、高度接觸性和快速遠距離傳播的動物傳染性疾病，F(xiàn)MD被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為A類傳染?？谔阋叩陌l(fā)生和流行嚴重影響了社會經(jīng)濟發(fā)展和畜牧業(yè)的健康發(fā)展，是我國乃至全世界急需控制的重大動物疫病之一。防控口蹄疫的方法有：撲殺、消毒、隔離、強制免疫等，我國采取疫苗免疫和撲殺相結合的綜合措施防控口蹄疫，目前接種疫苗已在防控口蹄疫中占主導地位。

口蹄疫疫苗生產(chǎn)工藝包含：原材料檢驗—培養(yǎng)基配制—種子細胞庫細胞保存和復蘇—種子細胞制備——中毒庫中毒制備（轉瓶、懸浮）——生產(chǎn)用病毒制備——病毒液收集——病毒純化、濃縮——病毒液檢驗——病毒滅活——滅活病毒檢驗——疫苗乳化——疫苗分裝——疫苗包裝——疫苗入成品庫——疫苗成品檢驗——批簽發(fā)——銷售出廠。

細胞培養(yǎng)是疫苗生產(chǎn)工藝中不可或缺的重要環(huán)節(jié)。血清用做細胞培養(yǎng)中最常見的天然培養(yǎng)基，富含蛋白、脂肪酸、白蛋白、球蛋白、纖維粘連素、多肽、激素、胰島素、氨基酸、葡萄糖、酮酸及其他微量元素。

1 材料 儀器

1.1 材料

（1）細胞 BHK21細胞F16代，由中農(nóng)威特生物科技股份有限公司提供。BHK21細胞是1961年3月，科學家從5只不知道性別的新生1日齡敘利亞倉鼠（又名金黃色倉鼠）腎臟分離培養(yǎng)而成，1964年8月，凍存的原代細胞經(jīng)45代傳代培養(yǎng)克隆獲得，通過馴化進行懸浮培養(yǎng)，主要用于口蹄疫疫苗和狂犬疫苗的生產(chǎn)。

（2）低血清細胞培養(yǎng)液 由中農(nóng)威特生物科技股份有限公司提供，其配制及分裝方法參考文獻。

（3）培養(yǎng)基 北京清大天一生物技術有限公司、宜興賽爾生物科技有限公司、甘肅建順生物科技有限公司、

（4）新生牛血清（國內(nèi)知名生產(chǎn)廠家）：甘肅定西聚信生物工程有限責任公司、內(nèi)蒙古維克生生物技術股份有限公司、天津迪瑞生物科技有限公司、蘭州民海生物工程有限公司。

（5）碳酸氫鈉：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司

1.2 儀器設備 小方瓶、三角燒瓶、超凈工作臺、顯微鏡、吸管、移液器、離心機、生物反應器、恒溫水浴箱、恒溫搖床

2 試驗方法

2.1 貼壁細胞培養(yǎng)

2.1.1 單一血清培養(yǎng)

分別將甘肅定西聚信生物工程有限責任公司、內(nèi)蒙古維克生生物技術股份有限公司、天津迪瑞生物科技有限公司、蘭州民海生物工程有限公司，四種血清以5%的含量添加至BHK21細胞，在小方瓶中處于相同的培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)傳代，顯微鏡下觀察細胞貼壁、細胞倍增、生長形態(tài)、分裂、細胞密度及細胞活力。

實驗結果顯示：不同廠家的新生牛血清在進行BHK21細胞培養(yǎng)工藝中，培養(yǎng)效果都存在一定的差異，細胞活力在74～76%之間，要獲得高密度、高細胞活力的細胞，血清來源的篩選和質量控制至關重要。

2.1.2 混合血清培養(yǎng)

甘肅定西聚信生物工程有限責任公司；天津迪瑞生物科技有限公司；內(nèi)蒙古維克生生物技術股份有限公司；蘭州民海生物工程有限公司四種血清按相同的比例1.25%混合和按不同比例（總含量5%）混合，在小方瓶中處于相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)BHK21細胞，顯微鏡下觀察細胞貼壁、細胞倍增、細胞密度及細胞活力。

實驗結果顯示：混合血清培養(yǎng)的細胞倍增明顯提高，細胞活力在90%以上。

研究結果表明：在相同培養(yǎng)條件和環(huán)境下，每種單一血清培養(yǎng)的BHK21細胞形態(tài)都比較好，形態(tài)沒有大的差異，細胞活力75%；而四種混合血清培養(yǎng)的BHK21細胞形態(tài)更好，細胞倍增數(shù)比單一血清培養(yǎng)更高，細胞活力在90%以上。因此選用優(yōu)質的混合血清來培養(yǎng)BHK21細胞有優(yōu)勢。

2.2 懸浮細胞培養(yǎng)

2.2.1 低血清培養(yǎng)

BHK21懸浮細胞是一株廣泛運用于病毒繁殖，生產(chǎn)各種獸用疫苗的細胞，在口蹄疫滅活疫苗生產(chǎn)工藝中，主要采用低血清懸浮培養(yǎng)工藝進行細胞培養(yǎng)和病毒液制備。

在相同的培養(yǎng)條件下，將國內(nèi)知名廠家甘肅定西聚信生物工程有限責任公司、內(nèi)蒙古維克生生物技術股份有限公司、天津迪瑞生物科技有限公司、蘭州民海生物工程有限公司，四種不同新生牛血清按不同比例混合后，添加血清含量分別以1%，2%，3%在三角瓶，相同培養(yǎng)條件下在恒溫搖床進行懸浮細胞液培養(yǎng)。

結果顯示：BHK21懸浮細胞在添加含量1%血清進行懸浮培養(yǎng)時生長密度為2.8%左右，細胞活力為88%左右；BHK21懸浮細胞在添加含2%血清進行懸浮培養(yǎng)時生長密度為4.2%左右，細胞活力為98.3%左右；BHK21懸浮細胞在添加含2%血清進行懸浮培養(yǎng)時生長密度為4.4%左右，細胞活力為98.5%左右。

研究表明使用血清含量為2%以上的低血清進行懸浮細胞培養(yǎng)，其細胞密度、細胞活力均優(yōu)越于使用血清含量為1%的低血清懸浮細胞培養(yǎng)

2.2.2 無血清培養(yǎng)

無血清培養(yǎng)是在天然合成培養(yǎng)基的基礎上，通過添加組分不明確的血清替代物（無血清培養(yǎng)基）進行的細胞培養(yǎng)技術，主要用于生物反應器進行規(guī)模化培養(yǎng)。

無血清培養(yǎng)基有無動物來源組分培養(yǎng)基；無動物蛋白培養(yǎng)基；化學組分限定培養(yǎng)基四種。無血清培養(yǎng)基蛋白含量比較高，不利于下游產(chǎn)品的純化；無動物來源蛋白培養(yǎng)基只適用于少數(shù)細胞株的培養(yǎng)，基針對性強，一種無血清培養(yǎng)基只能適合某一類細胞的培養(yǎng)具有一定的應用局限性。無血清培養(yǎng)基由于營養(yǎng)不如血清全面，存在潛在的培養(yǎng)細胞所需的某些營養(yǎng)物質的不足；無血清培養(yǎng)基成本高。

研究表明，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞的適用面較窄，不能適用于所有類型細胞的生長增殖，且容易誘發(fā)細胞調(diào)亡。

3 結論

口蹄疫滅活疫苗生產(chǎn)工藝中，細胞培養(yǎng)方式歷經(jīng)了帖壁、懸浮，所用血清從單一到混合、血清用量從高濃度血清到低濃度血清，培養(yǎng)基從傳統(tǒng)合成培養(yǎng)基到無血清培養(yǎng)基。在整個發(fā)展過程中新生血清依然發(fā)揮其不可替代的作用。

血清是作為支撐和維持細胞培養(yǎng)必不可少的重要天然培養(yǎng)基。能為細胞生長提供必需的營養(yǎng)物質氨基酸、維生素、無機物、脂類物質、核酸衍生物、纖維粘連素、胎球蛋白、轉鐵蛋白、多肽、氨基酸、葡萄糖、酮酸及其他微量元素；可為維持細胞指數(shù)生長提供激素和各種生長因子：胰島素、腎上腺激素、類固醇激素、成纖維生長因子、上皮生長因子、血小板生長因子，促生長激素；血清中的多肽可以促進細胞增殖因子數(shù)量的增加和纖維細胞生長因子以及神經(jīng)細胞生長因子的增加；血清中的促接觸和伸展因子，保護帖壁培養(yǎng)的細胞不受機械損傷。

血清在促進成纖維細胞生長的同時，抑制表皮細胞的生長；血清中的多胺氧化酶與精胺、亞精胺發(fā)生多胺反應行動聚精胺，抑制細胞生長。不同廠家、不同批號的血清質量存在很大差異，難以實現(xiàn)實驗操作和生產(chǎn)工藝的標準化；血清的獲取困難、價格昂貴、成本高等特點不適于大規(guī)模細胞培養(yǎng)。血清廠家的選擇，質量的穩(wěn)定性，血清使用量的最佳比例不僅影響細胞培養(yǎng)和病毒液的生產(chǎn)質量，對于控制和降低生產(chǎn)成本，后續(xù)純化濃縮效果均有較大影響。

4 展望

口蹄疫滅活疫苗生產(chǎn)工藝中，選用血清為最天然的培養(yǎng)基，需進一步研究出血清明確的組分、產(chǎn)生毒性因素和鏟除的方法、實現(xiàn)血清質量的穩(wěn)定性、更優(yōu)化的血清添加比例，使其能適應于規(guī)?；⒍鄻踊?、自動化的培養(yǎng)技術，降低生產(chǎn)成本，提高細胞培養(yǎng)產(chǎn)率和產(chǎn)物表達率，從而提高疫苗生產(chǎn)質量，生產(chǎn)出具有穩(wěn)定、安全、均一、有效、經(jīng)濟性能為一體的優(yōu)質疫苗產(chǎn)品，促進畜牧業(yè)的進一步健康發(fā)展。