不同保存條件下龍頭魚不同組織DNA提取效果比較分析

(浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022)

龍頭魚Harpodon nehereus 俗稱蝦潺、豆腐魚、九肚魚、鼻涕魚，是一種廣泛分布于熱帶和亞熱帶海域范圍內(nèi)的中小型經(jīng)濟(jì)魚類，喜棲息于水深50 m 以淺的近岸或河口泥沙底質(zhì)的環(huán)境，我國浙江舟山、溫臺(tái)漁場(chǎng)及福建沿海產(chǎn)量較高[1]。近年來，由于帶魚、大黃魚、小黃魚等主要經(jīng)濟(jì)魚類資源的衰退[2-4]，使得以龍頭魚和鳀鯡魚類為代表的中小型魚類捕撈產(chǎn)量逐年增加，經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值日益突顯。龍頭魚已在我國東海和南海漁業(yè)中占有重要地位，當(dāng)?shù)貪O汛期可占漁獲物的20%～40%，具有較好的捕撈潛力和開發(fā)利用前景[5-6]。

目前，國內(nèi)外有關(guān)龍頭魚的研究大多數(shù)集中在形態(tài)特征[7]、資源分布[8-9]、生理生態(tài)[10]和營養(yǎng)加工[11-13]等方面。二十世紀(jì)70 年代以來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，限制性酶切片斷長度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphisms，RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(Polymerase Chain Reaction DNA，RAPD)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)和簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeats，SSR)等一系列建立在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)基礎(chǔ)上的分子標(biāo)記技術(shù)相繼出現(xiàn)[14]。由于DNA 分子標(biāo)記是從核酸水平對(duì)遺傳變異的直接反映，且具有操作簡單、無組織特異性、不受環(huán)境條件和發(fā)育階段的影響等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于物種遺傳多樣性研究、親緣關(guān)系鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建和分子輔助育種等領(lǐng)域[14-15]。

PCR 是一種在生物體外進(jìn)行的特殊DNA 復(fù)制的分子生物學(xué)過程[16]，基因組DNA 提取質(zhì)量的高低直接關(guān)系著PCR 反應(yīng)的效果，決定了后續(xù)分子標(biāo)記相關(guān)實(shí)驗(yàn)的成敗。有關(guān)不同保存情況下魚類組織樣品DNA 提取效果的比較，前人已開展了許多相關(guān)工作[17-21]，但研究對(duì)象多以淡水魚類為主，針對(duì)海洋魚類的較少。本研究采用傳統(tǒng)Tris 飽和酚-氯仿法對(duì)不同保存狀態(tài)下龍頭魚肌肉和鰭條組織樣品DNA 提取效果進(jìn)行比較研究，旨在建立最適于龍頭魚分子標(biāo)記的基因組DNA 提取的組織和保存方法，以期為龍頭魚遺傳多樣性和種質(zhì)資源研究奠定基礎(chǔ)，也為合理利用與保護(hù)該漁業(yè)資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

實(shí)驗(yàn)所用龍頭魚于2018 年11 月購買自浙江省舟山市沈家門漁港。剪取新鮮魚體上背部肌肉和鰭條組織，裝入1.5 mL 離心管，分別于4 ℃冷藏、-20 ℃冷凍及浸泡于無水乙醇、75%(V/V)乙醇和10%(V/V)甲醛室溫條件下保存。用于剪取不同個(gè)體、不同組織的解剖剪嚴(yán)格分開并單獨(dú)清洗，以防交叉污染影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。冷藏樣品保存24 h，其他樣品保存30 d 之后進(jìn)行模板DNA 提取實(shí)驗(yàn)。

1.2 基因組DNA 提取

10%甲醛浸泡的樣品參考文獻(xiàn)[22-24]的方法需先進(jìn)行預(yù)處理，具體步驟如下：70%的乙醇溶液中浸泡12 h，依次換入80%、90%乙醇各浸泡2 h，最后浸泡入無水乙醇中。各樣品剪取一小塊置于干凈的衛(wèi)生紙上進(jìn)行按壓，待液體充分吸干后，再稱取約0.01 g 樣品放入新的離心管中。

采用Tris 飽和酚-氯仿法[25]提取不同組織樣品的基因組DNA，詳細(xì)提取方法如下：①在裝有樣品的離心管中加入650 μL STE 裂解緩沖液[0.1 mol·L-1NaCl，10 mmol·L-1 Tris.Cl (pH 8.0)]，1 mmol·L-1EDTA(pH 8.0)和蛋白酶K(德國Merck 公司，20 μg·μL-1) 15 μL，顛倒混勻后置于50 ℃烘箱內(nèi)進(jìn)行消化2～3 h(每隔30 min 顛倒混勻1 次)。②待樣品澄清時(shí)，從烘箱取出晾涼至室溫，加入650 μL 平衡酚，溫和顛倒混勻10 min。③離心10 min(轉(zhuǎn)速12 000 r·min-1)，吸取600 μL 上清液至另一干凈離心管中，再加入600 μL 平衡酚，溫和顛倒混勻10 min。④離心10 min (轉(zhuǎn)速12 000 r·min-1)，吸取500 μL 上清液至另一干凈離心管中，加入500 μL 的苯酚：氯仿：異戊醇(25:24:1)，溫和顛倒混勻10 min。離心10 min(轉(zhuǎn)速12 000 r·min-1)，吸取400 μL 上清液至另一干凈離心管中。⑤加入400 μL 的氯仿：異戊醇(24:1)，溫和顛倒混勻10 min，離心10 min(轉(zhuǎn)速12 000 r·min-1)，吸取300 μL 上清液至另一干凈離心管中。⑥加入600 μL 預(yù)冷的無水乙醇，稍微顛倒混勻后，-20 ℃沉淀30 min 左右，離心10 min(轉(zhuǎn)速12 000 r·min-1)，輕柔倒去乙醇。⑦加入預(yù)冷的75%乙醇600 μL，緩慢顛倒洗滌DNA 沉淀，4 ℃離心10 min(轉(zhuǎn)速12 000 r·min-1)。⑧輕柔倒去乙醇，將DNA 樣品自然風(fēng)干后，加入100 μL 滅菌雙蒸水溶解DNA，置4℃冰箱保存。

1.3 基因組DNA 檢測(cè)

1.3.1 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)

用量程為1～10 mL 的德國Eppendorf 單道可調(diào)移液器吸取5 μL 模板DNA，用英國柏點(diǎn)(型號(hào)BioDrop μLite)紫外分光光度計(jì)直接測(cè)定并記錄DNA 濃度和A260 nm/A280 nm 值。

1.3.2 基因組DNA 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

取3 μL 待檢DNA 溶液與2 μL 6×Loading Buffer 充分混合后直接上樣于1.0%的瓊脂糖凝膠，選擇2 000 bp DNA Marker 作參照，使用六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-8 型電泳儀在150V 恒壓下電泳25 min 左右。置于凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào)Tanon 3500)下檢測(cè)并拍照。

1.3.3 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

以所提取的龍頭魚基因組DNA 為模板，采用通用引物L(fēng)14734-F：5’-AACCACCGTTGTTATTCAACT-3’和H15915-R：5’-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3’[26-27]，用美國Bio-Rad 公司PCR 儀(型號(hào)T100 Thermal Cycler)擴(kuò)增龍頭魚Cyt b 基因序列。PCR 反應(yīng)總體積為25 μL，其中含0.25 μL 濃度為5 U·μL-1的Taq 酶，正反向引物(10 μmol·L-1)各1 μL，dNTPs (2.5 mmol·L-1) 2 μL，10×buffer 緩沖液(含Mg2+) 2.5 μL，模板DNA (約50 ng) 1 μL，滅菌水17.25 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性0.5 min，52 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸1.25 min 循環(huán)35 次，72 ℃延伸5 min。用濃度1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)下檢測(cè)拍照。

2 結(jié)果與分析

各種保存方法下，肌肉組織提取的DNA 濃度均高于鰭條組織(表1)。乙醇是較為常用的組織固定劑，能使得蛋白質(zhì)變性、酶喪失活性，樣品保存效果較好。本研究中，用無水乙醇保存的鰭條樣品DNA 濃度最高平均值為0.071 μg·μL-1，75%乙醇保存的肌肉樣品次之，為0.069 μg·μL-1。冷藏和冷凍保存的樣品DNA平均濃度在0.047～0.058 μg·μL-1之間，表明未加固定劑的樣品經(jīng)過降溫升溫的環(huán)境變化后，會(huì)使得樣品產(chǎn)生降解，影響所提取的DNA 濃度。10%甲醛保存的樣品DNA 濃度最低，平均值僅在0.035 μg·μL-1左右。甲醛同樣能使酶喪失活性，而且甲醛的穿透力強(qiáng)，能均勻固定樣品，但一定濃度的甲醛會(huì)能引起DNA斷裂(DNA strand breakage，DSB)、DNA-DNA 交聯(lián)(DNA-DNA crosslink，DDC)、DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)(DNA-protein crosslink，DPC)等作用[28]。因此，即使經(jīng)乙醇梯度處理后，仍會(huì)有甲醛溶液殘留，阻礙核酸釋放、影響DNA 提取效果。

通常核酸的最高紫外吸收峰的波長在260 nm 處，蛋白質(zhì)最高紫外吸收峰的波長在280 nm 處，A260可反映的是溶液中核酸的吸光度，A280 反映的是溶液中蛋白質(zhì)或者氨基酸的吸光度。一般而言，純凈DNA 的A260/A280 比值在1.8 左右。本實(shí)驗(yàn)中，不同保存方法下龍頭魚肌肉和鰭條組織樣品基因組DNA的A260/A280 值在1.808～1.973 之間，純度均符合要求(表1)。冷藏的新鮮鰭條組織中提取出的DNA 較為純凈，比值最接近1.8。10%甲醛保存樣品由于完全消化所需時(shí)間較長，使得消化進(jìn)行完全，DNA 純度也相對(duì)較好。

從基因組DNA 電泳檢測(cè)結(jié)果來看，以75%乙醇浸泡的樣品為例，電泳圖譜中肌肉組織樣品條帶清晰完整，亮度高于鰭條組織(圖1)，表明肌肉組織所提取的基因組DNA 濃度和質(zhì)量均好于鰭條組織條，能夠用于PCR 擴(kuò)增的模板，進(jìn)行遺傳多樣性等方面的研究。而10%甲醛保存的樣品基因組檢測(cè)條帶不明顯，且個(gè)別條帶出現(xiàn)拖帶現(xiàn)象，可能與提取過程中操作不當(dāng)、DNA 片段破碎有關(guān)。

經(jīng)10%甲醛浸泡的肌肉組織所提取的基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后無明顯條帶(圖2a)，而其他對(duì)照組PCR 產(chǎn)物電泳圖譜條帶清晰完整(圖2b)，擴(kuò)增得到大小相同的DNA 片段，沒有明顯的差異，表明除10%甲醛浸泡的其他各保存方法及組織樣品所提取的DNA 完全可以用于PCR 擴(kuò)增。

表1 不同保存條件下肌肉和鰭條樣品DNA 濃度和A260/A280 值Tab.1 DNA concentration and A260/A280 value of muscle and fin samples under different preserved conditions

圖1 基因組DNA 提取效果電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of genomic DNA extraction effect

圖2 基因組DNA PCR 擴(kuò)增效果電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of PCR-products

3 討論

基因組DNA 模板質(zhì)量關(guān)系到SSR、RAPD、ISSR 等一系列分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的效果，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)不同保存方法下龍頭魚肌肉和鰭條組織基因組DNA 提取效果進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明，除10%甲醛浸泡的樣品外，龍頭魚的肌肉和鰭條組織在另外4 種保存條件下(冷藏、冷凍、無水乙醇浸泡、75%乙醇浸泡)均能獲得較高質(zhì)量的基因組DNA，可用于進(jìn)一步的分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。張海琪等[29]的研究結(jié)果表明，大黃魚Pseudosciaena crocea 鮮活樣品以及冷凍、70 %乙醇保存的樣品均可得到高質(zhì)量的DNA，而從10%福爾馬林保存樣品DNA 獲得率低。范武江等[19]對(duì)鳙魚Aristichths nobilis 肌肉、肝臟、尾鰭以及用乙醇保存的3 種組織進(jìn)行DNA 提取效果分析，發(fā)現(xiàn)DNA 樣品質(zhì)量最好的是尾鰭。然而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同等重量的龍頭魚肌肉樣品比鰭條樣品提取的DNA 濃度高，且基因組檢測(cè)和PCR 擴(kuò)增效果均較好，分析可能原因一方面來自人為實(shí)驗(yàn)差異影響，另一方面也可能與龍頭魚肌肉組織含水量較高、肉質(zhì)軟嫩易于被裂解有關(guān)。此外，實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)甲醛固定的組織樣品消化所需時(shí)間為其他樣品的十幾倍，且PCR 擴(kuò)增前后瓊脂糖凝膠電泳電泳結(jié)果均不明顯，表明甲醛殘留對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響較大。盡管前處理過程中利用乙醇的羥基與甲醛的羰基反應(yīng)生成縮醛或半縮醛的反應(yīng)原理，通過乙醇濃度梯度置換出甲醛，但由于甲醛與乙醇較難反應(yīng)，且反應(yīng)產(chǎn)物不穩(wěn)定，加之細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，甲醛對(duì)蛋白酶K 有抑制作用，使得甲醛樣品所提取出的DNA 濃度仍遠(yuǎn)低于其他樣品[30]。因此，后續(xù)的探索實(shí)驗(yàn)還需要對(duì)10%甲醛浸泡樣品的預(yù)處理進(jìn)行改進(jìn)。

由于樣品選取、保存和DNA 提取的各個(gè)環(huán)節(jié)均會(huì)影響DNA 濃度和純度，具體選用哪種方法應(yīng)根據(jù)取樣地點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)條件而定。從提高實(shí)驗(yàn)效率和節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本的角度來看，應(yīng)綜合考慮選擇最優(yōu)設(shè)計(jì)方案。首先，由于龍頭魚體型狹長，內(nèi)臟器官小，鱗片少且易脫落，故內(nèi)臟器官和鱗片不適宜作為樣品組織。選取樣品組織應(yīng)首選龍頭魚肌肉組織，選擇豐滿結(jié)實(shí)的背部肌肉，盡量避開魚骨。如龍頭魚個(gè)體過小或者肌肉損毀嚴(yán)重，則可選用魚鰭代替肌肉組織。其次，由于海上采樣路途遙遠(yuǎn)，無水乙醇具有無毒、無異味且可用于消毒等優(yōu)點(diǎn)，在提取過程的預(yù)處理也較為簡便，但無水乙醇會(huì)使組織迅速脫水并在表面形成硬膜，阻止內(nèi)部組織被固定，有研究表明95%乙醇固定速度慢、有利于充分浸透組織[31]，因此建議出海作業(yè)采集的龍頭魚樣品保存宜用無水乙醇固定，以減少樣品組織細(xì)胞降解。但從經(jīng)濟(jì)和實(shí)用角度考慮，也可用95%乙醇替代無水乙醇。最后，DNA 基因組提取的第一步消化樣品保證時(shí)間充足，操作過程不時(shí)搖動(dòng)溶液以促使蛋白酶K 發(fā)揮最佳消化活性，同時(shí)盡量減少試劑對(duì)樣品的污染，提高DNA 濃度和純度。