基因治療脊髓損傷的研究進(jìn)展

胡金金，李松軍，齊新文

(遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院骨外科，廣東 珠海)

0 引言

發(fā)生脊髓損傷后，神經(jīng)生長因子和抑制因子之間的平衡失調(diào)，影響損傷神經(jīng)再生和結(jié)構(gòu)可塑性，而這種平衡失調(diào)主要由內(nèi)在因素和外在因素共同作用于神經(jīng)元及其軸突引起。其中，脊髓損仿局部的神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏[2]，腦信號蛋白、神經(jīng)導(dǎo)向因子及其他因子增加[3-4]，膠質(zhì)瘢痕形成[5]，炎癥反應(yīng)[6]，細(xì)胞外基質(zhì)中的抑制分子硫酸軟骨蛋白多糖，髓磷脂相關(guān)的抑制劑MAG，OMGP和NOG0的增加[7,8]等嚴(yán)重影響了脊髓損傷后神經(jīng)元的再生潛能。在脊髓損傷的恢復(fù)中，再生的軸突跨越脊髓病變部位橋接損傷頭尾兩端，并與對應(yīng)的神經(jīng)元重新建立神經(jīng)突觸連接和形成髓鞘，形成神經(jīng)通路。但是脊髓損傷后多種抑制性因子的作用和受損神經(jīng)元自身的再生能力有限，因此，可能在治療中需要克服這些內(nèi)在和外在因素，從而促進(jìn)神經(jīng)軸突再生和功能恢復(fù)。近年大量的有關(guān)基因治療的方法通過改變目的基因的表達(dá)，改變局部抑制性微環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)軸突的再生，因此，基因治療是一個在脊髓損傷治療中很有發(fā)展?jié)摿Φ姆椒ǎ谶@種治療方式中怎么樣選擇合適的轉(zhuǎn)染方法對提高轉(zhuǎn)染效率至關(guān)重要，轉(zhuǎn)染效率的提高對于基因治療脊髓損傷具有極大的作用。

1 基因到載體中的轉(zhuǎn)染方法

基因轉(zhuǎn)染的方法很多，有生物方法及物理方法，物理化學(xué)方法中常用的有磷酸鈣法、基因槍、電穿孔、陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、殼聚糖為載體的轉(zhuǎn)染，其中陽離子脂質(zhì)體是最常用的核酸轉(zhuǎn)染方法，能在體內(nèi)和體外介導(dǎo)高水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，具有外源基因整合概率低、細(xì)胞毒性低、低免疫反應(yīng)、無基因插入片段大小限制以及制工藝簡單、使用方便、易于保存等優(yōu)點[9]。生物方法則主要是以病毒作為載體, 通過病毒感染的方式將目的基因?qū)氲郊?xì)胞中,病毒載體轉(zhuǎn)染效率高、基因穩(wěn)定、便于濃縮及儲存。其中以慢病毒及腺病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)最為常用。下面我們著重介紹較為常用的電穿孔法介導(dǎo)質(zhì)粒載體、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、腺病毒載體和慢病毒載體轉(zhuǎn)染。

1.1 電孔法介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染

其中電穿孔法就是利用在高壓脈沖電場作用細(xì)胞膜出現(xiàn)可逆性穿孔這一生物物理現(xiàn)象，將目的基因?qū)爰?xì)胞或靶組織中的一個轉(zhuǎn)染方法，也稱電脈沖轉(zhuǎn)染[10]。是將分離好的組織細(xì)胞置于電轉(zhuǎn)緩沖液和質(zhì)?；旌弦褐?，將電極放在容器內(nèi)壁接觸混合液兩端（電極距離2mm），實施電擊。一般采用不同條件電壓、持續(xù)時間及脈沖次數(shù)，嘗試電穿孔法介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組織細(xì)胞，電擊后立即將上皮小心地轉(zhuǎn)移至預(yù)涂有多聚賴氨酸的玻片上，在DEME培養(yǎng)基中（含10%胎牛血清）中培養(yǎng)，48小時后檢測GFP熒光。而陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染則是在6孔板內(nèi)接種細(xì)胞HepG2，在37 ℃恒溫條件下的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，保證HepG2貼壁密度在80%～85%，然后使用lipofectamine 2000對研究質(zhì)粒 PEGFP-C1進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使其進(jìn)入HepG2中，后在37 ℃恒溫條件下的二氧化碳培養(yǎng)箱中留置48h后檢測GFP熒光。

1.1.1 電穿孔法介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

這樣的方式適用于體內(nèi)及體外的轉(zhuǎn)染，能夠提高其轉(zhuǎn)染效率，但電穿孔的參數(shù)包括電阻、電壓和電容以及電穿孔時間都是影響電穿孔轉(zhuǎn)染效率的重要因素，高電場強(qiáng)度長時間電擊可增加DNA的導(dǎo)入，但也不可避免地造成細(xì)胞或細(xì)菌的大量死亡。一般電擊法后當(dāng)細(xì)胞死亡率＜70%，轉(zhuǎn)染效率呈上升趨勢，當(dāng)＞70%時轉(zhuǎn)染效率即呈下降趨勢[11]。

1.1.2 陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染

陽離子脂質(zhì)體是最常用的核酸轉(zhuǎn)染方法，能在體內(nèi)和體外介導(dǎo)高水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，具有方便、經(jīng)濟(jì)、效率高和細(xì)胞需要量少等優(yōu)點[12,13]。脂質(zhì)體表面所帶的正電荷，與熒光標(biāo)記的miRNA形成復(fù)合物后整體仍帶正電，細(xì)胞膜表面主要帶負(fù)電荷，因此帶正電的脂質(zhì)體-miRNA復(fù)合物能通過靜電力結(jié)合到細(xì)胞膜，然后細(xì)胞通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，這是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的主要機(jī)制[14]。脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率受多種因素影響，如轉(zhuǎn)染試劑與核酸的比例、細(xì)胞密度、轉(zhuǎn)染后換液的時間以及表達(dá)時間等[15,16]。此外，細(xì)胞的生長狀態(tài)也是決定轉(zhuǎn)染效率的重要因素之一。

1.2 腺病毒和慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染組織細(xì)胞

是將組織細(xì)胞貼壁培養(yǎng)過夜后，分別加入不同滴度的腺病毐和慢病毒并設(shè)一組未與轉(zhuǎn)染病毒的細(xì)胞為陰性對照，總共7組，毎組相同量的組織細(xì)胞，腺病毒病毒轉(zhuǎn)染6小時或慢病毒轉(zhuǎn)染24小時后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時后更換培養(yǎng)基并在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。通過大量實驗研究發(fā)現(xiàn)，與電穿孔法和腺病毒載體相比，慢病毒載體在神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染方面能更有效地將目的基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)，是轉(zhuǎn)染的理想載體[17]。

1.2.1 腺病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染組織細(xì)胞優(yōu)勢

①腺病毒外源基因表達(dá)水平較高，病毒滴度高，方便于制備和純化；②能同時表達(dá)多個基因[18]，它能同時在同一細(xì)胞株或組織中用來設(shè)計表達(dá)多個基因的表達(dá)系統(tǒng)；③安全性能高。人類是腺病毒的天然宿主，而且腺病毒感染細(xì)胞時其DNA不整合到宿主染色體中，致癌危險小；④與人類基因同源，腺病毒載體系統(tǒng)一般應(yīng)用人類病毒作為載體，以人類細(xì)胞作為宿主，因此為人類蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確的翻譯后加工和適當(dāng)?shù)恼郫B提供了一個理想的環(huán)境。大多數(shù)人類蛋白都可達(dá)到高水平表達(dá)并且具有完全的功能；⑤外源基因容量大，通常復(fù)制缺陷型腺病毒可容納約8.7kb的外源基因，而且第三代腺病毒載體承載的外源基因片段甚至可達(dá)到37kb[19]；⑥感染范圍廣，能將目的基因轉(zhuǎn)移到分裂或靜息的細(xì)胞中。

1.2.2 慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染組織細(xì)胞優(yōu)勢

能感染靜止細(xì)胞，且不產(chǎn)生嵌合體。作為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的載體工具，得到了越來越多的認(rèn)及應(yīng)用，除能感染分裂細(xì)胞外，還能感染不分裂的細(xì)胞；它能高效地介導(dǎo)外源目的基因在宿主體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，遺傳給后代；其操作簡單、表達(dá)廣泛、轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型較多[20,21]；還克服了逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)沉默的不足。因此，該方法在轉(zhuǎn)基因方面得到了廣泛的應(yīng)用。

2 如何提高轉(zhuǎn)染效率

在基因治療脊髓損傷中獲得較高轉(zhuǎn)染效率的病毒對于實驗研究至關(guān)重要，不僅能夠增加目的基因的表達(dá)引起脊髓損傷局部組織相應(yīng)物質(zhì)濃度增高促進(jìn)損傷脊髓修復(fù)，而且能抑制相關(guān)負(fù)向因子的表達(dá)，從而達(dá)到雙重修復(fù)損傷脊髓的目的，那么如何來提高病毒的轉(zhuǎn)染效率呢？目前通常的做法有：（1）選擇適合的轉(zhuǎn)染病毒；（2）正確濃縮病毒的方式；（3）選擇合適的病毒轉(zhuǎn)染方法及轉(zhuǎn)染試劑；（4）提高細(xì)胞敏感性及細(xì)胞同步化等。

2.1 選擇合適的轉(zhuǎn)染病毒

常用的病毒載體有慢病毒、腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒。其中慢病毒載體具有可同時感染分裂和非分裂細(xì)胞[22]、外源基因容量大、低免疫原性、目的基因表達(dá)穩(wěn)定等優(yōu)點，成為目前轉(zhuǎn)染效率較高、應(yīng)用較廣的病毒載體[23]。然后選擇合適的病毒載體，是進(jìn)行基因治療研究的第一步，也是進(jìn)行后續(xù)病毒轉(zhuǎn)染及基因表達(dá)檢測的前提。慢病毒尤其適用于感染較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、甚至神經(jīng)細(xì)胞，能夠?qū)⒋蠖蜠NA整合入細(xì)胞核。因此在神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染中較常選用的病毒為慢病毒。

2.2 正確濃縮病毒的方式

通過濃縮病毒上清液獲得高滴度的反轉(zhuǎn)錄病毒，目前濃縮病毒的方式有以下三種方式；分別是超濾管法、超速離心法及病毒濃縮液法。進(jìn)過基礎(chǔ)實驗研究發(fā)現(xiàn)，不同方法濃縮病毒后的綠色熒光蛋白（green fliorescent protein）轉(zhuǎn)染效率不同，三種濃縮方法中超濾管法濃縮慢病毒后GFP轉(zhuǎn)染效率最高[24]。

2.3 選擇合適的轉(zhuǎn)染方法及轉(zhuǎn)染試劑

常用的病毒轉(zhuǎn)染方法有貼壁法及懸浮轉(zhuǎn)染法[25]。貼壁法細(xì)胞轉(zhuǎn)染時，細(xì)胞貼于培養(yǎng)瓶壁上，表面積小，且只有表面一層可以接觸到病毒顆粒，因此接觸的表面積有限；而懸浮生長的細(xì)胞處于球形，表面積最大，接觸病毒的機(jī)率更大，因此轉(zhuǎn)染的效率也更高。較常用的轉(zhuǎn)染試劑有：lipofectamine 2000，羅氏試劑（X-treme GENE siRNA Transfection Reagent）及 嘌 呤 霉 素，lipofectamine 2000介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法雖然簡便易行，但是并非適合所有的細(xì)胞種類。而羅氏試劑是近年來新興的一種轉(zhuǎn)染試劑，具有更為簡便操作手法，更低的細(xì)胞毒性，更高的轉(zhuǎn)染效率，能夠很好的保持細(xì)胞的原有形態(tài)，在細(xì)胞毒性方面展示了優(yōu)勢，但是轉(zhuǎn)染效率一般，對于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，尤其是原代細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果并不理想。然而對于難轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞，嘌呤霉素聯(lián)合慢病毒轉(zhuǎn)染方法則可以達(dá)到理想的轉(zhuǎn)染效率和較小的細(xì)胞毒性，且條件可控性與穩(wěn)定性方面更加優(yōu)越[26,27]。

2.4 提高細(xì)胞敏感性及細(xì)胞同步化

在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入聚凝胺，能夠明顯提高細(xì)胞對反轉(zhuǎn)錄病毒的敏感性。而細(xì)胞的同步化則是當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)增生期時，將培養(yǎng)細(xì)胞放置入4℃冰箱中2～10h（細(xì)胞分裂受阻能持續(xù)16～20h）；再放回37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)6～12h；在4h內(nèi)有80%的細(xì)胞可進(jìn)入分裂期，從培養(yǎng)箱中拿出培養(yǎng)瓶，用吸管吸除培養(yǎng)液，排除死細(xì)胞和未貼壁的細(xì)胞，然后再加入新培養(yǎng)液，手平持培養(yǎng)瓶橫向反復(fù)搖動，使培養(yǎng)液不斷沖刷細(xì)胞，把分裂中變圓的細(xì)胞從瓶沖刷下來；倒出培養(yǎng)液，分裝入另一瓶培養(yǎng)，多數(shù)分裂細(xì)胞會進(jìn)入同步化生長。將細(xì)胞同步化后，針對分裂期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染能夠獲得了比常規(guī)轉(zhuǎn)染法較好的轉(zhuǎn)染效率[28]。

3 小結(jié)

脊髓損傷是一種后果嚴(yán)重但缺乏有效治療手段的疾病，基因的研究給這一頑癥帶來了希望的曙光，基因治療神經(jīng)變性疾病目前已經(jīng)從臨床前研究發(fā)展到I和II期臨床研究中的?；蛑委熂顾钃p傷則要求目的基因在損傷局部短時間表達(dá)即可。為了克服損傷局部影響神經(jīng)再生的障礙、促進(jìn)功能的恢復(fù)，需要聯(lián)合多種治療法如為軸突生長提供適合的基質(zhì)，為軸突延伸提供相應(yīng)的因子，調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)部信號級聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)損傷神經(jīng)元的再生?；蜣D(zhuǎn)染后提供的因子能刺激軸突向病變部位內(nèi)生長，甚至通過病變部位，而且能激一活神經(jīng)元自身的軸突再生能力?；蛑委熓巧窠?jīng)損傷綜合治療方法中不可分割的一部分，同時也為脊髓損傷治療提供一種新思路，但是依然有許多工作需要我們?nèi)プ觥?/p>