能力驗(yàn)證樣品中玉米赤霉烯酮含量測(cè)定的不確定度評(píng)定

陸春勝 馬 莉 陳云忠

(上海市崇明食品藥品檢驗(yàn)所，上海 202150)

玉米赤霉烯酮(zearalenone，以下簡(jiǎn)稱(chēng)ZEA)是由以禾谷鐮刀菌和三線鐮刀菌為主的鐮刀菌產(chǎn)生的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛存在于玉米、小麥等谷物中，可對(duì)人和動(dòng)物健康產(chǎn)生嚴(yán)重影響。其主要特點(diǎn)是具有類(lèi)雌激素樣作用，對(duì)雌性動(dòng)物的生殖系統(tǒng)損害極大，文獻(xiàn)報(bào)道其還能導(dǎo)致免疫抑制、肝腎損傷、具有潛在的致癌性[1-3]。目前可以使用高效液相色譜、氣相色譜、酶聯(lián)免疫、薄層色譜、酶聯(lián)免疫和生物傳感器等方法進(jìn)行檢測(cè)[45]。

能力驗(yàn)證是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的主要手段之一，通過(guò)參加能力驗(yàn)證可以綜合考察實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量運(yùn)行是否可靠，同時(shí)可以識(shí)別實(shí)驗(yàn)室存在的問(wèn)題，制定相應(yīng)的預(yù)防和糾正措施[5]。本實(shí)驗(yàn)室參加中國(guó)檢驗(yàn)檢疫測(cè)試研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心組織的玉米油中玉米赤霉烯酮能力驗(yàn)證，通過(guò)回收率t檢驗(yàn)，對(duì)測(cè)量結(jié)果進(jìn)行了修正，并給出了報(bào)告結(jié)果的測(cè)量不確定度。本研究建立了ZEA測(cè)量不確定度的評(píng)定方法，以期為實(shí)驗(yàn)室日常質(zhì)量控制提供參考[6-9]。

1 材料與方法

1.1 試劑、儀器與材料

1260 高效液相色譜配有熒光檢測(cè)器(美國(guó) Agilent Technology 公司)；ST 8R 冷凍離心機(jī)、REACTI-THERMⅢ 氮吹儀(美國(guó) Thermo Fisher 公司)；MS205DU 十萬(wàn)分之一電子天平、PL2002百分之一電子天平(瑞士 METTLER TOLEDO 公司)；ULTRA TURRAX 高速勻漿機(jī)(德國(guó) IKA 公司)。

乙腈、甲醇(HPLC，德國(guó) CNW 公司)；氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、吐溫-20、鹽酸(AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為T(mén)hermo Fisher GEN PURE PRO 制備的超純水。

玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品(98.0%，加拿大 TRC 公司)；玉米赤霉烯酮免疫親和柱(3 mL，美國(guó)Beacon公司)。

試驗(yàn)用玉米油樣品為中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心提供的能力驗(yàn)證樣品，能力驗(yàn)證計(jì)劃編號(hào)為ACAS-PT834，樣品編號(hào)分別為19-F935、19-G210；空白玉米油為市售。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱(chēng)取5.0 mg，置于50 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，得最終濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制：分別準(zhǔn)確吸取100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.03、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25和0.30 mL，用乙腈-水-甲醇(46∶46∶8，V/V)定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度為30.0、50.0、100.0、150.0、200.0、250.0和300.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.2.2樣品處理

本方法采用GB 5009.209—2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中玉米烯酮的測(cè)定》中第一法 高效液相色譜法測(cè)定樣品中ZEA的含量[5]，具體測(cè)定步驟見(jiàn)圖1。

圖1 玉米油中玉米赤霉烯酮含量測(cè)定步驟

樣本加標(biāo)：稱(chēng)取空白玉米油樣品40.0 g，加入100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.10 mL，混勻，余同圖1樣品處理過(guò)程。

1.2.4色譜條件

色譜柱：Agilent XDB C18 1.8 μm 0.3×10 cm；流動(dòng)相：乙腈-水-甲醇(46∶46∶8，V/V)；流速：0.6 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)274nm，發(fā)射波長(zhǎng)440 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：35℃。

1.2.5數(shù)學(xué)模型的建立

根據(jù)玉米油中ZEA的測(cè)定原理和方法，ZEA含量的計(jì)算公式為：

式中：X試樣中ZEA的含量，μg/kg；C測(cè)定試樣中ZEA的含量，ng/mL；V測(cè)定試樣的最終定容體積，mL；m試樣的稱(chēng)樣量，g；1000 單位換算系數(shù)；f稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來(lái)源分析

從測(cè)量過(guò)程和數(shù)學(xué)模型分析，樣品中ZEA測(cè)定不確定來(lái)源主要有：標(biāo)準(zhǔn)溶液、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣品稱(chēng)樣、處理過(guò)程和測(cè)量重復(fù)性等。不確定度來(lái)源因果關(guān)系見(jiàn)圖2。

圖2 不確定度來(lái)源因果關(guān)系

2.2 配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)系列溶液引入的相對(duì)不確定度urel(C)

配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)系列溶液引入的不確定度主要有以下幾個(gè)分項(xiàng)構(gòu)成[10-14]：ZEA標(biāo)準(zhǔn)品本身引入的不確定度urel(C1)；稱(chēng)量標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度urel(C2)；50mL容量瓶定容引入的不確定度urel(C3)；30～300μL可調(diào)移液器移液引入的不確定度urel(C4)；100 mL容量瓶定容引入的不確定度urel(C5)。

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)本身引入的不確定度urel(C1)

ZEA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)顯示，純度為98.0%，相對(duì)擴(kuò)展不確定度為2.0%(k=2)，引入的不確定度為u(C1)=2.0%/2=1.0%，其相對(duì)不確定度為urel(C1)=(1.0%/98.0%)×100%=1.020%。

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱(chēng)量引入的不確定度urel(C2)

2.2.3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶解定容引入的不確定度urel(C3)

2.2.4標(biāo)準(zhǔn)系列溶液移液引入的不確定度urel(C4)

2.2.5標(biāo)準(zhǔn)系列溶液定容引入的不確定度urel(C5)

2.2.6合成urel(C)

=1.227%

2.3 樣品稱(chēng)樣引入的相對(duì)不確定度urel(m)

2.4 待測(cè)樣品處理稀釋引入的相對(duì)不確定度urel(f)

根據(jù)方法，實(shí)驗(yàn)中共用到100 mL單標(biāo)線吸管1次，10 mL單標(biāo)線吸管2次，50 mL容量瓶1次，證書(shū)顯示100 mL單標(biāo)線吸管MPE為0.08 mL，10 mL單標(biāo)線吸管MPE為0.02 mL，50 mL容量瓶MPE為0.05 mL，均取矩形分布。乙腈和水的膨脹系數(shù)分別為1.37×10-3mL/℃和2.1×10-4mL/℃，設(shè)實(shí)驗(yàn)室溫度變化為4℃。

按照2.2.3的計(jì)算方法，分別算得其相對(duì)不確定度urel(f1)=0.320%，urel(f2)=0.337%，urel(f3)=0.076%，urel(f4)=0.126%。

由樣品稀釋處理引入的相對(duì)不確定度：

=0.487%

2.5 待測(cè)樣品復(fù)溶引入的相對(duì)不確定度urel(V)

根據(jù)方法，用1000 μL可調(diào)移液器定量加入1.0 mL流動(dòng)相溶解殘?jiān)?，證書(shū)顯示其擴(kuò)展不確定度為0.53 μL(k=2)，引入的不確定度為u(V)=0.53/2=0.265 μL，其相對(duì)不確定為urel(V)=(0.265/1000)×100%=0.026%。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)不確定度urel(Cpred)

配制的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液及待測(cè)樣品溶液重復(fù)進(jìn)樣2次，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo)，以峰面積值為縱坐標(biāo)，采用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度及其對(duì)應(yīng)的峰面積、校準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1，被測(cè)樣品測(cè)得數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

表2 被測(cè)樣品測(cè)得數(shù)據(jù)

采用最小二乘法擬合引入的測(cè)量不確定度u(Cpred)采用如下公式計(jì)算[15-19]：

式中：u(Cpred)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度，ng/mL；S標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合標(biāo)準(zhǔn)偏差，ng/mL；B1標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；p對(duì)樣品溶液的測(cè)定次數(shù)，本實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定2次；n標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)試次數(shù)，本實(shí)驗(yàn)中對(duì)7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液各重復(fù)測(cè)定2次，n=7×2=14；Cpred測(cè)試樣品濃度，ng/mL；C系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均濃度，ng/mL；Ai標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積；Ci標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，ng/mL；B0標(biāo)準(zhǔn)曲線截距。

將表1、表2數(shù)據(jù)分別帶入上述公式，得19-F935樣品u(Cpred)=1.46617 ng/mL，其相對(duì)不確定度為urel(Cpred)=1.46617/217.35399×100%=0.675%；得19-G210樣品u(Cpred)=1.48139 ng/mL，其相對(duì)不確定度為urel(Cpred)=1.48139/87.06576×100%=1.702%。

2.7 重復(fù)測(cè)定引入的相對(duì)不確定度urel(rep)

取6份1.2.2中的空白加標(biāo)樣品，按方法處理后進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得ZEA加標(biāo)含量及回收率見(jiàn)表3。

表3 玉米赤霉烯酮加標(biāo)含量及回收率表

2.8 合成相對(duì)擴(kuò)展不確定度Urel(X)

對(duì)各不確定度分量進(jìn)行匯總，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不確定度分量匯總表

樣品中ZEA含量測(cè)定的相對(duì)不確定度urel(X)按下式計(jì)算：

將數(shù)據(jù)代入上式，19-F935樣品的urel(X)為1.495%，19-G210樣品的urel(X)為2.162%。樣品中ZEA含量測(cè)定的合成擴(kuò)展相對(duì)不確定度Urel(X)按下式計(jì)算：

Urel(X)=k×urel(X)

k取2(包含概率為95%)，代入計(jì)算得19-F935樣品的相對(duì)擴(kuò)展不確定度Urel(X)為3.0%，19-G210樣品的相對(duì)擴(kuò)展不確定度Urel(X)為4.4%。

2.9 結(jié)果報(bào)告

其中urel(Vadd)為加標(biāo)用30～300 μL可調(diào)移液器的相對(duì)不確定度，加標(biāo)樣共使用6次。

表5 結(jié)果報(bào)告及能力驗(yàn)證參考值

3 結(jié)論

采用回收率不確定度來(lái)檢驗(yàn)回收率結(jié)果是否應(yīng)用于結(jié)果的修正，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)測(cè)得值需進(jìn)行回收率修正。修正后報(bào)告結(jié)果252.7 μg/kgU=3.0%(k=2)和100.8 μg/kgU=4.4%(k=2)，能力驗(yàn)證結(jié)果為滿(mǎn)意。

通過(guò)不確定度評(píng)定分析，本法中樣品稱(chēng)樣、樣品定容和樣品重復(fù)測(cè)量引入的不確定度影響均較小，在實(shí)際計(jì)算時(shí)可以忽略不計(jì)；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合是主要的不確定度來(lái)源；本法預(yù)處理過(guò)程復(fù)雜，樣品處理過(guò)程中引入的不確定度不可忽略。因此，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)選擇不確定度較小的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)設(shè)置合理的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍、增加平行樣品測(cè)定、確保HPLC系統(tǒng)穩(wěn)定性，以減小曲線擬合時(shí)引入的不確定度；實(shí)驗(yàn)員應(yīng)規(guī)范操作，在樣品過(guò)柱洗脫及氮吹時(shí)注意樣品損失，避免在復(fù)雜的樣品處理過(guò)程中將不確定度放大，從而提高檢測(cè)質(zhì)量。