非酒精性脂肪肝動物模型研究概況

隋曉丹

（長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 肝脾胃病科，吉林 長春）

0 引言

動物模型是人類研究疾病的基礎和重要手段，近年來，國內外對非酒精性脂肪肝動物模型的研究逐步提高，但如何建立與人類非酒精性脂肪肝發(fā)病機制相類似的動物模型仍是亟待解決的難題?，F(xiàn)將近年來成功復制非酒精性脂肪肝動物模型匯總如下。

1 高脂誘導非酒精性脂肪肝動物模型

在眾多非酒精性脂肪肝動物模型的方法中，高脂誘導非酒精性脂肪肝模型方法是最常見，最簡單的，其發(fā)病機制與臨床高脂血癥或肥胖引起的脂肪肝相近，成功率相對較高。

1.1 高脂飼料喂養(yǎng)造模

譚麗萍等[1]用高脂飼料喂養(yǎng)雄性70只SD大鼠12周，肉眼觀察大鼠肝臟體積明顯增大，包膜緊張，肝臟呈奶黃色，鏡下大鼠肝臟呈現(xiàn)不同程度的彌漫性肝細胞脂肪變性，炎性細胞浸潤，還可見壞死，但未見肝纖維化。高脂飼料：88%基礎飼料、10%豬油、2%膽固醇。理想的動物模型應當具備以下條件：與人類疾病特征相似；病變有一定發(fā)展過程，與人類發(fā)病過程接近；本方法簡單，價格低廉，死亡率低，復制率高，目前仍被廣泛使用，一般于第4周開始肝組織出現(xiàn)輕度的脂肪變性，造模8-12周后可達到中-重度大泡性肝脂肪變，伴轉氨酶升高，復制率可達100%。

范建高等[2]用高脂飼料喂養(yǎng)成熟雄性Wistar大鼠，6個月后大鼠呈輕到中度脂肪肝。大鼠體重和肝重明顯增加，血清和肝組織甘油三酯含量顯著高于正常組。高脂飼料：78%基礎飼料、10%玉米油、10%豬油、2%膽固醇。

華天爵等[3]用高脂飼料喂養(yǎng)大鼠12周，大鼠體重顯著增加，肝組織內膽固醇及甘油三酯含量顯著升高，光鏡下肝細胞胞漿內可見多個大小不等的脂滴。高脂飼料：50%基礎飼料、30%蛋黃、10%奶粉、10%豬油。本造模方法與兒童單純性肥胖癥的發(fā)病過程相似，因此對兒童單純性肥胖癥合并脂肪肝的防治研究有一定意義。

王敏[4]用高脂食料喂養(yǎng)大鼠16周，模型組大鼠體重 持續(xù)增加，16 周后 檢測血清TC、TG、FFA 及肝組織勻漿TC、TG含量顯著增高，病理組織學提示肝臟脂肪變性同時伴有炎癥和壞死，提示大 鼠非酒精 性脂肪肝模型建立成功。高脂飼料：普通飼料77%、膽固醇1%、豬油20%、花生米5%、奶粉5%、白糖2% 。

Fu 等[5]采用普通飼料添加15%玉米粉和3%膽固醇飼養(yǎng)大鼠12 周，生化指標顯示模型組大鼠肝臟TC、 TG 水平，血清 TC、TG 和 LDL 水平顯著高于對照組。肝臟病理學切片顯示模型組大鼠肝細胞內出現(xiàn)大泡性和小泡性脂肪變性。該模型所用飼料的營養(yǎng) 結構與東方人群的飲食結構類似，都是以糖類為主 要的能量來源，可以作為模擬東方人群脂肪肝疾病的動物模型。

李文崗等[6]參照美國的CMDD飼料配方[7]改良高脂飼料喂養(yǎng)大鼠28天，大鼠肝臟表明有油膩感，鏡下肝細胞內見大量脂滴，肝竇被擠壓變窄，肝細胞形態(tài)變不規(guī)則。配方成分：蔗糖360g、豬油250g、右旋麥芽糖200g、玉米粉50g、植物纖維素50g、黑豆30g、食鹽7.5g、CaCO32.5g、MgO 1.5 g、維生素E0.5g、維生素A15000U、維生素D21500 U。CMDD飼料能提供大鼠生長所需成分，但費用較高，國外的非酒精性脂肪肝模型常用。本配方在CMDD飼料基礎上進行改良，具有CMDD飼料的可食性，但費用降低，造模時間縮短。

1.2 高脂乳劑灌胃造模

Charles等[8]以高脂乳劑給大鼠灌胃，3周后進展成全小葉肝細胞脂肪變，YP2E1 mRNA表達顯著下調，I型膠原mRNA表達和腫瘤壞死因子-α水平顯著增強，誘發(fā)氧化應激和線粒體損傷。高脂乳劑：71%脂肪、18%蛋白質、11%碳水化合物。

祁培宏等[9]每日用脂肪乳劑(lmL/100g)給大鼠灌胃，4周后血清和肝組織甘油三酯及膽固醇含量顯著升高；肝組織蘇丹B染色見多個聚集成團的黑色脂滴；HE染色肝細胞體積變大，胞漿內見脂肪空泡。脂肪乳：20%豬油、10%膽固醇、5%乳清酸、l%蛋黃粉。

Zou氏等[10]用花生油與豬油比較，以高脂乳劑（10mL/Kg）每日給大鼠灌胃1次，6周后大鼠體重和肝指數(shù)顯著高于正常組；血清和肝組織中高油三脂、膽固醇、游離脂肪酸均顯著升高；肝細胞胞漿空泡化，并伴有大量炎癥細胞浸潤，實質細胞內有大小不等的脂質小滴沉積。成功復制出非酒精性脂肪肝性肝炎模型，為進一步研究脂肪性肝炎的發(fā)病機制和防治提供了新方法，并證實花生油富含多不飽和脂肪酸造模效果比豬油更理想。高脂乳劑：花生油400g、蔗糖150g、奶粉80g。

1.3 腸外營養(yǎng)造模

Zheng氏等[11]實驗將成年Wistar大鼠腸外營養(yǎng)造模，使用深靜脈插管技術和電腦輸液泵，給予大鼠以3mL/h的速度持續(xù)滴注營養(yǎng)液。當非蛋白含量達腸外營養(yǎng)液的33%以上，或者總熱量中總攝入量達到83%以上時，1周時間即可造模成功，病理可見大鼠的肝臟組織出現(xiàn)明顯的脂肪變性。Ling[12]等采用腸外營養(yǎng)造模4d，生化指標顯示模型組大鼠血清 C-反應蛋白和肝臟 TG 水平均顯著高于對照組，血清 TG 水平顯著低于對照組。本方法雖然具有復制時間短，相對成功率較高的優(yōu)點，但在實驗研究中的廣泛應用仍受到很大限制，主要因為其操作過于復雜。

2 藥物性誘導非酒精性脂肪肝動物模型

2.1 四環(huán)素

孫創(chuàng)斌[13]每天給予小鼠腹腔注射四環(huán)素2.3g/kg，4天即可復制出非酒精性脂肪肝模型。血清膽固醇和甘油三酯未見升高，但鏡下病理可見顯著肝細胞脂肪變性，胞漿內充滿大量脂肪空泡，多個小脂滴形成，并見明顯核偏移。四環(huán)素可能通過2種途徑誘發(fā)肝細胞脂肪變性：抑制肝細胞線粒體對脂肪酸的氧化和肝內甘油三酯的轉運。

2.2 丙戊酸

每日給予大鼠腹腔注射丙戊酸[14]的中間產(chǎn)物2-丙基-4-環(huán)戊烯酸(0.7mmol/kg)或4-環(huán)戊烯酸(1.0mmol/kg)，注射5天后大鼠肝細胞小泡性脂肪變性即可達85%以上，并伴線粒體形態(tài)的改變。

2.3 乙硫氨酸

孫蓉[15]用乙硫氨酸0.25g/kg給大鼠灌胃，2天后即可造成肝臟脂肪變性，肝內甘油三酯含量顯著升高，但血清甘油三酯、膽固醇、葡萄糖均下降。鏡下病理可見肝細胞肥大，有明顯脂滴，炎細胞浸潤少見，無明顯纖維化。抑制肝內蛋白質的合成，減少載體脂蛋白復合物的生成，使甘油三酯的轉運發(fā)生障礙，在肝臟內儲積進而引起肝臟脂肪變性。

2.4 四氯化碳

四氯化碳[16]是復制非酒精性脂肪肝動物模型實驗研究中最早應用的誘導劑。采用0.5mL/Kg四氯化碳中性茶油溶液，每周2-3次大鼠皮下注射，3-4周即可復制出中至重度脂肪肝。大鼠血清甘油三酯顯著升高，肝臟體積明顯增大，呈褐黃色，鏡下可見肝細胞內廣泛大泡性脂肪變、炎癥細胞浸潤劑肝細胞壞死。四氯化碳可能通過加重脂質過氧化反應而引起脂肪肝。本方法雖然造模時間較短，操作簡單，但四氯化碳有肝毒性，易造成嚴重的肝細胞壞死、炎癥及纖維化，死亡率較高，且其發(fā)病機制也與人類脂肪肝形成機制有較大差異。

顧恪波等[17]實驗研究證實小劑量的四氯化碳豆油溶液持續(xù)6周皮下注射配合高脂飲食，非酒精性脂肪肝造模效果滿意。給予大鼠背部后側皮下注射40%四氯化碳豆油溶液，首次0.4mL/100g，前3周均給予大鼠40%四氯化碳豆油溶液0.2mL/100g皮下注射，后3周給予40%四氯化碳豆油溶液0.1mL/100g，同時配合高脂飼料：82.5%普通飼料、10%豬油、5%蛋黃粉、2%膽固醇、0.5%膽酸鈉。6周末是大鼠血清和肝臟組織中甘油三酯及膽固醇含量均顯著升高。鏡下可見肝細胞呈小泡、大泡混合樣脂肪變，偶見炎細胞浸潤、散在點狀壞死灶。與40%CCl4豆油溶液常用劑量（0.3mL/100g）皮下注射結合高脂飲食所造模型相比，肝臟脂肪變性程度輕，肝功能損傷明顯減輕。故本方法能顯著減輕四氯化碳對肝功能的影響和其所致的肝損傷。

3 高脂飼料配合藥物誘導非酒精性脂肪肝動物模型

劉英宏等[18]應用膽鹽，加入高脂飼料中喂養(yǎng)大鼠，9周后大鼠血清膽固醇和甘油三酯水平顯著升高，肝臟病理切片進行HE染色后，鏡下可見肝細胞典型脂肪變性，肝細胞胞漿內脂滴顯著增多，肝細胞核固縮。喂養(yǎng)飼料：93.75%基礎飼料、5%豬油、1%膽固醇、0.25%膽鹽。

李文彪等[19]用高脂飼料加入甲基硫氧嘧啶喂養(yǎng)大鼠8周，大鼠肝組織均出現(xiàn)不同程度的脂肪及炎性細胞浸潤，胞漿內充滿大量脂肪空泡。喂養(yǎng)飼料：87.8%普通飼料、0.2%甲基硫氧嘧啶、2%膽固醇、10%豬油。

秦紅波等[20]使用丙硫氧嘧啶和豬膽鹽，加入高脂飼料中喂養(yǎng)大鼠，4周后大鼠可進展為輕到中度脂肪肝，鏡下可見肝細胞腫脹，胞漿內充滿大小不等脂肪空泡，核偏移。喂養(yǎng)飼料：89.3%基礎飼料、6%豬油、4%膽固醇、0.5%豬膽鹽、0.2%丙硫氧嘧啶。大鼠對高膽固醇和高脂肪容易出現(xiàn)耐受性，因此，對外源性膽固醇只能達到40%的吸收率。而在高脂基礎飼料中加入少量膽酸鹽，能夠使外源性膽固醇的吸收增加。甲基硫氧嘧啶或丙基硫氧嘧啶是甲狀腺抑制藥，在此應用能夠抑制膽固醇在肝臟內轉變?yōu)槟懼?，進而誘發(fā)高脂血癥，促使肝內膽固醇蓄積，大大縮短了建模時間。

王倩等[21]用高脂飼料加入蔗糖、豬膽鹽和丙硫氧嘧啶喂養(yǎng)大鼠5周，肉眼觀察大鼠肝臟體積增大，有油膩感，呈奶黃色；鏡下可見彌漫性肝細胞空泡變性，可見脂滴聚集，無明顯炎性改變、壞死及纖維化。血清和肝臟組織內甘油三酯及膽固醇含量顯著升高。血清SOD活性降低，MAD含量明顯升高。喂養(yǎng)飼料：82.3%基礎飼料、10%豬油、5%蔗糖、2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙硫氧嘧啶。

胡克章等[22]用高脂飼料加入丙硫氧嘧啶喂養(yǎng)大鼠30天，大鼠肝臟呈黃白色，肝臟和血清中甘油三酯、膽固醇均升高。血清ALT、AST升高，肝臟MDA含量升高、SOD活性降低。大鼠肝細胞呈輕至重度脂肪變，以中度脂肪變?yōu)橹鳎毎|中見大泡性脂滴。喂養(yǎng)飼料：72.8%基礎飼料、10%豬油、10%蔗糖、5%蛋黃粉、2%膽固醇、0. 2%丙基硫氧嘧啶。本配制方法更符合中國人飲食結構，而且造模時間短，費用較低，而且停止高脂配方喂養(yǎng)后病變逆轉較慢，為非酒精性脂肪肝的防治藥理實驗研究提供良好基礎。

張瑜等[23]用豬膽鹽、丙二醇配制成高脂乳劑每日給大鼠灌胃（1.5mL/100g），10周后大鼠血清和肝臟組織中甘油三酯及膽固醇含量顯著升高。病理可見肝內灶片狀肝細胞脂肪變性，以肝小葉中央?yún)^(qū)尤著，亦可見肝細胞點狀壞死。高脂乳劑：膽固醇10g、豬油30g、豬膽酸3g、丙二醇15mL、吐溫80 15mL，加蒸餾水至100mL。

趙文霞[24]在高脂飼料喂養(yǎng)大鼠的基礎上配合四環(huán)素腹腔注射造模。于造模第1天腹腔注射濃度為15mg/100g的四環(huán)素，此后每6天腹腔注射1次濃度為11mg/100g的四環(huán)素，大鼠肝臟在腹腔注射6次后即可呈中-重度肝細胞脂肪變，以中央靜脈周圍病變最為顯著，鏡下可見肝細胞明顯腫脹，胞漿內可見大量脂肪空泡和多個大小不一的脂滴，并見核偏移，偶見炎細胞浸潤和壞死，無明顯纖維化。同時給予高脂飼料：1%膽固醇、84%基礎飼料、5%蛋黃粉、10%豬油。

4 特殊品系先天遺傳性脂肪肝動物模型

4.1 ArKO小鼠

ArKO（aromatase knockout）小鼠[25]脂肪肝模型是通過芳香酶基因Cyp9敲除的方法所造成。因為ArKO小鼠不能合成內源性雌激素，進而影響脂肪的代謝，所以無論雄性或雌性ArKO小鼠腹腔內脂肪細胞的數(shù)量和體積均顯著高于正常小鼠。

4.2 ob/ob小鼠

ob/ob小鼠[26]是國外最常用的肥胖相關脂肪肝動物模型。是種瘦素基因自發(fā)變異，由于遺傳性瘦素缺乏，即使給予正常普通飼料喂養(yǎng)也會出現(xiàn)過度攝食，發(fā)生高胰島素血癥、胰島素抵抗及高脂血癥，進而自發(fā)的形成肥胖、脂肪肝和糖尿病。

4.3 FLS小鼠

FLS（fatty livershionogi）小鼠[27]能夠自發(fā)形成脂肪肝，并不伴肥胖和糖尿病，是近親繁殖造成的一個新種系。新生FLS小鼠肝細胞內即均含有脂滴，且隨小鼠的增長脂滴也進行性增大，肝內甘油三酯水平能達正常小鼠的5倍，還會伴肝功轉氨酶的增高，而且易自發(fā)形成肝細胞癌。FLS小鼠模型可為肝脂肪變合并肝癌的實驗研究提供基礎。

4.4 JVC小鼠

幼齡內臟脂肪變小鼠[28](JVC)因存在原發(fā)性肉毒堿缺乏，肉毒堿是轉運脂肪酸進入線粒體內，以進行脂肪酸氧化的必需物質。因此肉毒堿缺乏則會阻礙脂肪酸轉運入線粒體，使得脂肪酸在肝內蓄積，肝臟脂肪代謝失調導致肝細胞脂肪變。JVC小鼠出生3-28天，生長緩慢，肝細胞脂肪變性使肝臟腫大，在幼齡時即可出現(xiàn)脂肪肝。

特殊品系小鼠可建立先天性和幼年型脂肪肝模型，但其致病機制與人類后天營養(yǎng)障礙所致脂肪肝不同，僅適于特定病理機制的研究，而且費用昂貴、來源困難、死亡率高，因此實用性受到限制。

5 體外培養(yǎng)造模

王炳芳等[29]以正常人肝細胞株HL-7702為實驗對象，建立非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎的離體細胞模型。選用中長鏈脂肪乳劑注射液加入細胞培養(yǎng)液，造成肝細胞脂肪代謝紊亂，模擬非酒精性脂肪肝的發(fā)病過程，培養(yǎng)肝細胞建立脂肪肝細胞模型，在此基礎上傳代培養(yǎng)，模擬體內過氧化物增多的二次打擊導致的非酒精性脂肪性肝炎的發(fā)病過程，建立非酒精性脂肪性肝炎模型。