急性腦血管病患者M(jìn)THFR基因多態(tài)性分布及血清同型半胱氨酸、脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2水平的臨床研究*

劉 暢，錢(qián) 丹，田 野，劉 飛

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400037)

急性腦血管病患者以急性腦出血、腦血管栓塞及短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)為主要臨床表現(xiàn)。目前急性腦梗死發(fā)病率占急性腦血管病的70%，其病情發(fā)展快，易復(fù)發(fā)，致殘率、致死率高，發(fā)病后所造成的腦細(xì)胞水腫、壞死無(wú)法逆轉(zhuǎn)，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康[1-3]。研究表明，急性腦血管病的發(fā)病呈基因多態(tài)性，且與年齡、飲食、環(huán)境等因素相關(guān)[4]。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR) 作為甲硫氨酸-葉酸代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，維持血漿同型半胱氨酸(Hcy)的正常水平[5]。MTHFR的基因多態(tài)性包括MTHFR C677T、MTHFR A1298C和MTRR A66G。其中MTHFR C677T 基因多態(tài)性使酶的活性降低，導(dǎo)致Hcy的代謝途徑受阻，引起高同型半胱氨酸血癥。研究表明，高水平Hcy是獨(dú)立于高血脂、高血糖、高血壓等引發(fā)急性心腦血管疾病的危險(xiǎn)因素[6]。血漿脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(Lp-PLA2)屬于磷脂酶A2超家族，是一種新的具有血管特異性的炎性標(biāo)志物。Lp-PLA2可通過(guò)分解氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)產(chǎn)生溶血卵磷脂(Lyso-PC)和氧化型游離脂肪酸(ox-FFA)，引起單核細(xì)胞浸潤(rùn)和泡沫細(xì)胞沉積，促進(jìn)不穩(wěn)定斑塊的形成，是缺血性心腦血管疾病的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)因子[7-8]。

為了進(jìn)一步探討MTHFR C677T基因多態(tài)性與Hcy、Lp-PLA2在急性腦血管病中的關(guān)系及獨(dú)立危險(xiǎn)性，本研究通過(guò)對(duì)急性腦血管病患者M(jìn)THFR C677T基因型分布、患者血清Hcy及Lp-PLA2水平的分析，明確急性腦血管患者M(jìn)THFR C677T基因多態(tài)性與血清Hcy、Lp-PLA2水平的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年1-12月陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科以急性腦血管病收治入院的患者共328例，其中男210例，女118例；年齡23～94歲，平均(63.50±12.20)歲。根據(jù)臨床診斷分為急性腦梗死組(153例)、急性腦出血組(78例)、TIA組(97例)。急性腦梗死組中男101例，女52例，平均(62.39±12.33)歲。急性腦出血組中，男55例，女23例，平均(65.65±12.38)歲。TIA組中，男56例，女41例，平均(63.44±11.79)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：急性腦血管病患者均經(jīng)過(guò)詳細(xì)查體、病史詢(xún)問(wèn)及影像學(xué)檢查，符合《中國(guó)腦血管病防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：診斷不明確的腦梗死、腦出血、TIA，惡性腫瘤，血液系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重心、肝、腎功能不全。

1.2儀器與試劑 MTHFR C677T基因檢測(cè)采用杭州博日PCR擴(kuò)增儀，試劑盒購(gòu)于深圳泰樂(lè)德醫(yī)療有限公司。Hcy檢測(cè)采用美國(guó)貝克曼全自動(dòng)生化分析儀，試劑盒購(gòu)于寧波瑞源生物科技有限公司。Lp-PLA2檢測(cè)采用煙臺(tái)艾德康全自動(dòng)酶免分析儀，試劑盒購(gòu)于天津康爾克生物科技公司。

1.3方法

1.3.1MTHFR C677T基因多態(tài)性檢測(cè) 患者空腹采集靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸抗凝。標(biāo)本前處理及PCR擴(kuò)增的具體操作步驟按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件為50 ℃ 2 min；95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，45個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min。

1.3.2血清Hcy、Lp-PLA2檢測(cè) 患者空腹采集靜脈血3 mL，3 500 r/min離心10 min，取上清液。采用美國(guó)貝克曼全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清Hcy水平，煙臺(tái)艾德康全自動(dòng)酶免分析儀檢測(cè)Lp-PLA2水平。

2 結(jié) 果

2.1急性腦血管病患者M(jìn)THFR C677T基因型分布 328例急性腦血管病患者M(jìn)THFR C677T基因分為CC、CT、TT基因型，其中CC、CT、TT基因型頻率分別為42.68%、41.77%、15.55%。通過(guò)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)方法計(jì)算出328例急性腦血管病患者CC、CT、TT基因型頻率理論值分別為40.41%、46.32%、13.27%。同時(shí)病例組實(shí)際值與理論值吻合度良好(χ2=1.47，P>0.05)，樣本基因型符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。見(jiàn)表1。

表1 急性腦血管病患者M(jìn)THFR C677T基因型、 等位基因分布

2.2急性腦血管病患者M(jìn)THFR C677T 基因型在不同性別中的分布 按照性別對(duì)不同MTHFR C677T 基因型的急性腦血管病患者進(jìn)行分組。210例男性患者中，CC基因型95例(45.24%)，CT基因型78例(37.14%)，TT基因型37例(17.62%)。118例女性患者中，CC基因型45例(38.14%)，CT基因型59例(50.00%)，TT基因型14例(11.86%)。MTHFR C677T基因型在男、女組間的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.49，P>0.05)。

2.3急性腦血管病患者M(jìn)THFR C677T基因型在不同年齡中的分布 急性腦血管病CC基因型患者年齡為(64.23±12.12)歲，CT基因型患者年齡為(63.99±11.88)歲，TT基因型患者年齡為(60.06±12.66)歲。MTHFR C677T基因型在不同年齡患者中的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.40，P>0.05)。

2.4急性腦血管病患者M(jìn)THFR C677T 基因型在不同臨床診斷中的分布 78例急性腦出血患者中CC基因型29例(37.18%)，CT基因型34例(43.59%)，TT基因型15例(19.23%)。153例急性腦梗死患者中，CC基因型75例(49.02%)，CT基因型56例(36.60%)，TT基因型22例(14.38%)。97例TIA患者中，CC基因型36例(37.11%)，CT基因型47例(48.46%)，TT基因型14例(14.43%)。MTHFR C677T基因型在急性腦梗死組、急性腦出血組及TIA組中的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.67，P>0.05)。

2.5不同MTHFR C677T 基因型急性腦血管病患者血清Hcy、Lp-PLA2水平比較 急性腦血管病TT基因型患者血清Hcy水平明顯高于CC、CT基因型患者，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=31.87，P<0.05)。其中TT基因型患者血清Hcy水平與CT、CC基因型患者比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=15.14、11.62，P<0.05)。急性腦血管病3種不同基因型患者血清Lp-PLA2水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1.16，P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同MTHFR C677T基因型急性腦血管病患者血清Hcy、Lp-PLA2水平比較[M(P25～P75)]

2.6不同急性腦血管病患者血清Hcy水平比較 急性腦出血組、急性腦梗死組、TIA組血清Hcy水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同急性腦血管病患者血清Hcy水平比較[μmol/L，M(P25～P75)]

2.7不同急性腦血管病患者血清Lp-PLA2水平比較 急性腦梗死組血清Lp-PLA2水平高于急性腦出血組和TIA組，TIA組血清Lp-PLA2水平高于急性腦出血組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 不同急性腦血管病患者血清Lp-PLA2水平比較[ng/mL，M(P25～P75)]

3 討 論

急性腦血管疾病是多危險(xiǎn)因素、多遺傳因素參與的復(fù)雜疾病，如果能在疾病早期對(duì)其危險(xiǎn)因素進(jìn)行有效干預(yù)，可明顯降低疾病的致殘率及致死率。

本研究通過(guò)對(duì)328例急性腦血管病患者M(jìn)THFR 基因C677T 位點(diǎn)分型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)C等位基因占63.57%，T等位基因占36.43%。MTHFR C677T 基因型經(jīng)過(guò)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明樣本在人群中具有代表性。同時(shí)，本研究結(jié)果還顯示，急性腦血管病患者M(jìn)THFR C677T基因型在不同性別、年齡及臨床診斷中的分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，因此，可排除性別、年齡及臨床診斷對(duì)MTHFR C677T基因多態(tài)性分布的影響。

近年來(lái)，大量文獻(xiàn)報(bào)道，急性腦血管病的發(fā)生及預(yù)后與血清Hcy水平密切相關(guān)，體內(nèi)Hcy水平升高是腦血管病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，同時(shí)MTHFR C677T 基因多態(tài)性與高同型半胱氨酸血癥呈顯著相關(guān)[9-10]。MTHFR C677T 基因位點(diǎn)發(fā)生突變會(huì)出現(xiàn)野生型(CC型)、雜合突變型(CT型)及純合突變型(TT型)3種基因型。MTHFR C677T基因雜合突變和純合突變可使 5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶活性分別降低30%和70%，關(guān)鍵酶活性降低，導(dǎo)致Hcy發(fā)生代謝障礙，使機(jī)體Hcy水平升高[11-12]。Hcy水平升高會(huì)直接影響血管壁彈力層和膠原纖維，破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞，Hcy氧化過(guò)程中產(chǎn)生泡沫細(xì)胞進(jìn)而形成粥樣斑塊，促進(jìn)低密度脂蛋白在單核細(xì)胞堆積沉淀，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化，形成血栓。本研究結(jié)果顯示，328例急性腦血管病患者中， MTHFR C677T的TT基因型患者血清Hcy水平明顯高于CC及CT基因型患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示急性腦血管病患者M(jìn)THFR C677T 基因多態(tài)性與Hcy水平存在相關(guān)性。TT基因型患者體內(nèi)MTHFR基因C677T位點(diǎn)C到T的突變，導(dǎo)致MTHFR酶活性降低，因此患者更容易出現(xiàn)高同型半胱氨酸血癥，從而引發(fā)體內(nèi)血管動(dòng)脈粥樣斑塊及血栓的形成，增加急性腦血管病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

在急性腦血管病的眾多獨(dú)立危險(xiǎn)因素中，Lp-PLA2為一種新型的血管炎性標(biāo)志物，它由成熟巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞合成分泌，受炎性介質(zhì)調(diào)控。有研究表明，Lp-PLA2能促進(jìn)心腦血管疾病的發(fā)生及動(dòng)脈粥樣斑塊的形成，其水平與冠心病、缺血性腦卒中的嚴(yán)重程度高度相關(guān)[13-16]。3種不同基因型急性腦血管患者血清Lp-PLA2水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示MTHFR C677T基因多態(tài)性不影響Lp-PLA2活性。通過(guò)對(duì)不同急性腦血管患者Lp-PLA2水平分析發(fā)現(xiàn)，急性腦梗死組Lp-PLA2水平高于急性腦出血組及TIA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示急性腦梗死患者體內(nèi)Lp-PLA2水平及活性的升高，預(yù)示著Lp-PLA2通過(guò)促炎作用，破壞粥樣斑塊的穩(wěn)定性，導(dǎo)致誘發(fā)血管梗死病變的風(fēng)險(xiǎn)加劇，進(jìn)而增加急性腦梗死的發(fā)病率。

綜上所述，MTHFR C677T 基因多態(tài)性是急性腦血管疾病的遺傳易感因素，其中TT基因型所引發(fā)的高同型半胱氨酸血癥，提示T等位基因是急性腦血管疾病獨(dú)立危險(xiǎn)因子。同時(shí)Lp-PLA2也是影響急性腦血管疾病發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素。因此，MTHFR C677T 基因多態(tài)性及Lp-PLA2水平對(duì)急性腦血管病的早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)防具有重要意義，可以作為風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)因子。但急性腦血管病是多種因素及遺傳易感性共同促成的復(fù)雜疾病。研究MTHFR C677T基因多態(tài)性及Hcy、Lp-PLA2水平與疾病的相關(guān)性，還需要擴(kuò)大樣本量，尋找符合納入、排除標(biāo)準(zhǔn)的健康參考樣本，對(duì)多樣本的包括飲食、環(huán)境、遺傳等多種因素進(jìn)行聯(lián)合分析，從而為疾病的防治提供更科學(xué)合理的依據(jù)。

4 結(jié) 論

急性腦血管病MTHFR C677T基因型中，TT基因型患者Hcy水平較CT、CC基因型患者高，說(shuō)明MTHFR基因 C677T位點(diǎn)C到T的突變，導(dǎo)致Hcy代謝障礙而引起Hcy水平升高。急性腦血管患者中，急性腦梗死組血清Lp-PLA2水平高于急性腦出血組與TIA組，說(shuō)明血清Lp-PLA2水平的升高可加劇大血管的炎性病變，增加腦梗死發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。