Foxp3+Treg、Tim-3和CTLA-4水平與T1DM患者病情發(fā)生發(fā)展的關(guān)系

王智峰,李秋梅,姜 嘯,徐心悅

(大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院內(nèi)分泌科，遼寧大連 116021)

糖尿病是臨床常見的慢性疾病，其主要是由于機體胰島素分泌不足或機體存在胰島素抵抗而導(dǎo)致的代謝紊亂[1]。糖尿病又分為1型和2型，其中1型糖尿病(T1DM)多受遺傳易感基因影響，其發(fā)病機制主要是自身抗原特異性、致病性T淋巴細胞攻擊胰島導(dǎo)致β細胞損傷而無法分泌胰島素[2]。T1DM的臨床癥狀主要為多飲、多食和消瘦，早期難以預(yù)測及診斷，當患者就診時，血糖已經(jīng)明顯高于正常水平，胰島β細胞受損嚴重，患者難以治愈，且需要長期給予胰島素進行治療[3]。因此，尋求特異性指標對疾病的診斷及治療靶點的選擇具有重要意義。CD4+、CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(Treg)是機體重要的免疫調(diào)節(jié)T淋巴細胞，參與機體調(diào)控免疫應(yīng)答及維持免疫自穩(wěn)[4-5]。近年來有研究指出，Treg抑制功能低下及數(shù)量的降低和T1DM的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6]。人轉(zhuǎn)錄因子Foxp3是Treg分化及生長的主要基因；細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原 4(CTLA-4)是Treg表面代表性的免疫表型[7]。T淋巴細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(Tim-3)是一種新發(fā)現(xiàn)的與糖尿病進展相關(guān)的蛋白分子[8]。本研究以本院收治的T1DM患者和健康者為研究對象，比較患者Foxp3+Treg、Tim-3和CTLA-4水平與健康者之間的差異，從而探討這3種指標與T1DM患者病情發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，旨在為T1DM的早期診斷及治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 經(jīng)倫理委員會審議并批準，將本院2017年1月至2019年7月收治的80例符合納入及排除標準的T1DM患者作為觀察組，并選取同期行正常體檢的80例體檢健康者作為對照組。觀察組中，男45例，女35例；年齡23.5～63.2歲，平均(42.6±10.2)歲。對照組中，男42例，女38例；年齡22.8～65.3歲，平均(43.2±10.6)歲；兩組受試者基線資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2納入標準 (1)患者符合世界衛(wèi)生組織糖尿病診斷標準[9]；(2)患者體內(nèi)胰島素自身抗體、鋅轉(zhuǎn)運體8抗體、谷氨酸脫羧酶抗體、蛋白酪氨酸磷酸酶抗體至少一項為陽性；(3)患者確診后一直采用胰島素替代治療；(4)發(fā)病時患者空腹C肽<300 pmol/L；(5)受試者均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.3排除標準 (1)合并嚴重糖尿病并發(fā)癥；(2)合并心腦血管疾?。?3)合并心肝腎功能不全；(4)入組前3個月存在急性疾病、創(chuàng)傷或嚴重感染；(5)主動申請退出本研究。

1.4方法 在所有受試者入組后采集空腹靜脈血3 mL兩管，一管使用梯度密度離心法分離收集外周血中單個核細胞，后采用流式細胞術(shù)法檢測外周血中Foxp3+Treg水平。另一管使用Trizol試劑盒提取總RNA，后采用PCR法檢測其中Tim-3、CTLA-4 及β-actin mRNA水平，以Tim-3/β-actin及CTLA-4/β-actin分別表示Tim-3、CTLA-4的表達量，所用引物見表1，引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司提供，所有操作均嚴格遵照標準作業(yè)程序進行操作。

表1 引物列表

2 結(jié) 果

2.1兩組Foxp3+Treg、Tim-3和CTLA-4水平檢測結(jié)果 觀察組外周血中Foxp3+Treg水平明顯低于對照組，Tim-3和CTLA-4水平均明顯高于對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組Foxp3+Treg、Tim-3和CTLA-4水平檢測結(jié)果

2.2Foxp3+Treg、Tim-3和CTLA-4水平與T1DM的關(guān)系 患者外周血中Foxp3+Treg水平與其病情嚴重程度呈負相關(guān)(r=-0.483,P<0.05)，Tim-3和CTLA-4水平與其病情嚴重程度呈正相關(guān)(r=0.518、0.502，P<0.05)。

2.3Foxp3+Treg、Tim-3和CTLA-4診斷預(yù)測T1DM的價值 采用Foxp3+Treg、Tim-3和CTLA-4聯(lián)合檢測鑒別T1DM的靈敏度、特異度及曲線下面積(AUC)均明顯高于各指標單獨或兩項指標聯(lián)合檢測，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3、圖1。

表3 Foxp3+Treg、Tim-3和CTLA-4診斷預(yù)測T1DM的價值

圖1 Foxp3+Treg、Tim-3和CTLA-4診斷預(yù)測T1DM的ROC曲線圖

3 討 論

近年來，人們生活習(xí)慣及飲食結(jié)構(gòu)出現(xiàn)顯著改變，導(dǎo)致糖尿病的臨床發(fā)病率呈逐年上升趨勢[10]。其中T1DM主要與遺傳易感基因密切相關(guān)，是由致病性T淋巴細胞、自身抗原特異性等直接攻擊胰島組織并導(dǎo)致β細胞出現(xiàn)特異性損傷、胰島素分泌量不足的自身免疫性疾病[11]。Treg屬于人體內(nèi)重要的表達白細胞介素(IL)-2受體α鏈的CD4+T淋巴細胞，其可有效抑制外來抗原或胰島自身抗原的異常免疫反應(yīng)，與T1DM發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[12]。轉(zhuǎn)錄因子Foxp3是有效維持CD4+細胞發(fā)育和功能的重要因子，其在CD4+CD25HighTreg中特異性表達，且細胞活化方式出現(xiàn)改變后其水平并未隨之變化，是目前公認的識別Treg的重要標志物[13]。

Tim-3是體內(nèi)重要的由281個氨基酸組成的蛋白，其在多種免疫系統(tǒng)疾病中均呈現(xiàn)異常表達狀態(tài)。有研究指出，Tim-3在Th1細胞中特異性地選擇性表達和分化，并通過與配體的相互作用有效調(diào)節(jié)Th1免疫應(yīng)答效應(yīng)[14]。有研究結(jié)果顯示，在糖尿病患者體內(nèi)Tim-3+水平明顯升高，且隨著患者病情加重其水平也明顯升高[15]。CTLA-4是人體內(nèi)T淋巴細胞增殖活性的重要負性調(diào)控因子，有研究指出其可與B7分子特異性結(jié)合并有效抑制T淋巴細胞活化，且可有效抑制CD4+Treg細胞功能，屬于必要的負性調(diào)控分子[16]。

本研究結(jié)果顯示，觀察組外周血中Foxp3+Treg水平低于對照組，Tim-3和CTLA-4水平均明顯高于對照組。此外，患者外周血中Foxp3+Treg與其病情嚴重程度呈負相關(guān)，Tim-3和CTLA-4水平與其病情嚴重程度呈正相關(guān)。且采用Foxp3+Treg、Tim-3和CTLA-4 3項聯(lián)合檢測鑒別診斷T1DM的靈敏度、特異度及AUC均高于各指標單獨或兩項指標聯(lián)合檢測。分析認為，F(xiàn)oxp3作為脊椎動物叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子，特異性表達于Treg，是Treg發(fā)育的關(guān)鍵因子，亦是Treg的特征性標志，因此，F(xiàn)oxp3+Treg水平能更準確地反映Treg的活性。在糖尿病前期，雖然糖耐量受損患者體內(nèi)T細胞水平降低，但Foxp3+Treg水平并無改變，隨著疾病的發(fā)展，患者體內(nèi)可溶性IL-2受體大量聚集，導(dǎo)致IL-2對T細胞作用下降，影響T細胞增殖，導(dǎo)致Treg生成障礙，從而導(dǎo)致Foxp3+Treg水平降低。Tim-3及CTLA-4水平在T1DM患者體內(nèi)呈現(xiàn)異常升高狀態(tài)，其可能導(dǎo)致患者Th1等免疫細胞分泌大量IL-4及γ-干擾素，導(dǎo)致體內(nèi)Th1/Th2水平失衡，進而導(dǎo)致患者胰島β細胞受損，并加重患者病情。相較于各指標兩兩聯(lián)合或單獨檢測，采用3項指標聯(lián)合檢測可更為全面地評估體內(nèi)免疫及炎癥狀態(tài)，有助于提高鑒別診斷準確率和有效性。

4 結(jié) 論

綜上所述，F(xiàn)oxp3+Treg與T1DM病情呈負相關(guān)，Tim-3和CTLA-4水平與T1DM病情呈正相關(guān)，且3項指標聯(lián)合檢測可明顯提高鑒別診斷T1DM的效能。但本研究臨床研究樣本數(shù)較少，且并未對患者進行長期隨訪研究，有待后續(xù)深入研究分析。