基于線粒體DNA D-Loop 區(qū)分析我國沿海厚殼貽貝群體遺傳結(jié)構(gòu)

(浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程中心，浙江舟山 316022)

厚殼貽貝Mytilus coruscus 隸屬軟體動物門Mollusca、雙殼綱Bivalvia、貽貝目Mytioida、貽貝科Mytilidae、貽貝屬Mytilus[1]，主要分布于日本北海道海域、韓國濟州島海域、中國的渤海、黃海、東海以及臺灣海域，厚殼貽貝殼頂尖細，殼面常呈棕褐色。厚殼貽貝生活在低潮線以下鹽分高、海流大的淺海中，其垂直分布深度較深，達20 m 左右，以10 m 左右密度最大，幼貝分布較淺[2]。厚殼貽貝苗種人工繁育已經(jīng)成功進行，其過程主要包括：親本貝在適宜水溫的條件下完成受精，受精卵開始進行分裂分化等過程，最后變態(tài)發(fā)育成稚貝，其胚胎發(fā)育為成體的全過程歷時約35 d[3]。厚殼貽貝與海洋中許多無脊椎動物相類似，發(fā)育中的幼蟲會自行選擇適宜生存的棲息地點并完成它的附著過程[4]。厚殼貽貝個體大、生長快，肉味鮮美、營養(yǎng)豐富，且具有滋補保健作用，在國內(nèi)外市場深受歡迎，價格遠高于貽貝和紫貽貝，為出口創(chuàng)匯產(chǎn)品[5]。我國厚殼貽貝主要養(yǎng)殖區(qū)在浙江舟山，特別在嵊泗縣是最主要海水養(yǎng)殖品種，其養(yǎng)殖生產(chǎn)已有十余年歷史，目前每年養(yǎng)殖數(shù)量達50 億～60 億粒以上[6]。厚殼貽貝作為我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖貝類品種之一，種質(zhì)資源和野生遺傳結(jié)構(gòu)的研究分析對提升種源的品質(zhì)和養(yǎng)殖貝的質(zhì)量具有一定的參考價值，也可幫助當(dāng)?shù)氐臐O業(yè)水產(chǎn)了解厚殼貽貝的野生資源情況，有效保護野生種質(zhì)資源，提升厚殼貽貝養(yǎng)殖產(chǎn)量。

線粒體DNA(mitochondrial DNA，簡稱mtDNA)相對于核DNA 具有結(jié)構(gòu)簡單、母系遺傳、進化速率快、幾乎不發(fā)生重組、富含系統(tǒng)發(fā)育信號等特點，是作為種屬進化研究的良好標(biāo)記[7]。其中，線粒體DNA DLoop 區(qū)序列由于不編碼蛋白質(zhì)而不受自然選擇的影響，因而進化速率最快，積累了較多的突變，如堿基替換、插入、缺失，以及眾多的串聯(lián)重復(fù)序列等，所以在種群遺傳學(xué)分析中得到普遍應(yīng)用[8-9]。

本研究對我國沿海6 個厚殼貽貝野生群體的mtDNA D-Loop序列進行PCR 擴增和測序，開展關(guān)于群體間遺傳變異和系統(tǒng)分化等方面研究，旨在為我國厚殼貽貝野生種質(zhì)資源的合理開發(fā)和保護提供分子生物學(xué)依據(jù)，并為制定合理的育種方案提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和DNA 提取

實驗所用的厚殼貽貝于2016 年3 月至12 月之間采集于青島(QD)、舟山(ZS)、玉環(huán)(YH)、臺山(TS)、平潭(PT)、廈門(XM)，每個地點隨機采樣活體解剖取閉殼肌(圖1、表1)，保存于無水乙醇中，用于DNA 提取。采用改良鹽析法提取基因組DNA[10]，并溶解于TE緩沖液中，瓊脂糖凝膠電泳檢驗其純度后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 我國沿海6 個地區(qū)野生厚殼貽貝樣本采樣地點Fig.1 Map showing six sampling locations of wild M.coruscus along the China Sea

表1 厚殼貽貝的樣品細節(jié)及核苷酸組成以及參數(shù)指數(shù)Tab.1 Sample details,nucleotide composition and parameter indices for M.coruscus

1.2 目的片段的擴增與測序

利用NCBI 數(shù)據(jù)庫下載厚殼貽貝線粒體全基因組數(shù)據(jù)(GenBank 登錄號：KJ577549)的D-Loop 序列全長，并使用Premer-primer6.0[11]設(shè)計引物，D-Loop-F：CGGTAGGAAGAAGTAGAGT；D-Loop-R：CTTGCTCACCAGGAACAT，引物合成由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司完成。PCR 反應(yīng)體系為25 μL，包括：12.5 μL ExTaq (Takara)，1 μL 前后引物(濃度0.1 OD)，0.5 μL 模板DNA 以及10 μL 去離子水。PCR 擴增程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性45 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸3 min，33 個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。將PCR 產(chǎn)物置于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳檢測產(chǎn)物質(zhì)量，確認(rèn)條帶大概長度。將符合目的片段長度的PCR 產(chǎn)物冷凍封存后，由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司對PCR 產(chǎn)物進行雙向測序，獲取產(chǎn)物序列信息。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

通過ClustalX 2.0[12]對測序獲得的線粒體DNA D-Loop 區(qū)序列進行比對矯正，并對齊全部序列片段。為鑒定物種和所得片段的準(zhǔn)確位置，使用NCBI 數(shù)據(jù)庫中在線BLAST 工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對所有片段進行在線比對。將比對矯正后的序列以FASTA 格式導(dǎo)入軟件MEGA 7.0[13]進行序列比對及變異分析，計算群體間的遺傳距離并使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用軟件DnaSP 6.0[14]對所有數(shù)據(jù)根據(jù)其群體進行分組，并計算各類遺傳多樣性參數(shù)，如：單倍型個數(shù)(n)、變異位點、單倍型多樣性(h)和核苷酸多樣性(π)。使用軟件Arlequin 3.5[15]進行分子方差分析(AMOVA)、計算遺傳分化系數(shù)(FST)、基于Tajima’s D 與Fu’s Fs 模型下，對數(shù)據(jù)進行中性檢測。將所有單倍型在軟件MEGA7.0[13]中進行計算并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用軟件Network5.1[16]基于中介鄰接法(median-joining method)構(gòu)建各分子標(biāo)記的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 群體內(nèi)遺傳變異

在對129 個樣本D-Loop 區(qū)序列進行測序分析后，獲得了長度為1 113 bp 的片段，其中變異位點31個(表2)，序列組成顯示A、T、G、C 堿基含量分別為A：32.8%、T：31.4%、C：13.4%、G：22.4%，A+T 含量(64.2%)顯著高于G+T 含量(35.8%)，具有明顯的堿基組成偏倚性。共得35 個單倍型(GenBank 登錄號：MG888576-MG888610)(表3)。單倍型Hap3、Hap5 和Hap11 為6 個群體共享，其中Hap11 和Hap5 為優(yōu)勢單倍型，分別占個體總數(shù)的30.23%和13.95%。單倍型Hap1、Hap15 和Hap18 為4 個群體共享，單倍型Hap9 為3 個群體共享，單倍型Hap4、Hap10、Hap13、Hap14、Hap17 和Hap28 為2 個群體共享，其余都為單個群體所特有單倍型。厚殼貽貝4 個地理群體的遺傳學(xué)參數(shù)見表1，單倍型多樣性指數(shù)為0.853(ZS)～0.912(XM)，群體總體的單倍型多樣性指數(shù)為0.876；核苷酸多樣性指數(shù)為0.005 55 (QD)～0.007 36(ZS)，群體總體的核苷酸多樣性指數(shù)為0.006 24，遺傳多樣性處于較高水平。

2.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)研究

分子方差分析(表4)結(jié)果顯示，100.15%的變異都來自于群體內(nèi)部。群體間的遺傳分化系數(shù)FST值在在-0.021 79(QD-PT)至0.076 3(PT-XM)之間，15 個FST值中由9 個均為負值，其余的除(PT-XM)外，也都小于0.05，這表明各個群體之間幾乎沒有發(fā)生遺傳分化，存在高度的遺傳同質(zhì)性?；蛄鞣秶?.026 54～32.429 74 之間，說明各群體之間基因交流頻繁(表5)。中性檢驗結(jié)果顯示，Tajima’s D 值以及Fu’s Fs 值的P 值均不顯著，表明厚殼貽貝未偏離中性選擇，群體沒有經(jīng)歷過群體擴張(表1)。

用MEGA5.0[13]構(gòu)建6 個群體單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2，從圖中看出35 個單倍型樣本聚類為兩支，6 個群體的單倍型在兩支均有出現(xiàn)，并未發(fā)現(xiàn)存在群體分化的差異現(xiàn)象。

圖2 自檢舉值為1 000 次的單倍型鄰近系統(tǒng)發(fā)育樹(phylogenetic trees)Fig.2 The NJ tree of each haplotypes based on Nei's standard genetic distance with 1 000 bootstraps

表2 所有樣本的單倍型數(shù)目以及每個單倍型的變異位點Tab.2 The details of haplotypes,including the numbers of haplotypes and mutation sites

表3 厚殼貽貝群體的單倍型數(shù)量及登錄號Tab.3 Haplotype and accession numbers of M.coruscus populations

表4 基于線粒體DNA D-Loop 區(qū)域的厚殼貽貝樣品之間的成對FST 值與Nm 值Tab.4 Pairwise FST and Nm values among samples of M.coruscus using mtDNA D-Loop region

表5 基于線粒體DNA D-Loop 區(qū)域的厚殼貽貝樣品之間的AMOVA 分析Tab.5 AMOVA among samples of M.coruscus based on mtDNA D-Loop region

構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖如圖3，結(jié)果顯示單倍型網(wǎng)絡(luò)圖Hap3 和Hap5 是最主要的單倍型，單倍型聚類并未完全展示地域性特色，各地理群體的單倍型具有聚類現(xiàn)象，顯示出較近的親緣關(guān)系，結(jié)果與單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）情況相符。

圖3 6 個地區(qū)樣本的線粒體DNA D-Loop 區(qū)單倍型進化網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 The haplotypes network of six populations of M.coruscus

3 討論

遺傳多樣性參數(shù)是衡量群體遺傳多樣性程度的重要指標(biāo)之一[17]。本研究中6 個厚殼貽貝群體的遺傳多樣性均表現(xiàn)出高的單倍型多樣性和低的核苷酸多樣性的特點，顯示出了較高水平的遺傳多樣性。這與前人利用線粒體COI[18]、COIII[19]及16sRNA[20]研究我國東南沿海厚殼貽貝遺傳多樣性的結(jié)果一致。厚殼貽貝體外受精、大規(guī)模的繁殖能力以及廣泛的幼蟲傳播方式可能是導(dǎo)致厚殼貽貝資源擁有高遺傳多樣性的原因。

我國沿海厚殼貽貝整體遺傳結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)單一薄弱的情況，6 個群體間的遺傳分化程度不明顯，各樣本的遺傳沒有發(fā)現(xiàn)明顯的遺傳分化現(xiàn)象，結(jié)果與單倍型網(wǎng)絡(luò)圖的結(jié)果相吻合，從AMOVA 中可以發(fā)現(xiàn)，大部分遺傳變異來自于樣本內(nèi)部，樣本間的變異程度極小，這也是導(dǎo)致樣本，不具有明顯遺傳分化現(xiàn)象的因素之一。單倍型構(gòu)建的進化樹雖然聚類為2 個主要分支，但分支內(nèi)各單倍型不具有地理分布相吻合的特點，呈現(xiàn)混雜，分支呈現(xiàn)嵌套模式，說明單倍型的遺傳歧化不明顯。

一般而言，海洋生物與陸生生物相比，其種群遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化相對匱乏，這種匱乏緣于海洋環(huán)境缺乏像陸地環(huán)境一樣阻止生物擴散和交流的有效屏障[21]。大多數(shù)海洋雙殼類都擁有一段或長或短的浮游期，在此期間浮游幼蟲可以被動地隨著海洋潮流進行有效擴散傳播[22-24]。浮游期過后，這些貝類大都營固著生活(如貽貝、牡蠣等)或進行小范圍活動(如蚶、蟶、蛤等灘涂性貝類)。因此，海洋雙殼類的遺傳結(jié)構(gòu)主要形成于其浮游期。一般而言，擁有較長浮游期的物種能夠在海洋潮流的推動下漂移較遠的距離，更易產(chǎn)生遺傳交流，造成單一的遺傳結(jié)構(gòu)[25]。我國沿海厚殼貽貝整體遺傳結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)單一薄弱的情況，7 個群體間的遺傳分化程度不明顯，各樣本的遺傳沒有發(fā)現(xiàn)明顯的遺傳分化現(xiàn)象，結(jié)果與單倍型網(wǎng)絡(luò)圖的結(jié)果相吻合，從AMOVA 中可以發(fā)現(xiàn)，大部分遺傳變異來自于樣本內(nèi)部，樣本間的變異程度極小，這也是導(dǎo)致樣本，不具有明顯遺傳分化現(xiàn)象的因素之一。單倍型構(gòu)建的進化樹雖然聚類為兩個主要分支，但分支內(nèi)各單倍型不具有地理分布相吻合的特點，呈現(xiàn)混雜，分支呈現(xiàn)嵌套模式，說明單倍型的遺傳歧化不明顯。這可能是由于厚殼貽貝與大多數(shù)的海洋雙殼動物一樣，在其生命發(fā)育周期中會有以浮游方式生存的幼蟲階段，大約需要約35 d[3]，在較長的浮游期內(nèi)，幼體可以跟隨洋流漂浮到遠離其出生地的環(huán)境，甚至是其他群體的棲息地，這也就增加不同地區(qū)群體間的基因交流，降低不同群體之間的遺傳差異，縮小了遺傳分化的現(xiàn)象。

除此之外，我國沿海洋流構(gòu)成十分復(fù)雜，除了數(shù)條沿岸流外，還有對本地區(qū)有重要影響的長江沖淡水、黑潮的支流、黃海的中央冷水團、東海的局部渦流等[26]，東海海區(qū)歷來是我國厚殼貽貝的主要產(chǎn)區(qū)，自然種質(zhì)資源豐富，在每年冬季的繁殖季節(jié)會有大量幼蟲被散播在海區(qū)中；而冬季海區(qū)沿岸流主要沿北向南流動，黑潮及其支流暖流在外圍由南向北隔離了邊緣海與大洋間的交流，冬季同樣是我國沿岸江河的枯水期，從河口流入邊緣海的沖淡水大幅減少，這也進一步減弱對沿岸流的影響，而各海區(qū)內(nèi)存在的渦流也促進了海區(qū)內(nèi)環(huán)流的循環(huán)[27]。作為一種經(jīng)濟海洋養(yǎng)殖貝類，厚殼貽貝的養(yǎng)殖市場廣闊，在人工育苗技術(shù)相對成熟的情況下，養(yǎng)殖從業(yè)者一般會從主產(chǎn)區(qū)中購買苗種后，運輸?shù)金B(yǎng)殖地進行養(yǎng)殖，而目前主要養(yǎng)殖方式是在自然海區(qū)利用附著基進行附苗養(yǎng)殖，開放的養(yǎng)殖方式會導(dǎo)致在繁殖季節(jié)，大量養(yǎng)殖樣本的幼蟲會被散播在海區(qū)內(nèi)，與自然樣本的幼蟲混合后隨洋流傳播[28]。養(yǎng)殖樣本親本本身也是來自于單一的自然樣本，而大量的養(yǎng)殖樣本幼蟲的混入會導(dǎo)致遺傳多樣性的降低和樣本間遺傳結(jié)構(gòu)的減弱，而目前育苗技術(shù)相對原始，選苗資源單一，也導(dǎo)致了養(yǎng)殖樣本近親交配情況凸顯。在養(yǎng)殖業(yè)缺乏對自然群體保護的管理下，大量養(yǎng)殖樣本的幼蟲勢必會沖淡自然樣本的遺傳多樣性，進而對自然樣本的遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生沖擊。

4 小結(jié)

厚殼貽貝的群體遺傳學(xué)研究是更深入了解和揭示其自然環(huán)境下遺傳現(xiàn)狀，是識別厚殼貽貝遺傳管理單元合理利用其資源的必要途徑。本研究采用線粒體DNA D-Loop 區(qū)序列對采自我國沿海的7 個厚殼貽貝群體進行遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示出較高的遺傳多樣性水平和單一薄弱的遺傳結(jié)構(gòu)。通過本研究的相關(guān)的實驗和分析，已經(jīng)積累了相當(dāng)?shù)暮駳べO貝遺傳數(shù)據(jù)。而通過這些厚殼貽貝遺傳數(shù)據(jù)的分析，可以為我們在某些研究方面提供一些見解，比如遺傳管理單元的識別，種質(zhì)資源的有效利用，也有助于我們理解在同一地區(qū)下，具有相似浮游幼蟲期的海洋貝類的遺傳結(jié)構(gòu)。