高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)人血漿中美羅培南的濃度

陳玲 樓江 史長城 嚴(yán)偉 李晴宇 林能明

美羅培南屬碳青霉烯類抗菌藥物，對(duì)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)頭孢菌素酶的革蘭陰性桿菌和部分革蘭陽性桿菌具有良好的治療效果，對(duì)腹腔、皮膚、尿路和腦膜等部位感染治療均有效[1-2]。美羅培南屬時(shí)間依賴型抗菌藥物，抗菌效果取決于血漿藥物濃度高于病原菌最低抑制濃度（minimum inhibitory concentration,MIC）的保持時(shí)間。占總治療時(shí)間的40%以上時(shí)能產(chǎn)生最大抗菌效應(yīng)；推薦對(duì)使用美羅培南的患者進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)，部分重癥患者使用美羅培南可能達(dá)不到有效血藥濃度，從而導(dǎo)致治療失敗或耐藥細(xì)菌產(chǎn)生[3-4]。重癥感染、年齡、感染部位和生理狀態(tài)等可能影響美羅培南的藥效動(dòng)力學(xué)參數(shù)，監(jiān)測(cè)美羅培南血藥濃度，及時(shí)調(diào)整給藥方案具有重要的臨床意義[5-8]。本研究以雷尼替丁為內(nèi)標(biāo)，采用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器（high performance liquid chromatography-diode array detector，HPLC-DAD）檢測(cè)人血漿中美羅培南的濃度，觀察該檢測(cè)方法的效果，以期為臨床指導(dǎo)美羅培南血藥濃度測(cè)定和合理用藥提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 儀器 安捷倫1260高效液相色譜系統(tǒng)包括四元泵（型號(hào)：G1311B）、柱溫箱（型號(hào)：G1311B）、自動(dòng)進(jìn)樣器（型號(hào)：G1329B）和DAD檢測(cè)器（型號(hào)：G1315D）均為安捷倫科技有限公司產(chǎn)品，低速離心機(jī)（型號(hào)：DM0412S）、高速離心機(jī)（型號(hào)：D3024）和渦旋混合器（型號(hào)：MX-S）為美國賽洛捷克公司產(chǎn)品，超純水儀（型號(hào)：Thermo fisher LabTower ED1）為美國賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品。

1.2 藥品和試劑 美羅培南（中國食品藥品檢定研究院，純度 99.9%，批號(hào)：130506-201403，100 mg），雷尼替?。ㄖ袊称匪幤窓z定研究院，純度99.9%，批號(hào)：1001163-201607，100 mg），甲醇和乙腈（色譜級(jí)，德國默克公司），磷酸二氫鉀（分析純，上海泰坦化學(xué)有限公司），空白血漿為人體血漿，來自本院輸血科。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 分析柱是Agilent Zorbax Eclipse Plus C18（4.6 mm×100 mm，3.6 μm），柱溫 30 ℃；流動(dòng)相為25mmol/L KH2PO4-乙腈（92∶8，V/V，pH5.0），流速 0.8 ml/min，進(jìn)樣量50 μl，檢測(cè)波長和參比波長分別是308、380 nm。

1.3.2 溶液配置 美羅培南標(biāo)準(zhǔn)液配制：精密稱取20.62 mg的美羅培南標(biāo)準(zhǔn)品，加雙蒸水溶解并稀釋定容至 10 ml，得 2 062.0 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)液，放置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩＠啄崽娑?biāo)準(zhǔn)液配制：精密稱取17.74 mg的雷尼替丁標(biāo)準(zhǔn)品，加雙蒸水溶解并定容至10 ml，得1 774.0 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)液，放置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 樣品處理 精密吸取200 μl血漿放入1.5 ml離心管中，加入內(nèi)標(biāo)50 μl（雷尼替丁濃度為44.35 μg/ml），再加入400 μl甲醇，渦旋震蕩2 min混勻，在4℃下12 000 r/min進(jìn)行高速離心5 min，取上清液200 μl加入300 μl雙蒸水，渦旋震蕩1 min混勻，再次4℃下12 000 r/min高速離心5 min，吸取上清液50 μl進(jìn)樣。

1.4 方法學(xué)驗(yàn)證 依據(jù)《中國藥典2015版（第4部）》中的《生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》[9]對(duì)本研究方法專屬性、標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度、回收率和被測(cè)物穩(wěn)定性進(jìn)行觀察。

1.4.1 專屬性 取6份不同來源的未服用美羅培南和雷尼替丁的空白血漿，按“1.3.3”方法處理后進(jìn)樣，觀察本研究方法是否有內(nèi)外源性物質(zhì)干擾，觀察其專屬性。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取美羅培南標(biāo)準(zhǔn)液用雙蒸水逐級(jí)稀 釋得 5.15、10.3、20.6、51.5、103.0、206.0、515.0 和1 031.0 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)液，上述標(biāo)準(zhǔn)液用空白血漿稀釋10 倍，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度分別是 0.515、1.03、2.06、5.15、10.30、20.60、51.50 和 103.1 μg/ml，按“1.3.3”方法處理后進(jìn)樣，測(cè)得美羅培南和內(nèi)標(biāo)峰面積，以美羅培南濃度為橫坐標(biāo)（x），美羅培南和內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)（y），考察標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)性。

1.4.3 回收率和精密度 最低定量下限（lower limit of quantitation，LLOQ）是標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點(diǎn)，是能夠滿足可靠定量樣品中分析物的最低濃度，LLOQ應(yīng)滿足信噪比（signal-to-noise ratio，S/N）≥10。取美羅培南儲(chǔ)備液逐漸稀釋后得 5.15、20.6、206.0 和 825.0 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)液，用空白血漿稀釋10倍，得LLOQ和低、中、高濃度的質(zhì)控（quality control，QC）樣品，濃度分別是 0.515、2.06、20.6 和 82.5 μg/ml，按“1.3.3”方法處理后進(jìn)樣，每個(gè)濃度平行處理5份，計(jì)算日內(nèi)精密度和回收率，QC樣品連續(xù)3 d處理進(jìn)樣，計(jì)算日間精密度。根據(jù)《生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》[9]，LLOQ的回收率在80%～120%，精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）≤20%，QC的回收率應(yīng)在 85%～115%，精密度的 RSD≤15%[9]。

1.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) （1）短期放置穩(wěn)定性：將美羅培南QC 血漿放置于室溫保存 1、2、4和 8h，按“1.3.3”方法處理后進(jìn)樣，平行處理3份，比較實(shí)測(cè)值與理論值的偏差，在±15%內(nèi)表示穩(wěn)定。（2）自動(dòng)進(jìn)樣器放置穩(wěn)定性：將QC血漿按“1.3.3”方法處理，平行處理3份，置于20℃的自動(dòng)進(jìn)樣器中1、2、4和8 h進(jìn)樣，比較實(shí)測(cè)值與理論值的偏差，在±15%內(nèi)表示穩(wěn)定。（3）長期放置穩(wěn)定性：①凍存穩(wěn)定性：將QC血漿放置于-80℃冰箱中20、40和60 d，按“1.3.3”方法處理后進(jìn)樣，平行處理3份，比較實(shí)測(cè)值與理論值的偏差，85%～115%之間表示穩(wěn)定。②凍融穩(wěn)定性：將QC血漿放置-80℃冰箱凍保，室溫下溶解，反復(fù)凍融1、2和3次（每次凍融時(shí)間間隔超過12 h），按“1.3.3”方法處理后進(jìn)樣，平行處理3份，比較實(shí)測(cè)值與理論值的偏差，在±15%內(nèi)表示穩(wěn)定。③儲(chǔ)備液穩(wěn)定性：將美羅培南和雷尼替丁儲(chǔ)備液（第0天）用雙蒸水分別稀釋至10 μg/ml后直接進(jìn)樣，將上述標(biāo)準(zhǔn)液放置-80℃冰箱中20、40和60 d后直接進(jìn)樣分析，平行測(cè)定3次，比較放置后美羅培南和雷尼替丁峰面積與第0天測(cè)定峰面積的偏差，在±15%內(nèi)表示穩(wěn)定。

2 結(jié)果

2.1 專屬性 本研究條件下美羅培南和雷尼替丁的分離效果良好，保留時(shí)間分別是3.34、4.68 min，空白血漿不存在內(nèi)外源性干擾物質(zhì)，見圖1，本方法專屬性較高。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 美羅培南在0.515～103.1 μg/ml范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，y=0.0328x+0.00006，相關(guān)系數(shù)r=0.99972。

2.3 回收率和精密度 美羅培南LLOQ的回收率和精密度RSD分別是98.76%和1.67%，低、中和高濃度QC回收率在94.21%～107.61%，日內(nèi)和日間精密度的RSD均＜4%，表明美羅培南在該方法下回收率和精密度較好，見表1。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 短期穩(wěn)定性方面，美羅培南在室溫放置8 h穩(wěn)定，QC的準(zhǔn)確度為91.04%～95.15%。自動(dòng)進(jìn)樣器放置穩(wěn)定性方面，美羅培南的血漿處理液在自動(dòng)進(jìn)樣器放置8 h內(nèi)穩(wěn)定，QC的準(zhǔn)確度為90.78%～93.78%。長期穩(wěn)定性方面，美羅培南在-80℃凍存放置60 d內(nèi)穩(wěn)定，準(zhǔn)確度96.55%～98.06%。美羅培南在-80℃和室溫下反復(fù)凍融3次也穩(wěn)定，準(zhǔn)確度96.91%～100.34%，見表2。儲(chǔ)備液穩(wěn)定性方面，美羅培南和雷尼替丁儲(chǔ)備液在-80℃條件下存儲(chǔ)60 d穩(wěn)定，準(zhǔn)確度分別是95.82%～99.33%和96.40%～103.16%，見表3。

2.5 臨床應(yīng)用 用已建立的方法對(duì)5例使用美羅培南的重癥感染患者進(jìn)行穩(wěn)態(tài)谷濃度測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其血藥濃度個(gè)體差異大，見表4。

3 討論

圖1 高效液相色譜圖（a為空白血漿；b為美羅培南和雷尼替丁標(biāo)準(zhǔn)液；c為空白血漿中加美羅培南（0.515 μg/ml）和雷尼替丁；d為臨床樣本）

表1 美羅培南的回收率和精密度

表2 美羅培南在各種條件下的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

表3 美羅培南和雷尼替丁儲(chǔ)備液的穩(wěn)定性

表4 患者基本情況及美羅培南治療藥物監(jiān)測(cè)結(jié)果

3.1 內(nèi)標(biāo)的選擇 多數(shù)研究美羅培南測(cè)定方法的內(nèi)標(biāo)是甲硝唑或頭孢吡肟等抗菌藥物，或降壓藥氫氯噻嗪，但他們可能對(duì)測(cè)定結(jié)果有干擾[10-13]。本研究使用H2受體阻滯劑雷尼替丁作為內(nèi)標(biāo)，與頭孢類藥物相比，本品穩(wěn)定性更好，長期放置不易分解，現(xiàn)臨床也較少使用本品抑制胃酸分泌。與氫氯噻嗪相比，雷尼替丁干擾測(cè)定結(jié)果的概率較小，因此更適合做美羅培南血漿濃度測(cè)定的內(nèi)標(biāo)。

3.2 前處理的選擇 美羅培南的前處理方法有固相萃取和蛋白沉淀，固相萃取耗時(shí)且昂貴，本研究選用更簡(jiǎn)單的蛋白沉淀法[12，14]。研究初期嘗試使用甲醇蛋白沉淀后的上清液直接進(jìn)樣，發(fā)現(xiàn)對(duì)美羅培南和內(nèi)標(biāo)物的色譜峰形有較大影響，可能與美羅培南和雷尼替丁的水溶性強(qiáng)，直接進(jìn)樣因溶劑效應(yīng)導(dǎo)致色譜峰不對(duì)稱。有研究使用二氯甲烷稀釋蛋白沉淀液進(jìn)樣，二氯甲烷毒性大且易揮發(fā)，需要放置通風(fēng)廚中操作，同時(shí)對(duì)人體和環(huán)境也有一定危害[15]。本研究使用不同比例的雙蒸水對(duì)甲醇沉淀液進(jìn)行稀釋（甲醇沉淀液：水比例為 1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2和 1∶3），發(fā)現(xiàn) 1∶1.5 的比例既能滿足 LLOQ 的測(cè)定，色譜峰形也對(duì)稱。

3.3 檢測(cè)波長的選擇 紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長和被測(cè)物質(zhì)吸收有關(guān)，美羅培南的檢測(cè)波長大多介于296～304 nm[15-16]。與文獻(xiàn)報(bào)道類似[17]，本研究使用DAD檢測(cè)器對(duì)美羅培南和內(nèi)標(biāo)進(jìn)行全紫外波長掃描（190～440 nm，步進(jìn)值2 nm）。發(fā)現(xiàn)美羅培南和雷尼替丁在300～310 nm區(qū)域信號(hào)響應(yīng)較大，但空白血漿在300～304 nm波長時(shí)，美羅培南和雷尼替丁之間存在內(nèi)源性雜質(zhì)，但該雜質(zhì)在308 nm處無紫外波吸收，為了不影響美羅培南定量和響應(yīng)，將308 nm作為本研究檢測(cè)波長，為最大程度消除儀器基線噪音干擾，將380 nm作為本研究參比波長。

3.4 LLOQ的選擇 美羅培南是時(shí)間依賴型抗菌藥物，抗菌效果取決于血漿藥物濃度高于病原菌MIC的保持時(shí)間。為滿足美羅培南血藥濃度監(jiān)測(cè)的臨床需求，LLOQ應(yīng)接近歐洲抗菌藥物敏感判斷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)美羅培南敏感菌株的MIC[18]。本院對(duì)美羅培南敏感菌株的MIC接近 1.0 μg/ml，本研究 LLOQ 是 0.5 μg/ml，能滿足美羅培南的定量標(biāo)準(zhǔn)。

綜上所述，本研究建立了靈敏、快速和高效的人血漿中美羅培南的HPLC-DAD檢測(cè)方法，能夠滿足美羅培南在人血漿的藥物監(jiān)測(cè)工作，具有一定的實(shí)用價(jià)值。