轉(zhuǎn)色期葡萄果肉代謝組變化對土壤水分的響應(yīng)

張坤，王玉安，郝燕

（1.濰坊學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東濰坊261061；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院林果花卉研究所，蘭州730070）

0 引言

【研究意義】紅地球葡萄（VitisviniferaL.cv.Red Globe），歐亞種，1986年和1987年先后由鄭州果樹所、沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)引入中國[1]，是我國種植面積最大的葡萄品種之一，近年來其種植面積呈下降趨勢。積溫低的地區(qū)，如西北地區(qū)的高海拔區(qū)域，東北地區(qū)等，很難滿足其正常成熟[2]，不適宜在該區(qū)種植區(qū)。但利用設(shè)施，加上紅地球葡萄晚熟的品種特性和可延遲采摘的特點，西北地區(qū)設(shè)施延遲栽培[3]的紅地球葡萄銷售時間一般可延遲至12月以后，經(jīng)濟效益很高[4]，因此設(shè)施葡萄延遲栽培有廣闊的發(fā)展前景。影響葡萄成熟的因素很多，水分是其中一個主要因素，同時也是設(shè)施環(huán)境中最易控制的因素，葡萄成熟前降雨多，葡萄的成熟時間會被明顯延后[5]，表現(xiàn)為可溶性固形物積累減少，因此葡萄成熟前要嚴格控水，但在設(shè)施延后栽培模式下，適當(dāng)增加灌溉可能對其種植效果有益。葡萄不同生育期的發(fā)育特征不同，研究葡萄各階段代謝途徑的開啟或關(guān)閉，將有助于解釋果實發(fā)育的調(diào)控機制。

【研究進展】葡萄進入成熟期后最顯著的變化是果實由硬、酸，向軟、富糖轉(zhuǎn)變，且同一代謝途徑的代謝產(chǎn)物在果實發(fā)育中表現(xiàn)出協(xié)調(diào)變化[6]，而碳水化合物的代謝變化對果實最終成分形成起著重要作用[7]。采用代謝組學(xué)可解釋不同發(fā)育階段葡萄漿果的成分差異[8]，不同品種的生長季節(jié)差異以及不同地區(qū)間的差異[9]。轉(zhuǎn)色期葡萄果實新陳代謝產(chǎn)生明顯變化，糖酵解中間產(chǎn)物和糖磷酸酯在轉(zhuǎn)色前下降，但在轉(zhuǎn)色后保持穩(wěn)定[10]，果實成熟期水分虧缺主要對苯丙酸、ABA、氨基酸、異戊二烯、類胡蘿卜素和脂肪酸代謝等產(chǎn)生較大影響，導(dǎo)致花藥黃素、黃酮醇和香氣揮發(fā)物增加，葡萄成熟進程被加速[11]。監(jiān)測代謝物的變化將有助于更好地解釋轉(zhuǎn)色前增加土壤水分誘導(dǎo)的果肉發(fā)育代謝變化，而這些變化最終構(gòu)成和確定了水果化學(xué)成分[12]?！厩腥朦c】延遲栽培與延遲采摘的區(qū)別在于葡萄成熟期時間不同，葡萄轉(zhuǎn)色意味著正式進入熟期，轉(zhuǎn)色前增加土壤水分，維持樹體較高水平的營養(yǎng)生長可能延緩這個過程，生產(chǎn)中實現(xiàn)設(shè)施葡萄延遲栽培整個物候期后移，對保持葡萄成熟和銷售期間的品質(zhì)將有重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究在葡萄轉(zhuǎn)色前期，通過增加灌溉的方式延緩葡萄成熟，比較不同處理間葡萄可溶性固形物及代謝組差異，為解釋轉(zhuǎn)色期葡萄果肉代謝特征及生產(chǎn)中實現(xiàn)對葡萄產(chǎn)期調(diào)控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

2018年，試驗在河西走廊中部的張掖市甘州區(qū)烏江鎮(zhèn)（E:100°23′23.7″，N:39°6′41.4″）進行，當(dāng)?shù)睾０? 450 m，年均氣溫7℃，≥10℃的年積溫2 140℃。選用我國西部廣泛使用的一種日光溫室，主體結(jié)構(gòu)為土夯墻體、鋼架支撐和棚膜，長×寬為50 m×8 m。試材為4 a 生紅地球葡萄，株行距0.8 m×1.5 m，獨龍蔓整形。

1.2 土壤水分控制

土壤水分控制在葡萄轉(zhuǎn)色前20 d 左右（8月下旬）開始實施，每行8株葡萄為1個小區(qū)，單獨控制，重復(fù)3次，利用探頭定點持續(xù)監(jiān)測（CS655，Campbell Scientific，USA）、采集（CR1000，Campbell Scientific，USA）土壤20 cm 深度處水分狀況，當(dāng)水分低于控制值時，自動灌溉系統(tǒng)中直流繼電器控制模塊（SDM-CD16S，Campbell Scientific，USA）控制電磁閥（150-PGA，Glendora，California，USA）開啟滴灌5 min，直至3個處理20 cm 處土壤深度的體積含水率分別達到0.15 m3/m3（低水分處理）、0.18 m3/m3（中水分處理）和0.24 m3/m3（高水分處理），其中高水分處理為對照。

1.3 樣品采集

葡萄進入轉(zhuǎn)色期時開始采樣（9月中旬），選擇的樹體生長位置、長勢一致，每個處理采樣的葡萄位置、大小及顏色一致。采樣前每個小區(qū)取20粒葡萄進行調(diào)查，重復(fù)3次，不同水分處理下果肉可溶性固形物量及編號，（表2），每個處理在10個果穗上隨機摘20個果粒，每個果粒切取2 g 果肉，混合后用錫箔紙包好，重復(fù)3次，放置液氮中，送樣測定葡萄果肉的代謝組。

1.4 測定與分析方法

取10 g 果肉組織液氮研磨，吸100 μL 液樣于EP 管，加400 μL 80%的甲醇后渦旋振蕩，于-20℃靜置60 min，14000 g、4℃離心20 min，取上清于1.5 mL離心管，真空冷凍干燥，殘留物以100 μL的復(fù)溶劑溶解，渦旋振蕩，14000 g、4℃離心15 min，取上清液進樣LC-MS 分析。

色譜條件：色譜柱為Accucore HILIC column（Thermo Fisher Scientific，USA），柱溫40℃，流速0.3 mL/min。正模式下流動相A為甲酸（0.1%），乙腈（95%），醋酸銨（10 mM），流動相B為甲酸（0.1%），乙腈（50%），醋酸銨（10 mM）；負模式下流動相A為乙腈（95%）和醋酸銨（10 mM，pH值9.0），流動相B為乙腈（50%），醋酸銨（10 mM，pH值9.0），色譜梯度洗脫程序見表1。

表1 色譜梯度洗脫程序Table1 Gradient elution procedure

質(zhì)譜條件：掃描范圍為m/z 100-1500；ESI 源設(shè)置：Spray Voltage：3.2kV；Sheath gas flow rate：35arb；Aux Gas flow rate：10arb；Capillary Temp：320℃。Polarity：positive，negative；MS/MS 二級掃描為data-dependent scans。

信息分析：將下機數(shù)據(jù)（.raw）導(dǎo)入CD 搜庫軟件，先篩選保留時間、質(zhì)荷比等參數(shù)，然后峰對齊（保留時間偏差為0.2 min，質(zhì)量偏差為5 mg/kg），隨后峰提取（質(zhì)量偏差5 mg/kg，信號強度偏差30%，信噪比3，最小信號強度100000，加入離子等信息），同時定量峰面積，并整合目標離子，預(yù)測分子式，比對mzCloud 數(shù)據(jù)庫，用blank 樣本去背景離子，QC樣本對定量結(jié)果歸一，得到鑒定和定量結(jié)果。

采用偏最小二乘法分析模型，第一主成分變量重要性投影（VIP），結(jié)合T-test的P值確定差異代謝物，閾值為VIP＞1.0，差異倍數(shù)FC＞1.5 或FC＜0.667 且P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品分析

設(shè)施延遲栽培模式下，轉(zhuǎn)色前降低土壤水分可明顯加速葡萄的成熟過程。由表2可知，果皮開始轉(zhuǎn)色時，低水分處理與中水分處理的果肉可溶性固形物含量已經(jīng)達到11%和9%左右，而高水分處理果實可溶性固形物量達到7.5%左右。說明控制土壤水分是調(diào)控葡萄熟期的一個有效途徑。

表2 樣品基本情況Table2 Basic information of samples

QC 樣本相關(guān)性可評價整個測定過程中系統(tǒng)的穩(wěn)定性，其相關(guān)性越高，說明測定方法的穩(wěn)定性越好，即數(shù)據(jù)質(zhì)量越高。由圖1可知，不同樣本間的相關(guān)系數(shù)均在0.99 左右，表明該測試系統(tǒng)能提供科學(xué)準確的試驗數(shù)據(jù)。由圖2可知，將所有試驗樣本和QC 樣本進行PCA 分析，QC 樣本的分布趨向聚集（紅色），QC 樣本差異較小，說明整個方法穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，其中第一和第二、第三主成分分別為27.88%、15.33%和13.09%。

圖1 總樣本相關(guān)性分析Fig.1 Pearson correlation between pos QC samples

圖2 總樣本PCA 分析Fig.2 PCA analysis of total samples

2.2 果肉差異代謝物分析

2.2.1 偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）

運用PLS-DA 方法，建立不同對比組與其代謝物表達量間關(guān)系模型，如圖3所示。參數(shù)R2和Q2越接近1，模型可信度越高。正模式下，3個對比組高水分對比低水分（A），高水分對比中水分（B），低水分對比中水分（C）的R2值達到0.99、1.00和0.98，表明所建模型的擬合度很高，Q2反應(yīng)模型預(yù)測能力，比較組A、B的值分別為0.44 和0.75，表明高水分對比中水分組與樣品間相關(guān)性最高，而低水分對比中水分組的Q2值為負，可能二者的差異性較小，導(dǎo)致所建模型的預(yù)測能力低。

圖3 3個對比組PLS-DA 分析Fig.3 PLS-DA analysis of three comparison groups

2.2.2 差異代謝物

3個比較組共鑒定了839個化合物，其中正模式下出現(xiàn)的差異代謝物數(shù)量最多，因此本文只對正模式下產(chǎn)生數(shù)據(jù)進行分析，見表3。低水分對比高水分組出現(xiàn)了27個差異代謝物，其中11個代謝物顯著上調(diào)，16個代謝物顯著下調(diào)。上調(diào)倍數(shù)最大的主要為色素類代謝物，包括鳶尾苷、乙酰丙酸、還原黃4、芍藥色素等；下降倍數(shù)最大的依次為丁醛、2-羥基戊二酸、吡咪唑以及全氟己烷等。

表3 低水分對比高水分處理的差異代謝物（POS）Table3 Differential metabolites of low moisture treatment compared with high moisture treatment(POS)

與高水分處理比較，正模式下中水分處理篩選出差異代謝物有13種表現(xiàn)為上調(diào)，20種下調(diào)，結(jié)果見表4。上調(diào)倍數(shù)較大的依次為西那司特（丁酸類）、苯磺酰胺和鉻-4-酮等代謝物，下調(diào)倍數(shù)較大的依次為甲酮、白藜蘆醇二聚體、鉻-6-酮、（+/-）-2-羥基戊二酸和全氟己烷等。

表4 中水分對比高水分處理的差異代謝物（POS）Table4 Differential metabolites of medium moisture treatmentcomparedwith high moisture treatment(POS)

正模式下低水分對比中水分間出現(xiàn)的差異代謝物較少（表5），其中表現(xiàn)為上調(diào)的差異代謝物有4種，表現(xiàn)為下調(diào)的差異代謝物只有2種。

表5 低水分對比中水分處理的差異代謝物（POS）Table5 Differential metabolites of low moisture treatmentcomparedwithmedium moisture treatment(POS)

2.3 KEGG 富集分析

只分析差異代謝物中顯著性富集的Pathway，與各代謝通路相關(guān)的差異代謝物的數(shù)目普遍較少，為1個或2個。低水分處理對比高水分處理組和中水分處理對比高水分處理組富集的代謝途徑中有8個相同，且富集到的差異代謝物均指向丙酮酸（表6）。與其他組合比較，低水分處理對比高水分處理組特有代謝途徑為抗壞血酸和醛糖酸鹽代謝和苯甲酸鹽降解途徑，且代謝途徑中的差異代謝物也指向丙酮酸。中水分處理對比高水分處理組特有代謝途徑為苯丙氨酸代謝（差異代謝物指向3-苯丙酸和丙酮酸）和細胞色素P450 對外源物質(zhì)代謝的影響代謝途徑。低水分處理對比中水分處理組中富集到的代謝途徑為糠醛降解（差異代謝物為5-羥甲基-2-糠醛）和不同環(huán)境中的微生物代謝途徑（差異代謝物為5-羥甲基-2-糠醛和對氯苯乙酮）。

表6 KEGG 富集結(jié)果Table6 Enrichment results of KEGG

3 討論

葡萄發(fā)育過程中生理代謝與農(nóng)藝措施關(guān)系密切[13]，環(huán)境因素、營養(yǎng)狀態(tài)、水分供應(yīng)、生物應(yīng)力、陽光照射和溫度等，均能影響葡萄發(fā)育過程中的成分組成[14]。轉(zhuǎn)色是葡萄正式進入成熟的標志，此期葡萄遇土壤缺水，花色苷、糖與香氣物質(zhì)的合成會增加，有機酸與果膠物質(zhì)量下降，總體表現(xiàn)為葡萄成熟加速。土壤水分環(huán)境不同，果實的成熟進程也不一致。本研究顯示，葡萄轉(zhuǎn)色期低水分處理與高水分處理的代謝組相比，除與果實色素積累相關(guān)的代謝物外，低水分處理下乙酰丙酸的FC值上調(diào)倍數(shù)較大，它是木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的脫水產(chǎn)物[15]，而纖維素分子決定細胞壁骨架[16]，所以乙酰丙酸上調(diào)意味著漿果向變軟的方向發(fā)展，即低水分處理加速果實成熟，因此生產(chǎn)中可噴施乙酰丙酸類物質(zhì)可促進果實著色、軟化[17]。低水分處理與高水分處理差異代謝物比較，F(xiàn)C值下調(diào)較大的是丁醛類化合物，其易產(chǎn)生青草香氣，是果實不成熟的特征，可見當(dāng)土壤水分很低時葡萄成熟進程加快，香氣物質(zhì)積累增多。轉(zhuǎn)色期，中水分處理與高水分處理相比，甲酮和白藜蘆醇二聚體FC下調(diào)較大，表明進入成熟期兩者的生成量迅速下降[18]。轉(zhuǎn)色期，低水分和中水分處理下的果肉差異代謝物很少，可能與其處于相近的發(fā)育過程有關(guān)，二者相比，低水分處理下，果肉的還原黃4、β-D-半乳吡喃糖苷類和對氯苯乙酮代謝物上調(diào)，有助于葡萄著色和香氣表達，而異抗壞血酸與抗壞血酸功能相似，在葡萄漿果中，抗壞血酸作為酒石酸的前體，在果實發(fā)育過程中逐漸升高，并在果實成熟期達到最大值[20]，這些現(xiàn)象也證實較高的土壤水分有助于延緩果實成熟。同時也發(fā)現(xiàn)低水分處理與中水分處理相比，果肉中差異代謝物5-羥甲基-2-呋喃甲醛（HMF）下調(diào)，這是因為葡萄進入成熟期后，蔗糖會降解成葡萄糖和一個非常活躍的呋喃果?；栯x子，這種陽離子可以有效地直接轉(zhuǎn)化為HMF，因此受水環(huán)境影響造成的蔗糖量降低可能是造成HMF代謝物下調(diào)的主要原因[21]。

植物果實成熟期間，丙酮酸作為葡糖異生作用的前體，轉(zhuǎn)化為糖及能量[22]，本研究表明，低水分、中水分處理下的差異代謝物丙酮酸均顯著下調(diào)，且顯著富集于糖酵解/糖異生、磷酸鹽與磷酸鹽代謝、D-丙氨酸代謝、丙酮酸代謝等8個主要途徑，說明葡萄轉(zhuǎn)色期丙酮酸是最活躍的代謝物，這在多項研究中得到證實[23-24]。本研究在低水分對比高水分對比組中發(fā)現(xiàn)差異代謝物丁酸顯著上調(diào)，可能是丙酮酸經(jīng)氧化脫羧產(chǎn)生的乙酰CoA 與磷酸作用，生成乙酰磷酸，再在乙酸激酶催化下產(chǎn)生的乙酸造成。與低水分處理不同，中水分對比高水分中差異代謝物3-苯丙氨酸首先顯著富集于苯丙氨酸代謝途徑，苯丙氨酸可作為果實中酚類合成的前體，合成葡萄2-苯乙醇[25]，表明轉(zhuǎn)色初期中水分處理下葡萄有關(guān)香氣的物質(zhì)會大量產(chǎn)生。

4 結(jié)論

1）在西北地區(qū)，延遲栽培模式下，采用增加土壤水分措施能明顯延遲葡萄成熟時間，縮短葡萄成熟與采摘的時間間隔，更能體現(xiàn)“鮮”的特色，效益更高。

2）葡萄轉(zhuǎn)色前增加土壤水分能降低葡萄合成糖、香氣、色素的一些代謝物，增加有機酸與保持細胞壁結(jié)構(gòu)的一些代謝物量，延緩了葡萄成熟進程。

3）丙酮酸是葡萄轉(zhuǎn)色期最活躍的代謝物。