THRSP 和S14R 促進(jìn)脂質(zhì)合成的作用機(jī)制

郝明碩，吳靜，張政，段汪鑫

（華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北省慢性病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 唐山）

0 引言

早在1984 年，人們研究甲狀腺激素在脂肪組織中的反應(yīng)時(shí)就發(fā)現(xiàn)了甲狀腺激素應(yīng)答蛋白Spot14 (thyriod hormone responsive spot14, THRSP)[1]。THRSP 基因包含THRSPα 和THRSPβ 2 種亞型。THRSPα 包含2 個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子，外顯子1 含有整個(gè)編碼區(qū)和部分3'非翻譯區(qū)，外顯子2為3'非翻譯區(qū)，外顯子1 編碼完整的蛋白Spot14(或稱S14)，該蛋白是一種小分子量、酸性的細(xì)胞核內(nèi)蛋白，正調(diào)控或負(fù)調(diào)控輔激活轉(zhuǎn)錄因子，在組織特異性脂類代謝調(diào)控中起到關(guān)鍵的作用。Thrsp 和 S14R 基因是碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（ChREBP） 的直接靶基因，通過(guò)啟動(dòng)子區(qū)的糖反應(yīng)元件（ChoRE）調(diào)節(jié)表達(dá)。二者既直接接受 肝 X 受體（LXRs）的調(diào)節(jié)，也可以通過(guò) ChREBP 間接被 LXRs 調(diào)節(jié)。另外，Thrsp 和 S14R 基因都可以與乙酰輔酶A 羧化酶（ACC）結(jié)合，顯著增強(qiáng)該酶酶活，進(jìn)而促進(jìn)脂肪酸和甘油三酯的生成[2]。

1 脂肪合成的生化過(guò)程

肝組織、脂肪組織、小腸是甘油三脂合成（脂肪合成）的三大組織。肝臟能夠合成脂肪，但不能儲(chǔ)存脂肪。其合成的三酰甘油、磷脂、膽固醇和載脂蛋白組成的極低密度脂蛋白（VLDL）分泌進(jìn)入血液后，三酰甘油被水解，產(chǎn)物被其他組織利用。豬體內(nèi)的脂肪合成工作主要由脂肪組織來(lái)完成，脂肪組織既以葡萄糖作為原料合成脂肪，還主要攝取由肝組織和小腸合成的脂肪酸。小腸主要靠消化食物中的脂類，再由消化產(chǎn)物合成脂肪[3]。

甘油三脂是脂肪酸在細(xì)胞內(nèi)的主要存在形態(tài)，一般并不游離存在。甘油三脂有兩種合成路徑，一是 α-磷酸甘油（甘油-3-磷酸）途徑，因?yàn)橐愿视?3-磷酸為原料與脂酰-CoA反應(yīng)而得名，肝和脂肪細(xì)胞主要由此方式合成。α-磷酸甘油即甘油-3-磷酸，來(lái)源有兩個(gè)：一是由糖酵解的產(chǎn)物磷酸二羥丙酮還原得到，二是脂肪分解代謝生成的甘油以及胃腸道從食物中吸收而來(lái)的甘油，再由甘油激酶催化生成 α-磷酸甘油。利用葡萄糖合成或組織攝取的脂肪酸，經(jīng)脂酰 CoA 合成酶催化，與輔酶 A（HS-CoA）反應(yīng)生成脂酰-CoA。脂酰-CoA與 α-磷酸甘油經(jīng)由參與 α-磷酸甘油途徑的催化酶催化，最終生成三酰甘油。甘油三酯生成的另外一種途徑是甘油一酯途徑，小腸粘膜上皮細(xì)胞主要按此途徑生成甘油三酯。此途徑中，小腸粘膜上皮細(xì)胞吸收的甘油一酯與脂酰 CoA 反應(yīng)，由甘油一酯轉(zhuǎn)?；福∕GAT）、甘油二酯轉(zhuǎn)酰基酶（DGAT）依次催化生成脂肪[4]。乙酰-CoA 本身不能夠穿越線粒體內(nèi)膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)參加合成反應(yīng)，需借助檸檬酸-丙酮酸循環(huán)，通過(guò)兩次物質(zhì)轉(zhuǎn)化從線粒體轉(zhuǎn)移細(xì)胞質(zhì)中[5]。

2 THRSP 基因簡(jiǎn)介

甲狀腺激素應(yīng)答蛋白(THRSP)是1981 年seelig 等用體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行雙向電泳來(lái)研究甲狀腺激素對(duì)大鼠肝臟基因表達(dá)的影響。從甲狀腺功能低下、正常和甲狀腺功能亢進(jìn)三組動(dòng)物中，發(fā)現(xiàn)了的19 個(gè)可被調(diào)節(jié)的蛋白點(diǎn)，Thrsp 是第14個(gè)點(diǎn)，因此也稱作甲狀腺激素應(yīng)答點(diǎn)14 蛋白（spot14），簡(jiǎn)稱S14，是一種核蛋白。Thrsp 基因在人類基因組定位于第11 號(hào)染色體，在雞定位于1 號(hào)染色體，在小鼠定位于第7 號(hào)染色體，而在大鼠定位于第1 號(hào) 染 色 體。三 個(gè) 物 種 的 Thrsp均由兩個(gè)外顯子組成，且編碼區(qū)僅位于第1 外顯子。三者核苷酸序列的同源性為65 % ～87 %，編碼區(qū)的同源性高達(dá)83%～93%，蛋白序列的同源性為 82% ～94%。Thrsp 基因編碼的產(chǎn)物為一種分子量為17kD 的酸性蛋白，與其同源基因 S14R (S14 related) 之間存在三個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。其中僅有羧基端的卷曲螺旋(coiled coil) 結(jié)構(gòu)域是已知的，該結(jié)構(gòu)有助于 Thrsp 形成多聚體[6]。

3 THRSP 基因的表達(dá)

Thrsp 在細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)均有表達(dá)。對(duì)于該基因在不同組織中的表達(dá)情況，在人(Homo sapiens)、大鼠(Rattus rvegicus)、豬和雞上的研究發(fā)現(xiàn)該基因主要在肝臟、腹脂和乳腺等脂肪生成組織內(nèi)表達(dá)(Jump, Oppenheimer,1985)，與肥胖癥密切相關(guān)。在心、腦、脾、肺、腎、睪丸和垂體等非脂肪組織中THRSPα 基因的表達(dá)極低，且不被高糖飲食和甲狀腺激素誘導(dǎo)表達(dá)。也有研究結(jié)果表明，Thrsp 基因在其他哺乳動(dòng)物中也高表達(dá)于脂肪組織、肝臟和乳腺組織等脂肪生成活躍組織，這與其功能有關(guān)。在研究Spot14α 基因多態(tài)性與雞生長(zhǎng)和體組成性狀的相關(guān)性時(shí)，采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restrictionfragment length polymorphism, RFLP) 檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)該基因的A123C 和9 bp 的插入缺失兩處突變[7]。近幾年有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)敲低THRSP 導(dǎo)致了細(xì)胞的脂質(zhì)合成降低，且敲除小鼠(Mus musculus) THRSP 基因?qū)е缕淙橄俚闹|(zhì)合成下降、乳汁甘油三酯含量減少，而肝臟的脂質(zhì)合成反而增多，由此證明THRSP 可以促進(jìn)脂質(zhì)合成[8]。

4 Thrsp 的表達(dá)調(diào)控

實(shí)驗(yàn)證明，甲狀腺激素(triiodothyro-nine，T3) 處理20分鐘后即可誘導(dǎo)肝臟Thrsp 的表達(dá)，并使其在 4 小時(shí)內(nèi)表達(dá)升高16 倍。迅速的調(diào)節(jié)反應(yīng)提示Thrsp 是甲狀腺激素受體(thyroid receptor，TR) 的直接靶基因。由此Thrsp 被廣泛用于研究T3 調(diào)節(jié)基因表達(dá)的機(jī)制。這項(xiàng)研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)脂質(zhì)合成的高糖飲食也可顯著誘導(dǎo)肝臟 Thrsp mRNA 的表達(dá)[9]。甲狀腺激素的替代治療可恢復(fù)Thrsp 對(duì)蔗糖處理的快速反應(yīng)性。上述各種刺激因素通過(guò)激活對(duì)應(yīng)的受體(如甲狀腺激素受體TR)或轉(zhuǎn)錄因子，如糖反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(carbohydrate responsive element binding pro-tein，ChREBP) 和 甾 醇 調(diào) 節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c)、糖反應(yīng)元件(carbohydrate response element，ChoRE)和甾醇反應(yīng)元件(sterol response element，SRE)，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié) Thrsp 的表達(dá)。目前在家畜、家禽中關(guān)于Thrsp 基因的研究報(bào)道多集中在對(duì)其單核苷酸多態(tài)性，Thrsp 基因多態(tài)性與豬的背膘厚、牛肉的嫩度及系水力、鴨的肝臟率、雞的腹脂重和體重等具有明顯的關(guān)聯(lián)性[10]。在 Thrsp 的主效基因地位方面，研究者發(fā)現(xiàn)人和小鼠 Thrsp 基因的染色體區(qū)域與肥胖癥有關(guān)聯(lián)。除此之外，Thrsp 的研究主要是對(duì)其表達(dá)調(diào)控的研究，但是它調(diào)控某些基因表達(dá)的具體機(jī)制仍不清楚，對(duì)其分子結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、是否存在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平的化學(xué)修飾也尚無(wú)報(bào)道，其對(duì)脂肪合成的作用的更詳細(xì)機(jī)理以及其他功能有待進(jìn)一步研究[11]。

5 Thrsp 促進(jìn)脂質(zhì)合成的作用機(jī)制

對(duì)Thrsp 結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)跟數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知蛋白有一樣的催化結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明該蛋白并不具備直接催化功能，可能通過(guò)其他方式在脂肪合成中發(fā)揮作用。 Thrsp 基因在脂肪沉積中起著重要作用，通過(guò)調(diào)控脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)發(fā)揮作用，可調(diào)控 ME，F(xiàn)ASN，檸檬酸裂解酶等基因的表達(dá)。也可以與 ACC 結(jié)合而顯著提高 ACC 在生理濃度下的酶活，引起脂肪合成的增加。在胚胎和動(dòng)物幼仔發(fā)育過(guò)程中，Thrsp 表達(dá)的改變也提示該蛋白與脂質(zhì)合成密切相關(guān)[12]。參與其中的酶包括 ATP-檸檬酸裂解酶( ATP citrate lyase，ACL) 、脂肪酸合成酶 (fatty acid synthase，F(xiàn)AS) 、蘋果酸酶( malic enzyme，ME) 和肝型丙酮酸激酶( liver pyru-vate kinase，L-PK)[13]。此外，利用RNA 干擾技術(shù)(short inhibitory RNA，si RNA) 敲低乳腺癌細(xì)胞Thrsp 表達(dá)的研究也證明Thrsp 是脂質(zhì)合成所必需的。敲除Thrsp 基因近端啟動(dòng)子和全長(zhǎng)編碼序列的純合敲除小鼠在胚胎早期死亡，而保留了前21 個(gè)氨基酸的Thrsp 基因敲除小鼠可以存活，且遺傳規(guī)律符合孟德?tīng)柖?。該現(xiàn)象可能是由于Thrsp 的同源基因，S14R 在肝臟起到代償作用。而在S14R 不表達(dá)的乳腺中，Thrsp 的缺失顯著影響脂質(zhì)合成，使敲除母鼠乳汁中甘油三酯含量比野生型減少33%，并主要缺乏中鏈脂肪酸。該現(xiàn)象主要反映在敲除母鼠哺育的幼鼠體重明顯低于正常[14]。

6 Thrsp 的同源蛋白S14R 簡(jiǎn)介

Thrsp(又稱S14)的同源蛋白S14R，最早由Berti 等(2004)發(fā)現(xiàn)，與中線蛋白1( midline1，Mid1) 結(jié)合，在胚胎發(fā)育過(guò)程中共同維持細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性。因此 S14R 又稱為 Mid1相 互 作 用 蛋 白1(Mid1 interacting protein，Mid1ip1)、以 及Mig12(Mid1-interacting G12-like protein)。S14R 基 因 在 人和哺乳動(dòng)物均定位于X 染色體，與Thrsp 的蛋白序列同源性為36%。S14R 為22kD 的胞漿蛋白，與Thrsp 不同，S14R 具有廣泛的組織分布[15]。過(guò)表達(dá)S14R 可促進(jìn)LXR 激動(dòng)劑誘導(dǎo)的脂質(zhì)合成和甘油三酯堆積，而S14R 敲除則削弱LXR 激動(dòng)劑的誘導(dǎo)作用，說(shuō)明S14R 介導(dǎo)了LXR 活化引起的肝臟脂質(zhì)合成。在大鼠原代肝細(xì)胞中，用siRNA 敲低Thrsp 或S14R均能降低葡萄糖刺激的脂質(zhì)合成，并且二者同時(shí)敲低可使脂質(zhì)合成進(jìn)一步降低。而Thrsp 和S14R 同時(shí)敲低后，再用腺病毒過(guò)表達(dá)其中任一種基因，均可使脂質(zhì)合成恢復(fù)，說(shuō)明Thrsp與S14R 促進(jìn)脂質(zhì)合成的作用存在重疊。在體實(shí)驗(yàn)也證明，S14R 過(guò)表達(dá)促進(jìn)肝臟脂質(zhì)合成[16]。

7 脂肪合成過(guò)程中關(guān)鍵基因的表達(dá)與調(diào)控

在轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究中，目標(biāo)基因與轉(zhuǎn)錄因子功能相關(guān)性是首先應(yīng)該分析的內(nèi)容。通過(guò)試驗(yàn)選取的豬的肝臟、大網(wǎng)膜、背最長(zhǎng)肌、腎周脂肪、背膘5 個(gè)脂肪合成活躍的組織部位，通過(guò)熒光定量PCR 檢測(cè)5 個(gè)部位ACACA 基因、Thrsp基因、ACSL1 基因在不同體重分組的mRNA 相對(duì)表達(dá)量，從mRNA 水平研究三個(gè)基因表達(dá)量的關(guān)系。乙酰輔酶A 羧化酶（ACC）在脂肪合成代謝和分解代謝中都具有十分重要的功能，它包含ACC-α 和ACC-β 兩種同工酶，二者分別由ACACA 基因和ACACB 基因編碼。ACSL1 基因表達(dá)量的高低，可在一定程度上反應(yīng)細(xì)胞中脂肪酸含量的多少[17]。試驗(yàn)通過(guò)5 個(gè)部位的基因mRNA 表達(dá)量的研究發(fā)現(xiàn)，ACACA、Thrsp 和ACSL1 基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)趨勢(shì)具有一致性，在大網(wǎng)膜、背最長(zhǎng)肌、腎周脂肪組織中均有顯著或極顯著的相關(guān)關(guān)系。有研究表明，Thrsp 可與其同源蛋白S14R 以同源二聚體或異源二聚體形式結(jié)合，再與ACC 結(jié)合，顯著提高ACC 的活性。本研究結(jié)果中，Thrsp 基因與ACACA 基因在mRNA 表達(dá)水平具一定的相關(guān)性，但是Thrsp 對(duì)ACC 是否在轉(zhuǎn)錄水平存在調(diào)控作用，還需要基因啟動(dòng)子區(qū)的研究、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的研究、DNA 和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合分析等一系列研究，才能確定詳細(xì)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。ACSL1 與ACACA、Thrsp 間存在較強(qiáng)的相關(guān)性，但它與二者是否存在調(diào)控關(guān)系，也需要進(jìn)一步詳細(xì)研究[18]。

8 總結(jié)與展望

本文以脂肪合成的生化反應(yīng)為基礎(chǔ)，用文獻(xiàn)挖掘的方法介紹了脂肪合成過(guò)程分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，Thrsp 可與其同源蛋白S14R 以同源二聚體或異源二聚體形式結(jié)合，再與ACC 結(jié)合，顯著提高ACC 的活性。研究通過(guò)對(duì)ACACA、Thrsp、ACSL1基因mRNA 表達(dá)水平的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在不同的組織部位，三個(gè)基因之間均表現(xiàn)出較強(qiáng)的相關(guān)性，其中ACACA 和Thrsp位于同一條代謝通路中，已有報(bào)道稱Thrsp 可以顯著提高ACC 的活性，但是二者是否存在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，還需要通過(guò)啟動(dòng)子克隆、報(bào)告基因活性分析、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的確定、DNA-轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合分析等試驗(yàn)進(jìn)一步研究。目前尚未報(bào)道ACSL1 與Thrsp 或ACACA 之間存在調(diào)控關(guān)系，研究結(jié)果顯示，ACSL1 與Thrsp 基因在mRNA 表達(dá)水平表現(xiàn)出很強(qiáng)的相關(guān)性，可進(jìn)一步研究以確定是否存在調(diào)控關(guān)系。