復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)與胚胎停育患者染色體異常狀況分析

王蕾 王艷麗 張超楠 李樂瑤

（河南省人口和計劃生育科學(xué)技術(shù)研究院，國家衛(wèi)健委出生缺陷預(yù)防重點實驗室，河南人口缺陷干預(yù)技術(shù)研究重點實驗室，河南 鄭州 450002）

研究發(fā)現(xiàn)，因胚胎停育所引起的自然流產(chǎn)占妊娠總數(shù)10%~20%，對患者身心健康造成嚴(yán)重影響[1]。遺傳因素是導(dǎo)致自然流產(chǎn)主要原因之一，主要包括非整倍體、多倍體等染色體各種畸變，臨床尚無有效藥物解決遺傳因素，進(jìn)而導(dǎo)致患者出現(xiàn)反復(fù)流產(chǎn)及不孕不育等。以往臨床常通過傳統(tǒng)核型分析、熒光原位雜交（Fluorescence in site hybridization，F(xiàn)ISH）等技術(shù)對染色體異常進(jìn)行檢測，雖然具有一定檢測效果，但無法定位部分結(jié)構(gòu)異常的核型，且無法明確多余染色體來源，效果不理想[2]。多重連接依賴式探針擴(kuò)增技術(shù)（Multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）是一種新型生物學(xué)診斷技術(shù)，具有省時省力、成本低、檢出率高等優(yōu)點，可快速準(zhǔn)確檢測染色體非整倍體，彌補(bǔ)常規(guī)檢測不足[3]，然而目前臨床對其在自然流產(chǎn)中的研究并不多見。本研究通過MLPA技術(shù)分析復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)與胚胎停育患者染色體異常狀況，旨為臨床提供遺傳病病因資料。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用回顧性分析法，收集2018年6月至2019年10月本院不孕不育及優(yōu)生遺傳門診收治的300例復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)或胚胎停育患者臨床資料，患者年齡23~51歲，平均年齡32.13±3.06歲；體質(zhì)量45~74 kg，平均52.31±2.03 kg；孕周7-18 w，平均10.32±2.06 w；其中198例復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)，102例胚胎停育患者。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)

①所有患者均符合《婦產(chǎn)科學(xué)》[4]中復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)或胚胎停育的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②所有患者臨床資料及標(biāo)本資料均完整；③患者對本次研究資料采集及閱覽知情；④無精神疾病或認(rèn)知功能障礙者；⑤無嚴(yán)重母血污染或無結(jié)果的標(biāo)本。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)

①合并嚴(yán)重心、肝、腎等重要臟器病變者；②孕期合并感染性疾病或免疫系統(tǒng)疾?。虎酆喜⒆訉m肌瘤或者子宮畸形等子宮異常者；④合并惡性腫瘤者；⑤合并凝血功能障礙者。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

采用專用眼科剪以及鑷取患者絨毛組織，約1/3黃豆大小，以蒸餾水反復(fù)沖洗后，盡量剪碎臍帶等組織，加入1%樹脂Chelex-100溶液（美國伯樂公司）80 μl及蛋白酶K（賽默飛世爾科技有限公司）30 μl，震蕩5-10 min；沸水煮10 min，震蕩后冷凍并離心10 min。

選取上清液作為所取DNA。選取1 μl上清液用于核酸蛋白分析儀（型號：Thermo nana droP 2000，公司：自賽默飛世爾科技有限公司）的檢測（超過25 μg?μl-1）。

1.3.2 MLPA檢測法

將3 μl的DNA98℃變性處理10 min，降到室溫后，加入1.5 μl（0.75 μl探針混合液及0.75 μl緩沖液）探針混合液， 60℃靜置16-24 h，待聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀（型號：Bio-Rad DNA Engine，美國伯樂公司）降至54℃時，加入16 μl連接酶混合物。54℃溫浴20 min，并加熱5 min將連接酶滅活，加入PCR反應(yīng)液（3.75 μl H2O+1.0 μl PCR引物+0.25 μl DNA聚合酶）；分別于90℃、60℃中放置30 s，72℃中1 min，進(jìn)行34個循環(huán)。取3 μl的PCR產(chǎn)物及20 μl甲酰胺（由美國Promega公司提供），利用毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行分離，其結(jié)果對應(yīng)峰在0.7-1.3之間則拷貝數(shù)正常；雜合性缺失：0.3≤對應(yīng)峰≤0.7；雜合性重復(fù)：1.3≤對應(yīng)峰≤1.7。

2 結(jié)果

300例標(biāo)本中，染色體非整倍體異常有158份（52.67%）；三體及部分單體共133份，占所有染色體異常的84.18%。

異常比例前五位為：16三體36份（12.00%）；X0單體17份（5.67%）；22三體12份（4.00%）；13三體9份（3.00%）；21三體8份（2.67%）。性染色體中，三體4份（1.33%）（其中XXY或XYY共3份，XXX1份）。部分三體11份（3.67%），其中17染色體最多；部分單體9份（3.00%），以8及12染色體最多；同源染色體不平衡易位2份（0.67%），其中以(8p-，8q+)易位最常見（2份）；非同源染色體不平衡易位3份（1.00%）。

3 討論

自然流產(chǎn)及胚胎停育是婦科常見疾病，對育齡女性身心健康造成嚴(yán)重威脅。尋求妊娠失敗的原因，對提高患者下一次妊娠成功率具有重要意義。近年來流行病學(xué)研究顯示，胚胎停育及自然流產(chǎn)的發(fā)病率呈不斷上升趨勢，占早孕婦女10%-20%左右[5]。研究表示，胚胎停育及復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)病因較為復(fù)雜，其中染色體異常被臨床認(rèn)為是疾病發(fā)生的主要原因之一。國外相關(guān)研究表示，染色體非整倍體是造成人類胚胎低著床率及早期流產(chǎn)的重要原因[6]?？梢?，給予自然流產(chǎn)及胚胎停育患者進(jìn)行染色體檢查十分必要。

人體中共有22對常染色體及1對性染色體，且男女的性染色體不同，男性是由1個X性染色體及Y染色體組成，而女性則有2個X性染色體。本研究表1通過觀察300例標(biāo)本在23對染色體中異常染色體數(shù)目情況，以分析復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)與胚胎停育患者染色體異常狀況。既往研究表示，胚胎染色體異常是造成自然流產(chǎn)及胚胎停育主要原因，停止發(fā)育的胚胎染色體異常率達(dá)到50%-70%，其主要異常形式為染色體非整倍異常，占總數(shù)的80%以上，其次為染色體的結(jié)構(gòu)異常，這也與本研究結(jié)果相似[7]。以往臨床常通過傳統(tǒng)核型分析、FISH等技術(shù)對染色體異常進(jìn)行檢測，其中傳統(tǒng)核型分析是檢測染色體異常金標(biāo)準(zhǔn)，但其較為繁瑣，家屬要求高，普及難度大且對標(biāo)本要求高，對于胚胎停育患者，若胚胎死亡時間較長，容易導(dǎo)致培養(yǎng)失敗。FISH技術(shù)是針對未經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞檢測，對標(biāo)本研究較低，且操作相對簡單，可快速得到結(jié)果，但無法定位部分結(jié)構(gòu)異常的核型，效果不理想[8]。本研究通過MLPA技術(shù)檢測，可彌補(bǔ)以往常規(guī)方法不足，效果較好。研究表示，染色體數(shù)目異常中各種三體綜合征較多見，三體通常是母體減數(shù)分裂過程中，同源染色體不分離，導(dǎo)致子細(xì)胞中的染色體發(fā)生重復(fù)[9]。

本研究結(jié)果顯示，300例標(biāo)本中，染色體非整倍體異常有158份（52.67%），這已達(dá)到采用比較基因組雜交及下一代測序方法檢測流產(chǎn)絨毛的異常率。本研究中三體及部分單體共133份，占所有染色體異常的84.18%，其中16三體占12.00%，這與Saxena等[10]研究結(jié)論相似。此外，本研究中21、13、22三體染色體較為多見，19及17號染色體較少出現(xiàn)非整倍體異常，且1號染色體未發(fā)現(xiàn)非整倍體異常，提示染色體非整倍體異常常發(fā)生在16號染色體中，且部分缺失或者重復(fù)及不平衡易位均有可能發(fā)生，臨床應(yīng)重點關(guān)注。但本研究因納入樣本量有限，研究結(jié)果仍需臨床加大樣本量進(jìn)一步證實。

綜上所述，采用MLPA法檢測復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)與胚胎停育患者染色體，具有高效、快捷等優(yōu)點，染色體非整倍異常是導(dǎo)致復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)與胚胎停育的主要因素，其中16號染色體最為常見。