正交優(yōu)化提取刺松藻多酚及抗氧化活性研究

(浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316022)

刺松藻Codium fragile Hariot.屬松藻科，松藻屬，是一種高膳食纖維、且富含鐵、鋅等微量礦質(zhì)元素的天然綠藻，也是我國東海的優(yōu)勢大型綠藻[1]。CIANCIA，etal[2]證明其富含α(1→4)-D-葡聚糖、β(1→4)-D-甘露聚糖等多糖，生物活性顯著，但對多酚的研究仍處于探索階段[3]。目前研究多采用溶劑回流提取法、浸提法、超聲波或微波輔助提取法、酶解法提取多酚，微波輔助提取法耗時較短、成本低。

本文以浙江溫州南麂的刺松藻為原料，采用微波輔助法提取刺松藻多酚，采用紫外和紅外光譜法對其結(jié)構(gòu)特征進行初步探索，并以抗壞血酸為對照，測定并比較其清除DPPH、羥自由基能力和抗脂質(zhì)過氧化能力，對其抗氧化活性進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

微波超聲組合合成/萃取儀(XH-300A、北京祥鵠科技發(fā)展有限公司)；電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；紫外可見分光光度計(UV-1100、上海美譜達儀器有限公司)；紅外光譜儀(TENSOR-27)；數(shù)顯三用恒溫水箱(HH-W420、江蘇金壇市白塔新寶儀器廠)；粉碎機；磁力攪拌器。

1.2 試劑與藥品

刺松藻(采自浙江溫州南麂)；沒食子酸(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號20120423)，福林酚試劑(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號20170314)，無水乙醇(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號20170413)，碳酸鈉，DPPH，抗壞血酸，鄰二氮菲，硫酸亞鐵，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，過氧化氫，三氯乙酸，硫代巴比妥鈉。福林酚試劑為生化試劑，其他試劑均為分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 刺松藻多酚的含量測定

采用Folin-Denis 比色法[4]，測定刺松藻提取液中多酚的含量。精密稱定沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品0.050 g，溶解定容，配制成0.010 g·mL-1的乙醇溶液。依次移取5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL 濃度為0.010 g·mL-1的沒食子酸溶液在試管內(nèi)，用蒸餾水定容至0.5 mL，然后加入2.5 mL 30%福林酚試劑，震搖6 min 后加入2 mL 12% Na2CO3溶液，30 ℃避光水浴1 h 后，測定760 nm 波長的吸光度，平行實驗重復(fù)3 次[5]。以沒食子酸的量X(mg)為橫坐標(biāo)，以吸光度Y 為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=20.933 X-0.006 5，R2=0.999 4，沒食子酸在0.005～0.025 mg 的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

準(zhǔn)確稱取刺松藻粉末于錐形瓶中，在試驗條件下微波輔助提取，4 000 r·min-1離心15 min 取上清液，準(zhǔn)確吸取0.5 mL 樣品，重復(fù)上述操作，測定各組的吸光度，平行實驗重復(fù)3 次。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算含量，刺松藻多酚含量=CNV/M×100%，式中：C 為提取液中多酚質(zhì)量濃度(mg·mL-1)，N 為樣品稀釋倍數(shù)，V 為提取液體積(mL)，W 為刺松藻稱樣量(g)[6]。

1.3.2 單因素考察

對乙醇濃度、液固比、微波提取時間、微波功率4 個主要因素分別進行單因素試驗[7]。考察乙醇濃度對刺松藻多酚含量的影響，精密稱取刺松藻粉末1 g 加到250 mL 錐形瓶中，微波輻射功率為400 W，在液固比為25 的條件下，分別以0%、5%、10%、15%、20%的乙醇作為溶劑，微波處理45 s；考察微波功率、時間對多酚含量的影響，液固比均為25，去離子水作為萃取劑，前者以200 W、300 W、400 W、500 W、600 W 的微波功率處理45 s，后者控制微波功率為400 W，分別用微波處理25 s、35 s、45 s、55 s、65 s；考察料液比對多酚含量的影響，微波功率為400 W，時間為55 s，去離子水作為萃取劑，分別按照液固比15、25、50、75、100 加入，各組平行試驗重復(fù)3 次。

1.3.3 正交試驗設(shè)計

以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，采用L9(34)正交實驗法，優(yōu)化微波輔助提取刺松藻多酚的工藝條件，以最優(yōu)條件提取多酚，計算得率。選取液固比、微波時間、微波功率3 個因素為自變量進行正交實驗，如表1 所示。

表1 刺松藻多酚提取工藝因素水平Tab.1 Factors for extraction of polyphenols from C.fragile

1.3.4 光譜分析

1.3.4.1 刺松藻多酚的紫外光譜分析

配置一定質(zhì)量濃度的刺松藻多酚溶液，在200～500 nm 波長范圍內(nèi)利用酶標(biāo)儀進行紫外-可見光波長掃描，得到刺松藻多酚的紫外光譜圖。

1.3.4.2 刺松藻多酚的紅外光譜分析

1.3.5 多酚抗氧化活性測定

1.3.5.1 DPPH 自由基清除能力的測定

采用MONICA，et al[9]的方法測定。加入試液順序與含量如下：1 mL 樣品溶液(濃度分別為1.25、2.5、5、10、20 μg·mL-1)+1 mL 無水乙醇+0.25 mL 0.02%的DPPH99.5%乙醇溶液；對照組用純水替換樣品；空白組用無水乙醇替換DPPH 溶液。將反應(yīng)體系避光室溫靜置1 h，然后在517 nm 處測定各組的吸光度A。以與樣品相同濃度的抗壞血酸為陽性對照，自由基清除率可用公式計算：DPPH 自由基清除率/%=(對照-樣品+空白)/對照×100[10]。平行試驗重復(fù)3 次。

1.3.5.2 清除羥自由基能力的測定

采用Fenton 反應(yīng)測定[11]。加入試液順序與含量如下：1 mL 0.75 mmol·L-1鄰二氮菲+2 mL PBS (pH=7.40)+1 mL H2O+1 mL 0.75 mmol·L-1FeSO4+1 mL 樣品溶液(濃度分別為1.25、2.5、5、10、20 μg·mL-1)，37 ℃恒溫水浴1.5 h，在536 nm 處測得吸光度AX0；用0.12% H2O2替代樣品，測得吸光度AX；用1 mL H2O 替代H2O2，測得吸光度A0。以與樣品相同濃度的抗壞血酸為陽性對照，羥自由基清除率可用公式計算：羥自由基清除率/%=(AX-AX0)/(A0-AX0)×100。平行試驗重復(fù)3 次。

1.3.5.3 抗脂質(zhì)過氧化能力測定

采用Fe2+誘導(dǎo)法測定[12]。加入試液順序與含量如下：0.4 mL 卵黃懸液+0.1 mL 樣品溶液(濃度分別為1.25、2.5、5、10、20 μg·mL-1)+0.4 mL 25 mmol·L-1FeSO4+1 mL PBS(pH=7.45)+37 ℃恒溫振蕩15 min+1 mL 20%TCA+1 mL 0.8% TBA+沸水浴15 min，冷卻后以4 000 r·min-1冷凍離心15 min，取上清液，在532 nm 波長處測定吸光度Am；對照組用0.1 mL PBS 緩沖液替換樣品，測得吸光度Ab。卵黃懸液配置方法如下：取新鮮雞蛋卵黃，用等體積0.1 mol·L-1PBS (pH=7.45)配制成懸液，磁力攪拌10 min，再用PBS 稀釋成1:25 的卵黃懸液，冷藏備用。以與樣品相同濃度的抗壞血酸為陽性對照，F(xiàn)e2+誘導(dǎo)卵黃脂蛋白脂質(zhì)過氧化的抑制率可用公式計算：抑制率/%=(Ab-Am)/Ab×100。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2016 進行實驗數(shù)據(jù)的整理，利用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析，并對正交試驗結(jié)過進行方差分析(ANOVA)。

中農(nóng)控股產(chǎn)品研發(fā)營銷中心三部在河南省駐馬店市西平縣以“全新包裝產(chǎn)品升級”為主題召開2018年秋季新產(chǎn)品推介會。相關(guān)負責(zé)人介紹了“中國農(nóng)資”系列產(chǎn)品，如“黑優(yōu)美”系列生物有機肥、土壤修復(fù)劑，“大地之秀”系列摻混肥、過磷酸鈣，“中國農(nóng)資”系列大量元素、水溶肥等產(chǎn)品，并詳細介紹施用方法和注意事項。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對刺松藻多酚含量的影響

如圖1 所示，當(dāng)乙醇濃度增加時，刺松藻中提取所得的多酚的含量逐漸減少，當(dāng)用去離子水提取時，提取率最大。由極性大?。核疽掖?，從物質(zhì)相似相溶原理的角度推測，刺松藻多酚提取物的極性與去離子水的極性相近，故使用去離子水提取多酚時，所得產(chǎn)率最大。故后續(xù)實驗選用去離子水提取刺松藻多酚。

2.1.2 微波功率對刺松藻多酚含量的影響

如圖2 所示，當(dāng)微波功率增大時，多酚含量先增加后減少，當(dāng)微波功率達到400 W 時，提取率最大。從動力學(xué)角度推測分析[13]，當(dāng)微波功率增大時，溶液獲得能量也增加，多酚提取液中產(chǎn)生小泡，小泡經(jīng)產(chǎn)生、膨脹、破裂等過程[14]，使多酚從刺松藻中分離出來。當(dāng)功率達到一定程度時，過高的功率可能導(dǎo)致結(jié)構(gòu)破壞，提取率下降。

2.1.3 微波提取時間對刺松藻多酚含量的影響

如圖3 所示，當(dāng)微波時間增加時，多酚含量先緩慢增加后減少，當(dāng)微波時間為55 s 時，提取率最大。從熱力學(xué)角度推測分析，隨著微波時間的增加，提取液溫度逐漸上升，溫度升高，溶液中的分子擴散速度加快，有利于多酚從刺松藻中分離進入溶劑。當(dāng)微波時間為65 s 時，多酚含量減少，可能是多酚結(jié)構(gòu)遭到了破壞[15]。

2.1.4 液固比對刺松藻多酚含量的影響

如圖4 所示，當(dāng)液固比增大時，多酚含量先快速增加后減少，當(dāng)液固比為25 時，提取率最大。其原因可能是刺松藻中的多酚在液固比為25 時，已經(jīng)能夠大部分溶解在溶劑中，隨著液固比的繼續(xù)增加，多酚的含量反被溶劑稀釋而減少,甚至?xí)衅渌s質(zhì)析出[16]。

圖1 乙醇濃度對多酚含量的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration on polyphenols content

圖2 微波功率對多酚含量的影響Fig.2 Effects of microwave power on polyphenols content

圖3 微波提取時間對多酚含量的影響Fig.3 Effects of irradiation time on polyphenols content

圖4 液固比對多酚含量的影響Fig.4 Effects of liquid-solid ratio on polyphenols content

2.2 正交試驗優(yōu)化結(jié)果

利用SPSS20.0 軟件對正交試驗結(jié)果進行極差分析和方差分析，結(jié)果如表2 和表3 所示。

本實驗通過正交試驗優(yōu)化了微波輔助提取刺松藻多酚的工藝條件，由表2 的極差分析結(jié)果可知，各因素對刺松藻多酚提取率影響大小順序為C＞A＞B，即微波功率＞液固比＞微波時間，最優(yōu)組合為A2B2C3，得出了最佳條件：液固比為25，微波輻射時間為55 s，微波輻射功率500 W[17]。由表3 可知，A、C 兩個因素P值＜0.05，說明液固比、微波功率對刺松藻中多酚的提取率有顯著性影響[18]，B 因素P 值=0.238＞0.05，其對多酚的提取率影響較小。

以最優(yōu)條件提取刺松藻多酚，平行試驗重復(fù)3 次，所得多酚含量為2.76 mg·g-1，提取率為0.28%。

表2 刺松藻多酚提取工藝正交實驗結(jié)果與極差分析Tab.2 Results oforthogonal teston polyphenols content

表3 刺松藻多酚提取工藝方差分析表Tab.3 Analysis of variance on polyphenols content

2.3 光譜分析

2.3.1 刺松藻多酚紫外-可見光譜分析

由圖5 可知，刺松藻多酚提取液的紫外-可見光譜圖在220～280 nm 有較大吸光度，其可能為黃烷醇類、黃烷酮類等物質(zhì)的特征吸收峰[19]。在220～280 nm 波長范圍內(nèi)的吸收峰強度明顯大于在300～500nm 波長范圍內(nèi)的吸收峰強度，可猜測刺松藻提取液中黃烷醇類、黃烷酮類等物質(zhì)含量較多。

2.3.2 刺松藻多酚紅外光譜分析

由圖6 可知，在500～4 000 cm-1范圍內(nèi)進行的IR 掃描[20]，圖譜具有刺松藻多酚的特征吸收峰。3 250～3 400 cm-1強而寬的峰表明有O-H 伸縮振動νO-H，表明多酚結(jié)構(gòu)中有羥基存在，且可能在提取過程中形成氫鍵，屬于締合O-H；2 926 cm-1弱峰可能是多酚C-H 伸縮振動νC-H；2 362 cm-1、2 334 cm-12 個中強而尖的峰猜測其結(jié)構(gòu)中可能含有共軛的碳碳三鍵；1 648 cm-1可能為結(jié)合水的吸收峰；1 424 cm-1中強峰表明有C-H 面內(nèi)彎曲振動δas (CH3)；1 101 cm-1強而寬的峰表明有酚類物質(zhì)C-O 伸縮振動νC-O；759 cm-1弱峰可能由不飽和C-H 面外彎曲振動γ=C-H產(chǎn)生[21]。

圖5 刺松藻多酚紫外-可見光譜圖Fig.5 Ultraviolet-Visible Spectrum of Polyphenols from C.fragile

圖6 刺松藻多酚紅外光譜圖Fig.6 Infrared Spectrum of Polyphenols from C.fragile

2.4 刺松藻多酚體外抗氧化活性研究結(jié)果

2.4.1 DPPH 自由基清除效果

如圖7 所示，當(dāng)刺松藻多酚濃度增大時，DPPH 自由基清除能力隨之增強，但略低于同等濃度抗壞血酸的清除率。IC50(刺松藻多酚DPPH 自由基半抑制質(zhì)量濃度)為20.12 μg·mL-1，其值越小，清除DPPH 自由基能力越強[22-23]。刺松藻多酚對DPPH 自由基具有一定的清除能力。

2.4.2 羥自由基清除效果

羥自由基作為活性最強的氧自由基，其半衰期極短[24]，最常見的產(chǎn)生自由基的反應(yīng)是Fenton 反應(yīng)，吸光度與羥自由基生成量呈正比。如圖8 所示當(dāng)刺松藻多酚濃度增大時，羥自由基清除能力隨之增強，低濃度時與同等濃度抗壞血酸的清除率相當(dāng)，隨著濃度進一步增大，略低于同等濃度抗壞血酸的清除率。IC50(刺松藻多酚羥自由基半抑制質(zhì)量濃度)為12.56 μg·mL-1，刺松藻多酚對羥自由基具有一定的清除能力。

2.4.3 抗脂質(zhì)過氧化能力測定結(jié)果

如圖9 所示，當(dāng)刺松藻多酚濃度增大時，刺松藻多酚對Fe2+誘導(dǎo)卵黃脂蛋白脂質(zhì)過氧化的抑制作用增強，但低于同等濃度抗壞血酸抑制率。當(dāng)刺松藻多酚濃度為10 μg·mL-1時，抑制率為6.74%。刺松藻提取液抗脂質(zhì)過氧化能力的測定過程中，可能由于Fe2+不穩(wěn)定、反應(yīng)干擾因素多、副反應(yīng)等因素造成影響，原因仍需深入研究[25]。

圖7 刺松藻多酚和維生素C 對DPPH自由基清除效果Fig.7 The scavenging effects of DPPH radicals by polyphenols and Vc

圖8 刺松藻多酚和維生素C 對羥自由基清除效果Fig.8 The scavenging effects of hydroxyl radicals bypolyphenols and Vc

圖9 刺松藻多酚和維生素C 對Fe2+誘導(dǎo)卵黃脂蛋白脂質(zhì)過氧化的抑制作用Fig.9 The inhibitory effects of polyphenolsand VC on lipid peroxidation of vitellin induced by Fe2+

3 結(jié)論

本實驗通過單因素試驗確定了正交試驗的主要條件，采用L9(34)正交實驗法，優(yōu)化了微波輔助提取刺松藻多酚的工藝條件，得出了最佳條件：液固比為25，微波輻射時間為55 s，微波輻射功率500 W，多酚含量為2.76 mg·g-1，提取率為0.28%。由極差結(jié)果分析得出，各因素對刺松藻多酚提取率影響大小順序為微波功率＞液固比＞微波時間，由方差分析結(jié)果得出，液固比、微波功率對刺松藻中多酚的提取率有顯著性影響。

由紫外-可見光譜圖分析結(jié)果可知，在220～280 nm 刺松藻多酚提取液有較大吸光度，其可能為黃烷醇類、黃烷酮類等物質(zhì)的特征吸收峰。由紅外光譜分析結(jié)果可知，刺松藻多酚結(jié)構(gòu)中可能含有νO-H、νC-H、νC-O、γ=C-H等振動，推測其含有酚羥基。

刺松藻多酚DPPH 自由基半抑制質(zhì)量濃度IC50為20.12 μg·mL-1；羥自由基半抑制質(zhì)量濃度IC50為12.56 μg·mL-1；濃度為10 μg·mL-1時，對Fe2+誘導(dǎo)卵黃脂蛋白脂質(zhì)過氧化抑制率為6.74%，具有一定的抗脂質(zhì)過氧化能力。綜合考慮，刺松藻多酚具有一定的抗氧化活性。

綜上所述，本實驗利用正交試驗優(yōu)化了刺松藻多酚的提取工藝，與傳統(tǒng)多酚提取法相比，微波輔助提取法省時、高效、節(jié)能，降低提取成本。同時對多酚結(jié)構(gòu)進行了簡單探索，還對刺松藻多酚進行了抗氧化研究，各項指標(biāo)表明刺松藻具有一定的抗氧化能力，其中清除DPPH 自由基的能力和清除羥自由基能力較強，為刺松藻的開發(fā)和利用奠定了一定的基礎(chǔ)。