創(chuàng)傷性脊髓損傷后Notch 信號對相關(guān)神經(jīng)細(xì)胞的調(diào)控作用

張勇，譚龍旺，朱偉，楊藝，喬旭

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 西安；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 西安)

0 引言

創(chuàng)傷性脊髓損傷(traumatic spinal cord injury，TSCI)是指脊髓組織受到外來暴力后出現(xiàn)的一系列以脊髓實質(zhì)被破壞、功能被抑制的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)性疾病，其主要表現(xiàn)為受損節(jié)段平面以下肢體感覺、運動及反射出現(xiàn)障礙[1]。TSCI 的不可逆性以及其極高的致殘率，長期以來給家庭、社會乃至國家造成了沉重的負(fù)擔(dān)。TSCI 發(fā)生后，小膠質(zhì)細(xì)胞可活化為M1、M2 兩種不同的細(xì)胞類型，其分別起著促炎、氧化和抗炎、修復(fù)的作用[2]。M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的炎癥因子、氧化產(chǎn)物可再次引起周圍健康神經(jīng)組織的壞死，炎癥因子最終引起星形膠質(zhì)細(xì)胞向A1 型活化，產(chǎn)生膠質(zhì)瘢痕。膠質(zhì)瘢痕因其組織的致密性可阻止各種理化因子的擴散，保護(hù)未受損的神經(jīng)細(xì)胞，但恰恰也是這些致密的纖維組織阻礙了脊髓神經(jīng)元的重新連接，這使得后期使用神經(jīng)干細(xì)胞移植來修復(fù)脊髓往往很難達(dá)到理想的效果。隨著醫(yī)學(xué)研究的深入，TSCI 發(fā)生后相關(guān)信號通路的調(diào)控機制開始越來越被人們重視。通過文獻(xiàn)索引發(fā)現(xiàn)[2-7]，TSCI 發(fā)生后抑制Notch 信號通路可引起小膠質(zhì)細(xì)胞偏向M2 型活化，并間接減少了A1 反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的產(chǎn)生、同時也可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞，這為TSCI 的治療提供了新的思路。

1 Notch 信號通路概述

1.1 組成

Notch 信號通路在哺乳動物中由4 種受體(Notch1-4)和5 種配體(DLL1-4，Serrate 樣配體Jagged1-2)以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(RBP-Jκ)和下游靶基因組成[5,6,8,9]。

Notch 受體中Notch1 受體在細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包含36 個EGF 重復(fù)，而Notch2 包含35 個，Notch3 包含34 個，Notch4包含29 個。Notch 受體是由兩條非共價相關(guān)的多肽鏈形成的單程跨膜蛋白，包括胞外域、跨膜域和胞內(nèi)域3 個部分[8]。

Notch 配體是一種保守的I型跨膜蛋白，因為在果蠅和線 蟲 中 叫 做Delta、Serrate 和Lag-2，Notch 配 體 也 被 稱 為DSL(Delta/Serrate/Lag-2)蛋白[5,9]。

轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子是一組DNA 結(jié)合蛋白，在哺乳動物、果蠅和線蟲中分別被叫做：CBF-1、Su(H)、Lag-1，被稱為CSL{CBF-1/Su(H)/Lag-1}蛋白[6]。

下游靶基因主要由bHLH 轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員組成，分為抑制型基因和原神經(jīng)基因兩類，其中原神經(jīng)基因包括神經(jīng)分化發(fā)育相關(guān)基因Mash-1、Math、Ngn1、2、NeuroD、Olig基因(Olig1、Olig2 和Olig3)[10-14]；抑制型以HES-1、HES-3 和HES-5 及HES 相關(guān)蛋白基因(HERP)[15]，以及具有促炎效應(yīng)的NF-κB(nuclear transcription factor)[16]。有研究證實抑制型bHLH 基因表達(dá)抑制原神經(jīng)基因[17]。

1.2 作用機制

Notch 信號通路的激活方式有兩種，分別為CSL 依賴信號途徑和CSL 非依賴信號途徑。

CSL 依賴信號途徑是經(jīng)典的Notch 信號途徑，在Notch 受體與配體相結(jié)合后，腫瘤壞死因子-α 轉(zhuǎn)換酶(tumor necrosis factor-α converting enzyme，TACE) 被 激 活，將 受 體 切 割為2 個片段，N 端裂解產(chǎn)物在胞外區(qū)被配體表達(dá)細(xì)胞內(nèi)吞，而C 端裂解產(chǎn)物( 跨膜區(qū)) 在γ- 分泌酶剪切下，釋放出具有核定位信號NICD(Notch 蛋白的活化形式)，隨后NICD 轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，與轉(zhuǎn)錄抑制因子RBP-Jκ 結(jié)合成為(NICD/RBPJκ) 復(fù)合體，招募核轉(zhuǎn)錄激活蛋白家族MAML(mastermindlike) 組成(NICD/RBP-Jκ/MAML) 共激活復(fù)合體，調(diào)節(jié)下游靶基因(HES-1、HES-3 和HES-5 等)，通過靶基因的表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞的功能[18,19]。在沒有NICD 的情況下(Notch 受體與配體未結(jié)合)，RBP-Jκ 則招募阻遏復(fù)合物蛋白(SHARP)形成(RBP-Jκ/SHARP) 抑制復(fù)合物抑制Notch 下游基因的轉(zhuǎn)錄[20]。

CSL 非依賴信號途徑直接通過下游基因Deltex 調(diào)控Notch 信號的表達(dá)。其方式為Notch 受體胞內(nèi)區(qū)上的ANK 重復(fù)結(jié)構(gòu)與鋅指蛋白Deltex 結(jié)合，信號激活后直接與Grb2 作用，介導(dǎo)Ras-JNK 信號途徑[21]。

2 小膠質(zhì)細(xì)胞的活化

小膠質(zhì)細(xì)胞起源于骨髓造血干細(xì)胞，后分化為單核巨噬細(xì)胞，通過血液循環(huán)廣泛存在于大腦、脊髓等神經(jīng)系統(tǒng)中，也有人認(rèn)為早在在胚胎期和胎兒期小膠質(zhì)祖細(xì)胞就通過血管外途徑定植于神經(jīng)系統(tǒng)。作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常駐免疫細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞可以通過吞噬微生物來保護(hù)大腦免受感染，也正是它們在生理條件下識別、吞噬和消化凋亡神經(jīng)元的能力，使其在神經(jīng)系統(tǒng)的形成和完整性中發(fā)揮至關(guān)重要作用[22,23]。研究表明[16,24]Notch 信號通路相關(guān)蛋白同樣可在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，在TSCI 發(fā)生后，缺氧條件激活了Notch 信號通路，其下游中具有促炎效應(yīng)的NF-κB 基因(抑制型bHLH 基因)在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了表達(dá)，小膠質(zhì)細(xì)胞向M1 型活化，M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞的活化則可能由其他通路誘導(dǎo)?；罨蟮腗1 型小膠質(zhì)細(xì)胞可以產(chǎn)生一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)，NO 可與ROS 反應(yīng)產(chǎn)生多種活性氮類攻擊細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸引起脂質(zhì)的過氧化，這反應(yīng)產(chǎn)生了兩種影響：一方面，細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化造成 DNA 分解和線粒體呼吸功能障礙，最終引起局部細(xì)胞的衰退[25,26]。另一方面，細(xì)胞膜Na+-K+泵被破壞，破壞細(xì)胞滲透平衡，引起細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)紊亂，Ca+內(nèi)流，最終引起細(xì)胞壞死和凋亡[27-29]。此外，NO 還參與了脫髓鞘改變[30]。M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞同時還參與了炎癥反應(yīng)，它們分泌IL-12、IL-6、白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、γ-干擾素(TNF-γ)等大量促炎細(xì)胞因子對神經(jīng)、血管產(chǎn)生毒性作用，進(jìn)一步加重脊髓的損傷。M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞則具有抗炎和修復(fù)的作用，其主要通過誘導(dǎo)清除劑受體和基質(zhì)降解酶來減少氧化反應(yīng)和炎癥的發(fā)生，并且清除劑受體和基質(zhì)降解酶也可增強其吞噬能力。與M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞相比M2 更具有血管生成潛力，M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞可產(chǎn)生血小板衍生生長因子(pdgf)、血管內(nèi)皮生長因子(vegf)和成纖維細(xì)胞生長因子(fgf)來促進(jìn)血管生成。在脊髓損傷后7d，以M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞活化占主導(dǎo)，反應(yīng)達(dá)到峰值，28d 后M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞活化為主導(dǎo)達(dá)到第二個峰值[28,31]。這說明了TSCI 中M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞在損傷后期占主導(dǎo)地位，M2 型在損傷前期占主導(dǎo)作用[2,32,33]。

種莉[24]等發(fā)現(xiàn)在靜息條件下小膠質(zhì)細(xì)胞不具有釋放炎性介質(zhì)及氧自由基等毒害因子的作用，而通過缺氧誘導(dǎo)后的小膠質(zhì)細(xì)胞會迅速發(fā)生活化，大量分泌分泌IL-6、白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等產(chǎn)物，且活化后的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Notch1 胞內(nèi)段N1ICD、Hes1、Hey1 表達(dá)明顯升高，更有趣的是在實驗中通過DAPT(γ-分泌酶抑制劑)阻斷NICD，抑制Notch 通路后，小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)N1ICD、Hes1、Hey1 表達(dá)降低的同時細(xì)胞上清液中IL-6、IL-1β、TNF-α 的分泌水平也降低。在同樣的方式下Wu[34]等用DAPT(γ-分泌酶抑制劑)阻斷Notch 途徑時，發(fā)現(xiàn)M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平降低，M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)水平升高。這表明通過阻斷NICD 的方式來抑制Notch 信號通路，可使得小膠質(zhì)細(xì)胞的活化更偏向于M2 型。

3 Notch 信號通路對星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用

星形膠質(zhì)細(xì)胞是腦、脊髓等中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的重要組成部分，在傳統(tǒng)上被認(rèn)為是穩(wěn)定和營養(yǎng)神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞，它們具有攝取和釋放興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的能力，參與了突觸的傳遞。作為神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)支持，星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠調(diào)節(jié)腦血流并釋放S100B 和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)以達(dá)到營養(yǎng)神經(jīng)元的目的[34-36]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞還具有刺激神經(jīng)元突觸的生成的能力，并在神經(jīng)發(fā)育過程中促進(jìn)突觸的密度，更有意思的是星形膠質(zhì)細(xì)胞靠吞噬作用來修剪突觸[37,38]。

在TSCI 發(fā)生后星形膠質(zhì)細(xì)胞會產(chǎn)生A1 型和A2 型兩種活化，其中A1 反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞由M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞所分泌得炎癥因子引起[38]。A2 反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞由缺血環(huán)境誘導(dǎo)生成，它能夠上調(diào)了許多神經(jīng)營養(yǎng)因子，可促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的恢復(fù)。星形膠質(zhì)細(xì)胞A1 型活化后失去了營養(yǎng)神經(jīng)元、促進(jìn)突觸生長、吞噬突觸和髓鞘碎片的能力，相反它會產(chǎn)生一種有毒物質(zhì)，迅速殺死神經(jīng)元和成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞，在急性中樞神經(jīng)損傷中，軸突斷裂后導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡的不是并因為營養(yǎng)缺乏，而是A1 反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞毒素的釋放，但這種可溶性毒素唯獨對神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞具有毒害性，對其他類型的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞卻沒有作用[38]。通過抗炎性細(xì)胞因子TGFβ 處理后，A1 反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，但對于體內(nèi)是否還有別的信號介導(dǎo)生成A1 反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，目前還不得而知[38]。但明確的是降低M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞的水平或者抑制炎性反應(yīng)可減少A1 反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄[39]，從前文中可知抑制Notch 信號通路可以制止小膠質(zhì)細(xì)胞向M1 型活化，也意味著抑制Notch信號通路可間接性抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞向A1 型的活化。損傷后的膠質(zhì)反應(yīng)導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞前體和星形膠質(zhì)細(xì)胞向損傷部位聚集，許多受損區(qū)域的星形細(xì)胞往往會變得肥大，并釋放抑制性細(xì)胞外基質(zhì)分子硫酸軟骨素蛋白聚糖(CSPGS)，共同形成了膠質(zhì)瘢痕，抑制了神經(jīng)元突觸的生長，且CSPGS 本身具有抑制損傷后神經(jīng)再生的能力[40,41]。孫嘉鍇[39]等發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后運用弱激光治療(low level laser therapy，LLLT)可下調(diào)M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞活化，減輕炎癥反應(yīng)，同時也抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，降低硫酸軟骨素蛋白多糖(Chondroitinsulfate proteoglycans，CSPGS)的表達(dá)，且膠質(zhì)瘢痕組織明顯減少，證明膠質(zhì)瘢痕和炎癥反應(yīng)具有相關(guān)性。也側(cè)面證明了通過抑制Notch 信號通路來下調(diào)M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞活化同樣可以抑制膠質(zhì)瘢痕的產(chǎn)生。高楓[42]等發(fā)現(xiàn)姜黃素可下調(diào)Notch 信號通路中Notch1 和Hes1 表達(dá)水平，抑制了脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，與此同時炎癥因子IL-6 和TNF-α含量也發(fā)生了減少。

綜上脊髓損傷的早期通過抑制Notch 信號通路，可抑制炎性反應(yīng)、減少星形膠質(zhì)細(xì)胞的死亡，同時可以抑制A1 反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的產(chǎn)生，減少毒素的生成和膠質(zhì)瘢痕的產(chǎn)生。

4 Notch 信號通路對NSCs 的增殖與分化

TSCI 發(fā)生后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)會發(fā)生增殖分化為不同的亞型，如神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，它們共同參與神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復(fù)，但在哺乳動物體內(nèi)這種分化方式必須經(jīng)分子水平調(diào)控才能實現(xiàn)[43]，而Notch 信號通路同樣參與了這一過程[44]。Notch 信號通路下游靶基因多為bHLH 轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員，分為抑制型基因和原神經(jīng)基因兩種，抑制型基因包括：HES-1、HES-3 和 HES-5 及 HES相關(guān)蛋白基因，抑制型基因表達(dá)時NSCs 會發(fā)生增殖同時具有向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的能力[45-47]；原神經(jīng)基因包括：Mash-1、Math、Ngn1、2、Neuro D、Olig1、Olig2[5,6,9,48,49]，其中Mash-1、Math、Ngn1、2、Neuro D 的表達(dá)引起NSCs 向神經(jīng)元分化，Olig1、Olig2 的表達(dá)可以促進(jìn)NSCs 向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，且抑制型基因表達(dá)時可對原神經(jīng)基因產(chǎn)生抑制作用[5-7,17]。在上文中我們知道抑制型基因的表達(dá)由NICD/RBP-Jκ/MAML共激活復(fù)合體來調(diào)節(jié)，因此當(dāng)DAPT 作用于NSCs 后，NICD的產(chǎn)生受到限制，Notch 信號通路被抑制，抑制基因表達(dá)受限，原神經(jīng)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，NSCs 會分化為神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞同時抑制了NSCs 的增殖和分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞的能力[50-54]。

Notch 信號通路并不是一直可以影響到NSCs 的增殖分化，在正常脊髓內(nèi)環(huán)境中有一種額外的機制使Notch 信號保持靜止，如：對正常斑馬魚脊髓中阻斷NICD 來源5d 后，未見髓內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量發(fā)生變化。這可能與Notch 信號通路本身特性有關(guān)，在沒有損傷或臨近細(xì)胞凋亡的情況下，Notch 就不會引起細(xì)胞的分化與增殖，這可能是Notch 信號通路的第三項選擇[55,56]。

5 小結(jié)

通過上文我們發(fā)現(xiàn)：抑制Notch 信號通路可降低M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞的活化水平，相反可以促進(jìn)M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞的生成；M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞生成障礙可阻止星形膠質(zhì)細(xì)胞的A1 型活化和膠質(zhì)瘢痕的生成；Notch 信號通路受到抑制，NSCs 將會向神經(jīng)元即少突膠質(zhì)細(xì)胞分化；激活Notch 信號通路時，NSCs 增殖同時向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化。

因此在脊髓損傷的急性期可通過抑制Notch 信號通路來減輕炎癥反應(yīng)以保護(hù)血管、神經(jīng)，抑制膠質(zhì)瘢痕生成，為神經(jīng)元軸突的連接創(chuàng)造條件。對于橫斷性的脊髓損傷可在受損區(qū)域移植NSCs 并通過抑制Notch 信號通路的方式誘導(dǎo)NSCs分化為神經(jīng)元及少突膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生。

慢性期：主要是激活Notch 信號通路為內(nèi)源性NSCs 的增殖，星形膠質(zhì)細(xì)胞的生成提供條件。

目前不足的是，脊髓損傷后對脊髓水腫的消除還缺少Notch 通路的研究，脊髓損傷后除了小膠質(zhì)細(xì)胞，還有中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞參與機體炎性反應(yīng)[57]，對Notch 信號通路限制炎癥反應(yīng)的研究只是局限于小膠質(zhì)細(xì)胞領(lǐng)域，更多關(guān)于Notch信號通路對脊髓損傷的作用及機制還待進(jìn)一步研究。