厚殼貽貝足絲超氧化物歧化酶的重組表達(dá)及功能

(浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，海洋生物蛋白質(zhì)工程研究室，浙江舟山 316022)

貽貝足絲是貽貝通過足腺分泌的一種絲狀非細(xì)胞組織，其端部為圓盤狀,即足絲盤[1]。利用足絲盤，貽貝可在水環(huán)境中黏附于各種物質(zhì)表面，因而足絲成為新型生物粘附劑研究的重要對(duì)象[2]。貽貝足絲的主要成分為各種足絲蛋白(Mussel Foot Protein，MFP)，目前已報(bào)到的貽貝足絲蛋白有十多種，多具有黏附功能[3-4]。已鑒定的貽貝足絲蛋白可根據(jù)其功能以及在足絲形成和黏附過程的作用主要分為五類，第一類是作為足絲的外套，負(fù)責(zé)足絲的整體保護(hù)，這一類代表為MFP-1，該蛋白主要覆蓋于足絲表面構(gòu)成足絲的保護(hù)外套，以防止海水的腐蝕及微生物的降解[5-6]。第二類是負(fù)責(zé)形成足絲纖維的核心結(jié)構(gòu)，主要包括前膠原蛋白分子(Pre-collagen,包括D 型、P 型和NG 型)，纖維基質(zhì)蛋白(Thread matrix protein,TMP)等形成足絲的纖維狀內(nèi)核，賦予足絲纖維韌性和彈性[7-9]；第三類是產(chǎn)生交聯(lián)并負(fù)責(zé)足絲的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，包括MFP-2 和MFP-4 等，這些分子或者形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)將其他足絲蛋白分子結(jié)合在一起，或者形成用以包裹其他足絲蛋白的基質(zhì)，最終使得足絲形成一個(gè)穩(wěn)定而致密的結(jié)構(gòu)[10-11]；第四類是直接行使黏附功能的蛋白，包括MFP-3 和MFP-5，均為高多巴含量的分子，依賴多巴轉(zhuǎn)換為多巴醌并通過氫鍵與外界基質(zhì)形成牢固的連接[12-13]。第五類則是輔助性足絲蛋白，主要負(fù)責(zé)維持足絲的氧化-還原平衡，使得足絲的黏附性能處于可控狀態(tài)，目前僅報(bào)道了MFP-6，是一種抗氧化足絲蛋白[14-15]。

厚殼貽貝是一種研究足絲蛋白的極好材料，在前期研究中，采用蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略，從其足絲中鑒定一種具有超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)結(jié)構(gòu)域的新型足絲蛋白，被命名為Byssal Superoxide Dismutase (BSOD)[16]。這也是首次從貽貝足絲中發(fā)現(xiàn)SOD 類的蛋白。SOD 是一類抗氧化蛋白，廣泛分布于生物體內(nèi)，對(duì)細(xì)胞防止氧化損傷具有極為重要的作用[17-18]。SOD 是一種金屬結(jié)合酶，根據(jù)其結(jié)合的金屬離子不同，可以將SOD 分子分為四類，包括Fe-SOD，Mn-SOD，Cu/Zn-SOD 和Ni-SOD。其中Cu/Zn-SOD分布最為廣泛，包括各種生物的細(xì)胞內(nèi)或者細(xì)胞外基質(zhì)。貽貝足絲分泌后，在其固化并發(fā)揮黏附功能之前，需要保持一定的還原態(tài)，以防止被海水中各種因子的氧化而導(dǎo)致黏附失敗[14]。盡管足絲蛋白MFP-6 已被證明是一種抗氧化蛋白并對(duì)足絲的黏附具有重要作用[15]，但厚殼貽貝足絲中BSOD 的發(fā)現(xiàn)則提示了在貽貝足絲中不止MFP-6 一種抗氧化蛋白，也表明貽貝足絲具有一套復(fù)雜的抗氧化體系。同時(shí)，BSOD 是一種具有信號(hào)肽的分泌蛋白，因此相比胞內(nèi)SOD 具有更強(qiáng)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，在醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、食品等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

為深入研究貽貝BSOD 的結(jié)構(gòu)與功能，采取了密碼子優(yōu)化策略，根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子重新設(shè)計(jì)和優(yōu)化厚殼貽貝BSOD 基因序列，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過原核重組表達(dá)和蛋白質(zhì)純化手段，獲得了重組BSOD 蛋白并開展了功能分析。為進(jìn)一步研究BSOD 的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，探討B(tài)SOD 在貽貝足絲黏附過程中的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為BSOD 的后續(xù)蛋白質(zhì)工程研究提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 厚殼貽貝BSOD 的序列分析

BSOD 序列已上傳數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank 編號(hào)AKI87983.1)。通過生物信息學(xué)手段對(duì)其開展了序列分析。其中，開放閱讀框以Lasergene 軟件(版本7.0)分析；序列比對(duì)采用DNAman 軟件進(jìn)行；蛋白質(zhì)同源搜索以NCBI 網(wǎng)站的BLAST 工具在線(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#)進(jìn)行；多序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析采用軟件DNAMAN(版本7.0)進(jìn)行；結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)采用SMART 軟件在線(http://smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行；信號(hào)肽預(yù)測(cè)采用SignalP4.1 軟件在線進(jìn)行(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用Jpred4進(jìn)行(http://www.compbio.dundee.ac.uk/jpred4)；三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用SWISS MODEL 服務(wù)器(https://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行。

1.2 目標(biāo)基因的密碼子優(yōu)化、設(shè)計(jì)與表達(dá)載體的構(gòu)建

對(duì)厚殼貽貝BSOD 目標(biāo)基因(495 bp)開展密碼子優(yōu)化以便適于大腸桿菌表達(dá)體系。采用OptimumGeneTM技術(shù)平臺(tái)(南京金斯瑞公司，http://www.genscript.com/)將目標(biāo)基因中的部分密碼子替換為大腸桿菌偏愛密碼子；并分別在目標(biāo)基因的5’端和3’端添加Nco I 酶切位點(diǎn)(CCATGG)和Xho I 酶切位點(diǎn)(CTCGAG)；此外，在目標(biāo)基因5’端添加保護(hù)堿基(CA)和多聚組氨酸標(biāo)簽(CATCATCATCATCATCAC)；最終設(shè)計(jì)出的目標(biāo)基因全長(zhǎng)為526 bp 并由南京金斯瑞公司化學(xué)合成并測(cè)序驗(yàn)證。

目標(biāo)基因與表達(dá)載體(pET28a)均采用Nco I 和Xho I 雙酶切；之后采用T4-DNA 連接酶將目標(biāo)基因與pET28a 質(zhì)粒的酶切片段進(jìn)行連接；連接產(chǎn)物(BSOD/pET28a)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞并涂布于含卡那霉素的LB 平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)后挑取陽(yáng)性單克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.3 重組足絲BSOD 蛋白的表達(dá)、復(fù)性及分離純化

將BSOD/pET28a 重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)表達(dá)菌株(E.coli，BL21)并涂布于含卡納霉素的LB 平板培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單克隆菌落，于含卡納霉素的LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。菌液按照1:100 比例擴(kuò)大培養(yǎng)。設(shè)置37 ℃和16 ℃兩種培養(yǎng)溫度分別培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200 r·min-1。在菌液OD630值為0.6～0.8 時(shí)加入IPTG(1 mmol·L-1)進(jìn)行誘導(dǎo)。37 ℃培養(yǎng)的菌株IPTG 誘導(dǎo)時(shí)間為4 h；16 ℃培養(yǎng)的菌株IPTG 誘導(dǎo)時(shí)間為16 h。

IPTG 誘導(dǎo)結(jié)束后，收集菌液離心(1 000×g，4 ℃，10 min)收集菌體，并以菌體裂解液重懸，冰浴超聲破碎，離心(8 000×g，4 ℃，15 min)分別收集上清和沉淀(包涵體)。用包涵體溶解液溶解包涵體，之后離心(8 000×g，4 ℃，20 min)并收集上清液；上清液經(jīng)0.45 μm 微孔膜過濾后上樣鎳柱并洗脫和收集目的蛋白。

參照文獻(xiàn)[19]方法，對(duì)鎳柱純化后的目的蛋白進(jìn)行稀釋復(fù)性。分別配置不同尿素濃度(1～6 mmol·L-1)的復(fù)性液(含0.1 mmol·L-1氧化型谷胱甘肽，0.9 mmol·L-1還原型谷胱甘肽，20 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0)4 ℃條件下，將蛋白樣品從高濃度尿素到低濃度尿素依次進(jìn)行透析。

復(fù)性后的目標(biāo)蛋白采用高效液相色譜進(jìn)行進(jìn)一步純化。高效液相色譜儀為Waters600 E 型(Waters 公司，美國(guó))，檢測(cè)器為Waters 2487 雙波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器(Waters 公司，美國(guó))；色譜柱為C8 反相色譜柱(Vydac，218TP)；采用線性梯度洗脫，即B 液(含0.1%三氟乙酸的乙腈)在30 min 內(nèi)，其比例由20%上升至50%。A液為含0.1%三氟乙酸的純水；流速為1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。

1.4 SDS-PAGE 和Western 分析

SDS-PAGE 采用4%濃縮膠結(jié)合12%分離膠，樣品事先以2×電泳上樣緩沖液溶解；以牛血清白蛋白作為定量分析對(duì)照，上樣體積為15 μL。恒壓模式電泳。電泳結(jié)束后以考馬斯亮藍(lán)R250 進(jìn)行膠染色并觀察。

將電泳分離后的蛋白膠轉(zhuǎn)印至PVDF 膜。因所表達(dá)的目標(biāo)蛋白含有多聚組氨酸標(biāo)簽(His-tag)，因此，膜經(jīng)洗滌和封閉后，采用鼠抗His-tag 抗體(南京金斯瑞公司，貨號(hào)A00186)進(jìn)行孵育過夜，之后再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗(南京金斯瑞公司,貨號(hào)A00160)孵育60 min，以ECL 化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影。

1.5 重組足絲BSOD 的質(zhì)譜鑒定

利用質(zhì)譜(Voyager DETMSTR，美國(guó)Applied Biosystems 公司)進(jìn)行重組蛋白的精確分子量鑒定；基質(zhì)為α-氰基-4-羥基-肉桂酸(CCA)，通過以下方式制備樣品：取2 μL 樣品液加入到8 μL CCA(溶于50%乙腈溶液，含0.1%三氟乙酸)的飽和溶液，混勻后取1 μL 點(diǎn)樣，室溫干燥后測(cè)定，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行分子量校正。

對(duì)重組蛋白開展串聯(lián)質(zhì)譜(5700 Proteomics Analyzer TOF/TOFTM，美國(guó)Applied Biosystems 公司)分析所表達(dá)的蛋白肽段序列；蛋白樣品經(jīng)還原烷基化以及胰蛋白酶酶解后上樣質(zhì)譜儀；質(zhì)譜分析工作電壓為20 kV，采用正離子模式，自動(dòng)模式采集數(shù)據(jù)。PMF 質(zhì)量掃描范圍為700～3 600 Da，以強(qiáng)度最大的8 個(gè)峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析；譜圖用myoglobin 酶解肽段進(jìn)行外標(biāo)校正。根據(jù)肽段的理論序列生成理論胰酶酶切肽段質(zhì)量與肽指紋圖進(jìn)行比對(duì)，質(zhì)量相符的肽段進(jìn)一步進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜譜圖分析，獲得其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列并與理論氨基酸序列進(jìn)行比較。

1.6 重組BSOD 的功能測(cè)試

對(duì)重組并復(fù)性成功的BSOD 開展功能分析，其中重組BSOD 溶液按摩爾比1:2 加入預(yù)先配置的硫酸銅和氯化鋅溶液進(jìn)行Cu/Zn 離子鰲合，并比較鰲合前后重組BSOD 的功能。酶活采用總SOD 活性檢測(cè)試劑盒(WST-8 法)(貨號(hào)：S0101,碧云天公司)并參照說明書進(jìn)行；SOD 標(biāo)準(zhǔn)品為牛紅細(xì)胞Cu/Zn-SOD(上海生工公司，貨號(hào)：A003540)；重組BSOD 的自由基清除率采用DPPH 法測(cè)定[20]。取重組蛋白溶于0.02%DPPH 的無水乙醇溶液，樣品終濃度為0.015 mmol·L-1；采用無水乙醇作參比，混勻后在室溫下避光反應(yīng)30 min，于517 nm 波長(zhǎng)下測(cè)吸光度。平行測(cè)定3 次取平均值。采用維生素C(Vc)為陽(yáng)性對(duì)照。根據(jù)下列公式計(jì)算樣品對(duì)DPPH 自由基的清除率：清除率=(A0+A1-A2)/A0*100%；式中，A0 為無水乙醇加水加DPPH 溶液的吸光度；A1 為含蛋白樣品的無水乙醇溶液的吸光度；A2 為含蛋白樣品的DPPH 溶液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 厚殼貽貝SOD 序列分析結(jié)果

厚殼貽貝BSOD 的cDNA 基因(GeneBank 編號(hào)AKI87983.1)全長(zhǎng)851 bp，其開放閱讀框長(zhǎng)度為546 bp，編碼一個(gè)由181 個(gè)氨基酸殘基組成的前體蛋白，其核苷酸-氨基酸序列比對(duì)見圖1。

經(jīng)NCBI 網(wǎng)站的BLAST 搜索，發(fā)現(xiàn)厚殼貽貝足絲BSOD 分子與數(shù)據(jù)庫(kù)中其他物種的SOD，特別是Cu/Zn-SOD 具有較高的序列相似性，其氨基酸一致性在40%～60%之間，序列覆蓋率在70%～96%之間。在BLAST 結(jié)果中，選擇有確定注釋名稱且氨基酸一致性在50%以上的同源序列共計(jì)38 條進(jìn)行多序列比對(duì)分析，結(jié)果如圖2。由圖2 可見，各序列在SOD_Cu 結(jié)構(gòu)域肽段具有較高的序列相似性，特別是在第60-140號(hào)殘基所處肽段，涉及銅和鋅離子結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)鍵氨基酸殘基，如第70、73、75、90、98 和107 號(hào)組氨酸在各序列中完全保守(圖1 方框和圖2*號(hào)標(biāo)注)；此外，84 和175 號(hào)半胱氨酸殘基(圖1 圓框和圖2#號(hào)標(biāo)注)在各序列中也完全一致。此外，我們注意到BSOD 序列與其他物種SOD 序列相比，在30 號(hào)和176 號(hào)額外多出兩個(gè)半胱氨酸殘基(圖1 圓框和圖2▼號(hào)標(biāo)注)，表明BSOD 可能比其他同源SOD 多出一對(duì)二硫鍵。

圖2 厚殼貽貝BSOD(方框所示)與同源序列的多序列比對(duì)Fig.2 Multiple sequence alignment of BSOD with 38 homologys form other species

采用臨近法(Neighbor-joining) 繪制厚殼貽貝BSOD 與38 條同源序列的進(jìn)化樹，結(jié)果如圖3。厚殼貽貝BSOD 與其他物種的SOD 相比,其進(jìn)化地位較為獨(dú)特,且與來自水生甲殼類(如蝦、蟹等)的胞外Cu/Zn-SOD 具有較近的親緣關(guān)系。

對(duì)BSOD 的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，其序列中含有7%的a-螺旋和38%的β-折疊，其中a-螺旋主要位于信號(hào)肽區(qū)域(圖4A)；SMART 結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，厚殼貽貝BSOD 前體序列中N 端17 個(gè)氨基酸殘基(MNMISIFLLSVVALSTA)為信號(hào)肽，進(jìn)一步的SignalP 軟件對(duì)信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果證實(shí)了SMART 軟件的計(jì)算結(jié)果，表明信號(hào)肽預(yù)測(cè)可靠；此外，序列中第34-178 號(hào)肽段為SOD_Cu 結(jié)構(gòu)域(pfam 編號(hào)為PF00080)。圖4B和C 分別展示了BSOD 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的二聚體和四聚體模型，可見BSOD 成熟肽區(qū)主要包含7 段反平行β-折疊，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)基本一致。

圖3 采用臨近法構(gòu)建系統(tǒng)樹對(duì)厚殼貽貝BSOD 與38 條同源序列的進(jìn)化樹分析結(jié)果Fig.3 Phylogenetic analysis of M.coruscus BSOD with 38 homologous from other species using the Neighbor-joining approach

2.2 BSOD 基因的設(shè)計(jì)和密碼子優(yōu)化

天然BSOD 成熟肽區(qū)域的基因長(zhǎng)度為495 bp，經(jīng)重新設(shè)計(jì)和優(yōu)化，目標(biāo)基因長(zhǎng)度為526 bp，設(shè)計(jì)后的目標(biāo)基因編碼一條長(zhǎng)度為173 個(gè)氨基酸殘基組成的重組蛋白(圖5A)，與天然BSOD 相比，重組BSOD 在N端多出一段MAHHHHHH 肽段，其余序列與天然BSOD 一致，兩者的序列比對(duì)如圖5B。重新設(shè)計(jì)的目標(biāo)基因與天然BSOD 序列的一致性為68%。

圖4 厚殼貽貝BSOD 空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 The structural features of M.coruscus BSOD

對(duì)優(yōu)化后的目標(biāo)基因開展了密碼子適應(yīng)指數(shù)(Codon Adaptation Index，CAI)分析，結(jié)果如圖6。BSOD 基因在優(yōu)化前，其CAI 值經(jīng)OptimumGeneTM軟件在線計(jì)算(http://www.genscript.com.cn/technology-support/online-tools)，為0.62；經(jīng)優(yōu)化后，其CAI 值達(dá)到了0.97。CAI 值大于0.8 則意味著該目標(biāo)基因在大腸桿菌中的表達(dá)效率較高[21]。

2.3 重組BSOD 的表達(dá)、純化與鑒定

BSOD 重組菌經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)后，收集菌體經(jīng)超聲破碎和離心后，上清與沉淀部分分別以SDSPAGE 進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖7。由圖7A 可見，目標(biāo)蛋白主要表達(dá)于沉淀部分，呈包涵體表達(dá)特征。目標(biāo)蛋白條帶約為19 kDa，與重組BSOD 的預(yù)期分子量(18.7 kDa)接近。進(jìn)一步經(jīng)western blot 檢測(cè)，所表達(dá)的目標(biāo)條帶能與抗組氨酸抗體結(jié)合并產(chǎn)生特異性亮帶，表明所表達(dá)的重組BSOD 帶有多聚組氨酸標(biāo)簽。同時(shí)，在Westernblot 檢測(cè)中，也發(fā)現(xiàn)有分子量約36，55 和72 kDa 的條帶，推測(cè)為BSOD 分別形成二聚體，三聚體和四聚體所致(圖7B)。

圖5 BSOD 基因優(yōu)化后的核苷酸-氨基酸序列比對(duì)圖Fig.5 The deduced amino acid sequence of recombinant BSOD gene (A) and sequence alignment of BSOD gene before and after OptimumGeneTM optimization (B)

圖6 BSOD 基因經(jīng)優(yōu)化前后的密碼子使用偏好性分布比較圖Fig.6 The distribution of codon usage frequency along the gene sequence of BSOD before (A) and after (B)OptimumGeneTM optimization

圖7 重組BSOD 蛋白的表達(dá)及純化Fig.7 Recombinant expression and purification of BSOD

重組BSOD 經(jīng)鎳柱純化后采用稀釋法進(jìn)行復(fù)性，以期完成正確折疊。復(fù)性后的重組BSOD 采用反相高效液相色譜進(jìn)行分離，結(jié)果如圖7C。由圖可見，復(fù)性后重組BSOD 經(jīng)HPLC 分離并在35%乙腈濃度出峰，為單峰，表明純度較高。目標(biāo)峰進(jìn)一步開展質(zhì)譜分析。結(jié)果見圖7D，可見重組BSOD 的精確分子量為18 685.42 Da；與理論分子量18 707.83 Da 相比，相差僅22 Da。

進(jìn)一步對(duì)重組BSOD 酶解后開展串聯(lián)質(zhì)譜分析，共分析三個(gè)肽段，分別為1 064.486 7、1 335.648 7 和1426.6383；3 個(gè)肽段的序列分析結(jié)果分別為“-YGSQEVLIR-”、“-AIVIHAGVDDLGR-”和“-NSVYGQLNLYQK-”(圖8)，分別對(duì)應(yīng)重組BSOD 分子序列中第42～50、136～148 和30～41 肽段(圖1)；表明重組蛋白的序列正確，表達(dá)成功。

圖8 重組BSODLC-MS/MS 質(zhì)譜分析圖Fig.8 MS/MS spectrum of recombinant BSOD

2.4 重組BSOD 的功能分析

采用總SOD 活性檢測(cè)試劑盒(WST-8 法)(貨號(hào)S0101，碧云天公司)鑒定重組BSOD 的酶活性。分別檢測(cè)重組BSOD、鰲合Cu/Zn 離子后的重組BSOD 及SOD 標(biāo)準(zhǔn)品的酶活力，并進(jìn)行比較(結(jié)果如圖9A)，可見經(jīng)Cu/Zn 離子鰲合后的重組BSOD，與重組SOD 和SOD 標(biāo)準(zhǔn)品相比，具有更強(qiáng)的酶活力。進(jìn)一步采用DPPH 法鑒定重組BSOD 的自由基清除率，結(jié)果如圖9B?？梢娭亟MBSOD 具有較明顯的自由基清除能力，但其清除率明顯低于維生素C(P＜0.01，n=3)；而經(jīng)Cu/Zn 離子鰲合后，重組BSOD 的自由基清除率明顯上升且強(qiáng)于維生素C(P＜0.01，n=3)。測(cè)試不同溫度下重組BSOD 的酶活力變化，由圖9C 可見，重組SOD 以及Cu/Zn 離子鰲合后的重組BSOD 的最佳酶活力溫度均在30 ℃左右；而在70 ℃條件下，重組BSOD 以及Cu/Zn 離子鰲合后的重組BSOD 處仍然保留約50%的酶活力，表明BSOD 具有較好的熱穩(wěn)定性。測(cè)試重組BSOD 在不同pH 條件下的酶活變化，發(fā)現(xiàn)重組BSOD 以及Cu/Zn 離子鰲合后的重組BSOD 酶活力的最佳pH 在4 左右(圖9D)。

圖9 重組BSOD 的功能分析Fig.9 Functional analysis of recombinant BSOD

3 討論

SOD 作為一種廣泛分布于生物體內(nèi)的抗氧化劑，也是生物用以對(duì)抗活性氧傷害的最重要防線。目前，已報(bào)到的SOD 中，Cu/Zn-SOD 主要存在于真核生物，其活性形式為同源二聚體[22-23]。早在1975 年，第一種Cu/Zn-SOD(來自小牛血清)的空間結(jié)構(gòu)被解析。Cu/Zn-SOD 的空間結(jié)構(gòu)包含一段由8 個(gè)beta-折疊片組裝成希臘鑰匙(Greek Key)型折疊桶結(jié)構(gòu)，其銅和鋅離子的結(jié)合位點(diǎn)由6 個(gè)組氨酸殘基和一個(gè)天冬氨酸殘基所組成[23]。Mn/Fe-SOD 主要存在于原核生物以及真核生物的線粒體和葉綠體內(nèi)[24]，其中，F(xiàn)e-SOD 主要以二聚體形式發(fā)揮功能，而Mn-SOD 則以二聚體或者四聚體形式發(fā)揮功能；而Ni-SOD 則主要存在于原核細(xì)胞，其空間結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)由右手螺旋組成的六聚體結(jié)構(gòu)，每一個(gè)右手螺旋的N 端可以鰲合一個(gè)鎳離子，其鰲合鎳離子的活性位點(diǎn)由His-Cys-X-X-Pro-Cys-Gly-X-Tyr 肽段所組成[25]。厚殼貽貝BSOD 與其他物種的Cu/Zn-SOD 具有較高的序列相似性，但其氨基酸一致性最高也僅為61%，表明厚殼貽貝BSOD 與其他物種的Cu/Zn-SOD 仍具有較大的氨基酸差異，推測(cè)與厚殼貽貝BSOD 需適應(yīng)貽貝足絲的所處環(huán)境和黏附性能有關(guān)。從進(jìn)化樹分析結(jié)果來看，厚殼貽貝BSOD 主要與來自甲殼類的紅螯螯蝦Cherax quadricarinatus 和信號(hào)小龍蝦Pacifastacus leniusculus 的細(xì)胞外Cu/Zn-SOD，以及克氏原螯蝦Procambarus clarkii 的Cu/Zn-SOD 親緣關(guān)系較近，而與貝類已報(bào)到的Cu/Zn-SOD 的親緣距離反而較遠(yuǎn)(圖5)，可能是由于目前數(shù)據(jù)庫(kù)中尚無其他貝類的足絲SOD 數(shù)據(jù)有關(guān)，同時(shí)也暗示著，厚殼貽貝BSOD 與貝類的其他SOD 分子可能在進(jìn)化上發(fā)生了較大的偏移。

厚殼貽貝BSOD 分子序列中含有4 個(gè)半胱氨酸，與其他物種的SOD 相比，額外多出2 個(gè)半胱氨酸(圖2)，推測(cè)厚殼貽貝BSOD 可能形成2 對(duì)二硫鍵，因而與其他物種的Cu/Zn-SOD 相比具有更好的穩(wěn)定性?？紤]到足絲本身是一種負(fù)責(zé)黏附的非細(xì)胞組織，其所處環(huán)境又是直接暴露于富含各種氧化因素，如溶解氧和高價(jià)位金屬離子的海水中，因此，BSOD 面臨的是比細(xì)胞內(nèi)更為復(fù)雜和嚴(yán)苛的環(huán)境，因而在結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)生了適應(yīng)性進(jìn)化，且可能在二硫鍵分布以及空間結(jié)構(gòu)上與其他貝類已報(bào)道的Cu/Zn-SOD 存在差異。此外，厚殼貽貝BSOD 分子成熟肽序列中含有較為豐富的組氨酸殘基。根據(jù)厚殼貽貝BSOD 與其他物種Cu/Zn-SOD 的多序列比對(duì)結(jié)果(圖4)，我們發(fā)現(xiàn)BSOD 的活性位點(diǎn)中，6 個(gè)組氨酸以及3 個(gè)天冬氨酸與其他物種的Cu/Zn-SOD 具有較高的保守性，考慮到Cu/Zn-SOD 與Cu/Zn 離子的結(jié)合位點(diǎn)主要由組氨酸和天冬氨酸組成[23]，因此，厚殼貽貝BSOD 也可能具有Cu/Zn 離子的螯合能力。這一點(diǎn)在重組BSOD 的功能分析中被初步證實(shí)(圖9)。與已知的貽貝足絲抗氧化蛋白MFP-6 相比，BSOD 與其在序列上差異較大。MFP-6 是一種富含半胱氨酸的足絲蛋白，且其半胱氨酸多數(shù)未形成二硫鍵，因此其側(cè)鏈巰基處于游離狀態(tài)，因此，推測(cè)MFP-6 的抗氧化活性主要來自于其半胱氨酸殘基的游離巰基[14-15]，而BSOD 的抗氧化活性則可能來自其SOD 結(jié)構(gòu)域及其螯合的二價(jià)金屬離子。

通過密碼子優(yōu)化結(jié)合大腸桿菌原核重組表達(dá)體系，成功表達(dá)出厚殼貽貝BSOD 蛋白分子。采用密碼子優(yōu)化策略能改善目標(biāo)蛋白在大腸桿菌表達(dá)體系中的表達(dá)效率[26]。從表達(dá)結(jié)果來看,重組BSOD 可能形成二聚體和三聚體(圖7B)，這與其他物種的Cu/Zn-SOD 類似[23]。根據(jù)western blot 檢測(cè)結(jié)果以及質(zhì)譜測(cè)序，發(fā)現(xiàn)所表達(dá)的重組BSOD 序列中帶有多聚組氨酸標(biāo)簽，且質(zhì)譜測(cè)得的肽片段序列與表達(dá)目標(biāo)蛋白的序列一致(圖8)，表明表達(dá)成功。但重組BSOD 在大腸桿菌中主要以包涵體形式表達(dá)，且低溫(16 ℃)誘導(dǎo)表達(dá)并未改善表達(dá)產(chǎn)物的可溶性(圖7)。包涵體表達(dá)雖然有助于防止蛋白降解并有助于后續(xù)的純化，但是由于包涵體表達(dá)的蛋白是變性蛋白，因此，在測(cè)試其活性前，必須采取氧化復(fù)性的形式以便獲得折疊正確的蛋白質(zhì)分子。為此，采取稀釋復(fù)性法完成對(duì)重組BSOD 的復(fù)性。復(fù)性后的重組BSOD 表現(xiàn)出較強(qiáng)的酶活力和自由基清除能力，且該活性在鰲合了Cu/Zn 離子后，明顯增強(qiáng)。表明BSOD 在發(fā)揮活性時(shí)需要二價(jià)金屬離子的輔助。同時(shí)，重組BSOD 具有較好的熱穩(wěn)定性，在70 ℃條件下，重組BSOD 仍保留約50%的酶活(圖10B)。

4 結(jié)論

厚殼貽貝BSOD 是一種新型的SOD 分子。通過原核重組表達(dá)體系結(jié)合密碼子優(yōu)化策略，成功獲得BSOD 表達(dá)產(chǎn)物，重組BSOD 在復(fù)性以及經(jīng)Cu/Zn 離子鰲合后，具有較強(qiáng)的酶活性和DPPH 清除能力，同時(shí)也具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，上述研究結(jié)果表明，厚殼貽貝BSOD 分子是一種Cu/Zn-SOD，其較強(qiáng)的酶活力和較好的熱穩(wěn)定性為后續(xù)基于厚殼貽貝BSOD 的蛋白質(zhì)工程改造奠定了基礎(chǔ)。