磁共振納米探針用于阿爾茨海默病的靶向成像診斷

章宏傳，翟建

（皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像中心，安徽蕪湖 241001）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD） 是一種由神經(jīng)元變性導(dǎo)致的認(rèn)知能力下降及行為障礙疾病，是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一，也是引起癡呆最主要的原因，占癡呆比例的50%～75%［1－2］。盡管有報告顯示高收入國家（歐洲和美國為主） 的AD 發(fā)病率下降，但預(yù)期壽命的總體增長導(dǎo)致全球患病率依然逐年增加［3］。目前，全世界范圍內(nèi)對于臨床診斷的AD 患者依然缺乏行之有效的治療方法，因此AD 的早期診斷與早期干預(yù)治療對于改善患者預(yù)后，延長患者生存期具有重要意義。神經(jīng)影像在AD 的早期診斷中發(fā)揮著越來越大的作用［4］。相比于昂貴的PET－CT 成像，磁共振成像（MRI） 技術(shù)憑借無創(chuàng)、無穿透深度限制、無電離輻射、空間分辨率高以及較強的成像靈敏度等優(yōu)勢在AD 的早期診斷中的價值越來越受到人們認(rèn)可［5］。近年來，納米技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用飛速發(fā)展。納米探針具有尺寸小、表面積大、易修飾、物理化學(xué)性質(zhì)獨特、生物相容性良好、能夠在血液循環(huán)系統(tǒng)中循環(huán)更長時間、有利于穿透血腦屏障 （blood brain barrier，BBB）、顯著增加探針在病灶區(qū)富集的特點。目前，科研工作者開發(fā)了一系列生物毒性低、靈敏度高的MRI 納米探針，并通過化學(xué)修飾策略實現(xiàn)納米探針對Aβ 多肽和磷酸化Tau 蛋白的高效靶向識別。納米探針介導(dǎo)的神經(jīng)影像技術(shù)相比于傳統(tǒng)AD 影像學(xué)手段具有更高的成像靈敏度和特異性，為AD 的早期診斷提供了有力的支持［6－7］。

1 穿過BBB

一般情況下，造影劑是靜脈注射的，這意味著從外周血液到大腦組織必須要經(jīng)過BBB。在AD患者受累腦區(qū)中，由淀粉樣沉積物包圍的血管有缺陷，因此該腦區(qū)的BBB 對內(nèi)源性蛋白具有更高的滲透性［8］。血管性癡呆可影響B(tài)BB 通透性，并且越來越多的證據(jù)表明AD 和BBB 缺陷一起發(fā)生。但是，基于AD 動物模型的不同研究表明BBB 的開放程度具有很大的差異性。因此，成功穿過BBB 依然是AD 早期診斷中的重要前提［9］。在過去的十幾年里，人們基于BBB 和納米探針的特點，開發(fā)了諸多通過BBB 的策略和技術(shù)，并通過一系列動物模型或臨床研究證實了這些策略的可行性。

1.1 經(jīng)鼻給藥繞過BBB 經(jīng)鼻給藥是一種吸收快、起效快、無損傷、非侵入性且易于操作的給藥方式［10］。探針可以經(jīng)嗅黏膜沿著嗅神經(jīng)束或嗅神經(jīng)元軸突周圍的結(jié)締組織進入腦脊液或腦組織，從而繞開BBB 進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。但是由于人類嗅黏膜的表面積只占嗅區(qū)的5%，因此通過單純的鼻內(nèi)給藥進入腦組織的探針濃度有時難以滿足AD早期特異性診斷的要求。

1.2 侵入性方式通過BBB 破壞BBB 是一種可以直接促進外周循環(huán)中的藥物進入腦實質(zhì)的有效方法，破壞的方法主要包括滲透破壞、超聲破壞以及電磁脈沖破壞。甘露醇可以使BBB 的血管內(nèi)皮細(xì)胞脫水、皺縮并破壞緊密連接，從而可以用于暫時性地打開BBB，但是打開的效率受許多因素影響，比如甘露醇的濃度、給藥速度和時間以及注射后的體內(nèi)滯留時間等［11］。同時，甘露醇可能帶來嚴(yán)重的副作用，如腎功能衰竭、心力衰竭、電解質(zhì)紊亂以及血容量不足等。微泡在聚焦超聲作用刺激下產(chǎn)生的空化效應(yīng)是無創(chuàng)打開BBB 的另一種有效方式［12］。這種方式不僅高效，而且可以配合聚焦超聲焦點位置的改變實現(xiàn)特定部位BBB的打開，同時這種開放效應(yīng)是可恢復(fù)的。此外，人們發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)電磁脈沖的場強和脈沖次數(shù)也能實現(xiàn)BBB 的可逆打開［13］。破壞的BBB 保證了更多探針進入腦實質(zhì)，以滿足AD 的特異性成像診斷需求。但是，這種方法也讓外周血液中的其他物質(zhì)（大量水分子、蛋白等） 進入腦組織，從而引起各種副作用，因此在實際應(yīng)用中應(yīng)謹(jǐn)慎使用侵入性方式通過BBB。

1.3 被動靶向通過BBB 在AD 等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)展過程中，正常的BBB 結(jié)構(gòu)會受到不同程度的破壞［9］。因此，具有較長循環(huán)時間，脂溶性且粒徑在10～100 nm 范圍內(nèi)的納米探針能夠相對容易地在發(fā)病部位聚集，但是納米探針通過該途徑在病灶富集的效率相對較低，同時對探針自身的理化性能提出了苛刻要求，增加了探針合成的難度［8］。

1.4 受體介導(dǎo)通過BBB 受體介導(dǎo)胞吞（receptor－mediated transcytosis，RMT） 是內(nèi)源性大分子（如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白等） 通過BBB 的一種重要途徑［14］。在BBB 血管內(nèi)皮細(xì)胞表面會高表達一些受體分子，當(dāng)特異性配體與受體分子結(jié)合之后，能誘導(dǎo)胞膜內(nèi)吞，從而可以將大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)運進入細(xì)胞內(nèi)。用納米探針修飾靶向配體分子或受體分子特異性抗體，能夠明顯增加探針穿過BBB 的效率。常用的配體（靶向其對應(yīng)的受體） 包括轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、載脂蛋白E （ApoE）、乳鐵蛋白、白蛋白等［15］。此外，還有一類特殊的配體—細(xì)胞穿膜多肽 （cell penetrating peptides，CPPs）也被經(jīng)常用來輔助藥物分子通過BBB。CPPs 是由基本氨基酸（一般不超過30 個） 構(gòu)成的具有細(xì)胞穿透能力的短肽，不僅可以將小分子物質(zhì)運輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)，還能遞送大分子（如蛋白、質(zhì)粒、小干擾RNA、納米粒子、核酸、脂質(zhì)體等） 進入細(xì)胞。CPPs 的工作機制并不是十分清楚，目前認(rèn)為這些多肽的穿膜效應(yīng)主要是由膜蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞或大胞飲形成的［16］。

1.5 其他通過BBB 的方法 親脂性小分子（分子量小于500 Da） 可以直接擴散通過BBB。吐溫80（一種表面活性劑） 可以增強BBB 血管內(nèi)皮細(xì)胞膜脂類的流動性，導(dǎo)致細(xì)胞膜液化［17］。因此采用吐溫80 運載藥物可以增加藥物的BBB 滲透性。BBB 內(nèi)皮細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)運載體（如氨基酸轉(zhuǎn)運體、葡萄糖轉(zhuǎn)運體） 也可以協(xié)助納米探針進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)［18］。某些病毒（如狂犬病毒） 具有天然的嗜神經(jīng)特性，因此可以構(gòu)建模擬病毒的納米粒子用于穿透BBB 的中樞系統(tǒng)疾病診療［19］。腺苷受體激動劑可以刺激BBB 內(nèi)皮細(xì)胞表面的腺苷受體從而松弛內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接實現(xiàn)BBB 的可逆性打開［20］。此外，內(nèi)源性的炎性細(xì)胞具有天然的跨越BBB 的能力，可以將此類細(xì)胞作為載體，用于攜帶診斷或治療分子進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)［21］。

2 靶向淀粉樣斑塊

淀粉樣斑塊是AD 探針的天然靶標(biāo)，可用于AD 的早期MRI 診斷。目前，至少有3 種可以特異性結(jié)合淀粉樣斑塊的靶向分子，即抗體、多肽（淀粉樣多肽或非淀粉樣多肽） 和小分子。

2.1 抗體靶向 研究表明修飾了抗Aβ 抗體的超順磁性氧化鐵納米顆粒（SPIONs） 在沒有其他手段的幫助下能夠成功通過BBB。APP／PS1 轉(zhuǎn)基因AD 模型小鼠的測試結(jié)果表明，Aβ 抗體功能化的SPIONs 能夠結(jié)合Aβ 斑塊并增強MRI 檢測效果。與常規(guī)MRI 平掃檢查相比，在功能化SPIONs 介導(dǎo)的MRI 掃描中發(fā)現(xiàn)AD 模型小鼠腦區(qū)淀粉樣沉積物數(shù)量增加了2 倍［22］。Viola 等［23］認(rèn)為Aβ 低聚物相比于淀粉樣斑塊和Aβ 多肽與AD 的進展關(guān)系更為密切，他們將靶向Aβ 低聚物的抗體修飾在磁性納米顆粒的表面，然后通過鼻內(nèi)給藥的方式，成功在轉(zhuǎn)基因AD 小鼠實現(xiàn)了基于腦部Aβ 低聚物的AD 早期特異性MRI 診斷。中空氧化錳造影劑（hollow manganese oxide nanoparticles，HMON） 整合了錳的順磁性（Mn3O4） 和高比表面積特性，通過鏈霉親和素修飾的HMON 實際上可以結(jié)合各種生物素?；墓δ芊肿樱摬呗砸脖挥糜跈z測淀粉樣斑塊［24］。將抗Aβ 抗體功能化修飾的HMON 注入APP／PS1 轉(zhuǎn)基因AD 小鼠腦脊液中，實現(xiàn)了淀粉樣沉積物的精確MRI 檢測。

2.2 Aβ 多肽靶向 淀粉樣斑塊的形成源于Aβ 多肽強烈的自聚集傾向。利用 “游離” Aβ 多肽（Aβ1－40） 對現(xiàn)有斑塊的高親和力，可以成功實現(xiàn)含釓（Gd） 元素復(fù)合物對斑塊進行在體MRI 靶向檢測［25］。然而，在這種情況下，探針的BBB 滲透只能通過與甘露醇溶液共注射來實現(xiàn)，產(chǎn)生的副作用會阻礙其臨床應(yīng)用。Aβ1－40 的毒性也逐漸受到人們重視，因此最近的關(guān)注點開始轉(zhuǎn)向在N－末端添加了6 個賴氨酸殘基的Aβ1－30 多肽。這種K6Aβ1－30 多肽是無毒非纖維性多肽，同時保留了兩個主要抗原位點，它被成功結(jié)合到含Gd 復(fù)合物，在7T 場強下實現(xiàn)了淀粉樣斑塊的靶向MRI 檢測，但需要共注射甘露醇以利于穿過BBB［26］。

按照類似的策略，將Aβ1－40 多肽吸附到葡聚糖包被的單晶氧化鐵納米顆粒（MION） 上。Aβ1－40 功能化的MION 對Aβ1－42 多肽（KD＝ 202 nM） 表現(xiàn)出與游離Aβ1－40 （KD＝266 nM） 相似的親和力［25］。對APP／PS1 轉(zhuǎn)基因AD 小鼠進行靜脈注射Aβ1－40 功能化的MION，可以通過MRI 檢測到探針對淀粉樣斑塊的特異性靶向，而非功能化的MION 沒有被檢測到。用Aβ1－42 修飾的SPION也能觀察到類似的結(jié)果。Wadghiri 等［27］報道了用Aβ1－42 多肽功能化的超小SPIONs （USPIONs） 的合成，并用聚乙二醇（PEG） 進一步修飾以增加通過BBB 效率。將USPIONs－PEG－Aβ1－42靜脈注射到轉(zhuǎn)基因AD 小鼠（APP／PS1），在沒有甘露醇共注射的情況下，可以通過MRI 清晰觀察到淀粉樣斑塊。

2.3 小分子靶向 一些有機小分子具有天然結(jié)合淀粉樣斑塊的能力。Skeby 等［28］研究過多種化合物與淀粉樣纖維模型的結(jié)合模式，許多化合物都是衍生自可以使淀粉樣斑塊特異性染色的剛果紅或硫磺素T。它們都表現(xiàn)出剛性以及芳香族結(jié)構(gòu)，其他具有苯乙烯基或氨基－萘基的化合物也能夠與淀粉樣纖維結(jié)合，并分別進行了MRI 成像研究。匹茲堡化合物B （PiB） 是硫磺素T 衍生物，其對淀粉樣斑塊的親和力已經(jīng)被人們充分認(rèn)可。PiB 是研究最多的用于檢測淀粉樣斑塊的配體，在很多臨床試驗中被用來檢測淀粉樣斑塊［29］?；贕d－DOTA單酰胺螯合物的造影劑連接了PiB，并進行了水溶液MRI 測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)T1 弛豫率比常規(guī)臨床造影劑高約50%［30］。據(jù)報道，DDNP （一種二苯丙酮衍生物） 可以通過結(jié)合淀粉樣纖維中的β－結(jié)構(gòu)域而對淀粉樣斑塊表現(xiàn)出良好的親和力。通過配體交換將DDNP 結(jié)合到SPION 表面，該探針具有高弛豫率，并且在體外顯示出與Aβ1－40纖維顯著的結(jié)合力。DDNP 磁性納米顆粒在AD 大鼠模型中也能順利通過MRI 檢測到淀粉樣斑塊［31］。

姜黃素是一種無毒的黃色色素，不僅能天然結(jié)合淀粉樣斑塊，還能破壞淀粉樣蛋白聚集，并穿過BBB。與前面提到的化合物類似，姜黃素是一種具有兩個酚環(huán)的剛性芳香族分子［32］。雖然一些臨床試驗表明姜黃素具有治療癡呆的潛能，但實際的治療效果仍然需要深入考察。Gd－DTPA 或Gd－DOTA 與姜黃素的功能化探針可以通過MRI 檢測到離體小鼠和人腦組織中的淀粉樣斑塊［33］。Cheng 等［34］的研究中，姜黃素與PEG 一起被吸附到磁性納米顆粒（Cur－MNPs） 上，然后通過聚乙二醇－聚乳酸 （PEG－PLA） 和聚乙烯吡咯烷酮（PVP） 穩(wěn)定顆粒。姜黃素分子主要通過氫鍵吸附到氧化鐵上，并且在轉(zhuǎn)基因AD 小鼠測試中發(fā)現(xiàn)納米顆粒（平均粒徑小于100 nm） 能夠穿過BBB，離體組織也能在MRI 中明顯發(fā)現(xiàn)沉積的淀粉樣斑塊。

據(jù)報道，碳水化合物分子如唾液酸也與淀粉樣斑塊特異性結(jié)合。唾液酸是存在于細(xì)胞膜中的神經(jīng)節(jié)苷脂GM1 中發(fā)現(xiàn)的單糖，GM1 與Aβ 相互作用可能與該疾病的發(fā)病有關(guān)。唾液酸修飾的SPION 能夠在體外和離體小鼠腦中特異性結(jié)合Aβ多肽［35］。

3 靶向Tau 蛋白

近年來，由于一系列Aβ 靶向藥物的臨床試驗以失敗告終，磷酸化Tau 蛋白作為AD 另一種重要的病理改變越來越受到人們關(guān)注［36－37］。浙江大學(xué)凌代舜［38］及其合作者開發(fā)了一種Tau 蛋白靶向的多功能納米組裝藥物，用于AD 的成像診斷與治療。凌代舜的研究團隊首先將具有清除活性氧（ROS） 功能的超小氧化鈰納米顆粒和具有MRI 增強作用的超小氧化鐵納米顆粒修飾在介孔氧化硅的表面，接著修飾能夠靶向識別Tau 蛋白的放射性核素標(biāo)記配體68Ga－NOTA－T807，同時利用介孔氧化硅納米粒子較大的孔洞體積負(fù)載具有抑制Tau聚集作用的藥物亞甲藍，從而設(shè)計出一種集靶向、成像與治療于一體的多功能納米組裝藥物。該納米組裝藥物能有效結(jié)合神經(jīng)元中過度磷酸化的Tau蛋白，并通過MRI／PET 雙模態(tài)成像有效實現(xiàn)腦部定位。與此同時，超小氧化鈰納米顆?？砂l(fā)揮納米酶功能自動清除ROS，與負(fù)載的亞甲藍協(xié)同抑制Tau 蛋白的過度磷酸化和磷酸化Tau 蛋白的聚集。體外及體內(nèi)實驗均證明，該復(fù)合多靶點治療策略具有較好的協(xié)同治療效果，能有效抑制神經(jīng)元的凋亡，保持神經(jīng)元的活性。

4 靶向其他

AD 腦區(qū)具有特殊的氧化還原微環(huán)境，在這樣的環(huán)境中，金屬離子會自動發(fā)生生物合成反應(yīng)［39］。Lai 等［40］通過給予AD 模型小鼠葡萄糖酸鋅和FeCl2，利用AD 腦區(qū)的特殊微環(huán)境，原位合成了氧化鋅和氧化鐵納米晶體，同時分別實現(xiàn)了AD 的熒光和磁共振雙模態(tài)成像診斷。此外，Chen 等［41］構(gòu)建了一種經(jīng)鼻多功能納米遞送體系，該體系主要由氯毒素B 亞基（靶向海馬區(qū)域神經(jīng)元內(nèi)的單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GM1）、Gd 螯合物（MRI 成像）以及Cy5.5 （模型藥物，可用于熒光成像） 組成。經(jīng)鼻遞送該納米體系可有效避開BBB，同時利用Gd 螯合物的MRI 成像監(jiān)控能力，最終成功將Cy5.5 遞送到海馬腦區(qū)，為AD 的成像診斷與治療提供了新的思路。

5 小結(jié)

MRI 準(zhǔn)確診斷AD 的能力在很大程度上取決于造影劑的性能，因此不斷提升納米探針的成像靈敏度、特異性以及BBB 穿透效率依然是未來研究的重點。而探針的生物毒性會直接限制探針的臨床轉(zhuǎn)化，故采用生物友好的原料，經(jīng)過相對簡單的合成步驟得到高生物安全性的納米探針也是不能忽視的方面。此外，整合成像與治療的診療一體化納米探針將會受到更多重視，將為AD 的整體管理提供創(chuàng)新的解決方案。總之，我們期待更多性能優(yōu)良、安全低毒、功能豐富的AD 靶向納米探針被開發(fā)，同時期待此類探針的臨床轉(zhuǎn)化發(fā)生質(zhì)的改變。