自噬調(diào)節(jié)通路PI3K/Akt/mTORC1及其在腦缺血再灌注損傷中的研究進展

陳姿含，王勇

（桂林醫(yī)學院廣西腫瘤免疫與微環(huán)境調(diào)控重點實驗室，廣西 桂林）

0 引言

腦卒中是由于血管被堵塞造成腦組織缺血、缺氧或腦血管破裂出血所致的急性危重疾病[1]。其中，缺血性腦卒中患者占卒中相關(guān)疾病死亡率的87%，腦缺血后神經(jīng)細胞很快因缺氧而死亡，其有效治療的時間窗非常狹窄。由于醫(yī)學的進步使溶栓藥物和血管內(nèi)技術(shù)得到發(fā)展，使得缺血性腦卒中的致殘率和死亡率降低[2,3]。多數(shù)情況下，缺血后及時再灌注可使組織器官結(jié)構(gòu)和功能得到恢復，患者病情好轉(zhuǎn)康復。但缺血時間過長進行再灌注，反而會加重組織、器官的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷。這種在缺血基礎(chǔ)上恢復血流后組織損傷反而加重，甚至發(fā)生不可逆性損傷的現(xiàn)象稱為缺血再灌注損傷（ischemia/reperfusion injury， I/R）[4]。因此，研究腦缺血再灌注損傷的機制對于缺血性腦卒中的防治至關(guān)重要[5]。

腦缺血再灌注損傷會導致氧化應激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，炎癥和鈣超載等，繼而誘導自噬、凋亡或細胞死亡。自噬是一種將細胞自身蛋白或細胞器運輸?shù)饺苊阁w中進行降解的過程。自噬是在應激狀態(tài)下發(fā)生的反應，研究表明腦缺血再灌注損傷會激活自噬，自噬通過調(diào)控一系列信號通路對神經(jīng)細胞進行保護或損傷。Nazarinia，D[6]等研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠短暫大腦中動脈閉塞后腦組織中自噬蛋白LC3-Ⅱ的表達明顯增加。Guangyun Wang[7]等研究表明，在氧糖剝奪模型以后的PC12細胞中LC3-Ⅱ表達增加。以上研究表明，自噬在腦缺血再灌注損傷中的條件下會被激活，自噬激活后會通過一系列信號通路發(fā)揮作用。

1 自噬相關(guān)信號通路

機體通過自噬來補充能量和氨基酸，實現(xiàn)機體本身的代謝需要和更新[8,9]。自噬包括巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬，是通過運送特定的載體到溶酶體中并形成自噬溶酶體。自噬過程包括將細胞質(zhì)蛋白和受損細胞器隔離膜分解成一種由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成的杯狀的雙層膜的自噬中間體。未成熟的隔離膜會生長包裹內(nèi)容物，從而形成溶酶體，在可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子蛋白受體的介導下，溶酶體與自噬體膜融合。在此階段，內(nèi)含物進行降解，使其在營養(yǎng)耗盡時，細胞質(zhì)表面的LC3-II可以通過依賴于ATG4的去脂作用回收。然后，通過自噬體酸化和溶酶體水解酶降解[10,11]。

細胞自噬在生理條件下受到眾多信號通路的調(diào)控，從而維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。目前研究發(fā)現(xiàn)與自噬有關(guān)的調(diào)節(jié)通路包括PI3K/Akt通路、AMPK通路、mTOR通路、NFκB通路、ROS通路、JNK通路、Sirt1通路等[12,13]。Wei yun Li 等[14]研究了雷公藤內(nèi)酯（Triptolide,TP）和2,4-二氨基-6-羥基嘧啶（2,4-diamino-6-hydroxypyrimidine, DAHP）在大鼠局部腦缺血再灌注損傷模型中起到神經(jīng)保護作用。通過蛋白印跡實驗觀察到，在TP處理的大鼠和DAHP處理的大鼠中，PI3K，Akt和mTOR蛋白表達有明顯增加，這些結(jié)果表明TP和DAHP可以減少局灶性腦缺血，抑制自噬，減少大鼠腦細胞凋亡。紅花黃色素B （Safflower yellow B，SYB）屬于查耳酮化合物，Du Shibin等[15]研究發(fā)現(xiàn)，SYB預防處理明顯的抑制AMPK磷酸化，通過蛋白免疫印跡實驗觀察到，p-AMPK表達隨藥物濃度的增加而增加，NF-κB,和p-IκB的表達隨藥物濃度的增加而減少。SYB通過AMPK信號通路抑制NF-κB活性并減少自噬。保護大腦免受腦缺血再灌注損傷。Ying Zhang和Ju-Mei Miao研究[16]發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯K通過調(diào)節(jié)AMPK/mTOR/ULK1信號通路使進行氧糖剝奪的星形細胞自噬減少，發(fā)揮對細胞的保護作用。Wang Shou-Liang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，右旋美托咪定通過調(diào)節(jié)信號通路TLR4/NF-κB減少炎癥反應和自噬，發(fā)揮對細胞的保護作用。

2 PI3K/Akt/mTORC1信號通路在腦缺血再灌注損傷中的調(diào)節(jié)作用

2.1 PI3K/Akt/mTORC1信號通路

PI3K受到酪氨酸激酶和G蛋白偶聯(lián)受體的刺激時，PI3K在質(zhì)膜附近與p85發(fā)生反應，p110亞基與p85結(jié)合使磷脂酰肌醇2磷酸轉(zhuǎn)化成磷脂酰肌醇3磷酸。磷脂酰肌醇3磷酸與蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）的N端PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使AKT從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞膜上，使Akt蛋白上的蘇氨酸磷酸化位點（Thr308）和絲氨酸磷酸化位點（Ser473）磷酸化而使其激活。激活后的Akt通過直接和間接兩種途徑激活其底物雷帕霉素靶體蛋白（mTOR）。直接途徑是通過磷酸化mTOR，間接途徑是通過失活結(jié)節(jié)性硬化復合物2（tuberous sclerosis2,TSC2）維持Rheb的GTP結(jié)合態(tài)，然后激活mTOR[18]。

已有大量研究顯示，腦缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展與PI3K/Akt/mTOR自噬信號通路有關(guān)。PI3K/Akt/mTORC1信號通路在腦缺血再灌注損傷中起著重要作用，包括抑制氧自由基生成增多，鈣超載，細胞凋亡和炎癥因子等因素的綜合作用導致的腦缺血再灌注損傷。深入研究PI3K/Akt/mTORC1信號通路與自噬的關(guān)系對于腦缺血再灌注損傷的防治具有重要的理論意義和臨床價值。

2.2 PI3K/Akt/mTORC1與氧自由基

活性氧自由基與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腦功能障礙的病理生理學機制有關(guān)。研究表明活性氧自由基參與許多腦部疾病的形成，如腦缺血再灌注損傷[19]。在局灶性或全腦性腦缺血中，腦血流（cerebral blood flow , CBF）在被閉塞的血管中減少，供氧量也隨之減少。在復氧過程中在細胞質(zhì)和線粒體中通過酶催化氧化反應的底物自發(fā)或通過溶栓再灌注來提供氧氣。當缺血再灌注發(fā)生時，在此期間產(chǎn)生的氧自由基酶促進轉(zhuǎn)化[20]。在缺氧條件下線粒體的通透性轉(zhuǎn)換孔形成，導致自由基大量產(chǎn)生和促凋亡分子的釋放[21]。事實上，活性氧幾乎可以破壞任何細胞成分。氧自由基是引起炎癥和凋亡發(fā)生的重要信號因子。信號傳導通路PI3K/Akt是調(diào)節(jié)機體氧化應激和消除炎癥的主要信號通路，在對抗機體炎癥起到了神經(jīng)保護作用。Bing Chun Yan等[22]發(fā)現(xiàn)通過加巴噴丁的預處理PI3K，P-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR水平升高，腦缺血再灌注時氧自由基增多，說明腦缺血再灌注時通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTORC1信號通路使氧自由基增多，氧化應激在腦缺血再灌注中起到重要作用。

2.3 PI3K/Akt/mTORC1與鈣超載

Ca2+在腦缺血再灌注損傷中，鈣分布紊亂，導致細胞內(nèi)鈣濃度異常性升高，即鈣超載。過量的Ca2+通過激活多種Ca2+依賴性酶引起細胞損傷，如：鈣依賴一氧化氮合酶，鈣蛋白酶和各種蛋白酶與內(nèi)切核酸酶。Ca2+通過N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-Daspartic acid,NMDA-和α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙 酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionicacid,AMPA）為受體的通道，通過電壓門控Ca2+通道和Na+-Ca2+交換通道進入神經(jīng)元。另外，從與Ca2+結(jié)合的蛋白的細胞器中釋放，可以進一步增加細胞內(nèi)Ca2+水平。細胞毒性產(chǎn)物的形成例如自由基和白三烯，不可逆線粒體損傷和炎癥都是由于細胞內(nèi)Ca2+過量所引發(fā)的壞死和程序性細胞死亡[23,24]。鈣超載激活Ca2+依賴性蛋白酶，促使黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)變?yōu)辄S嘌呤氧化酶，致使活性氧生成增加，損害組織細胞。信號傳導通路PI3K/Akt/mTORC1是調(diào)節(jié)機體氧化應激和消除炎癥的主要信號通路，在對抗機體炎癥中起到了神經(jīng)保護作用。

Ning Ma[25]等研究通過動脈內(nèi)人類尿激酶原預處理，實驗通過蛋白免疫印跡法觀察到，通過蛋白印跡實驗發(fā)現(xiàn)蛋白水平表達均增加的蛋白有Caspase-3，Bax，p-PI3K和p-Akt，蛋白水平表達減少的蛋白有Bcl-2。通過調(diào)節(jié)線粒體上的通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrialpermeablity transitionpore , MPTP）,使Ca2+從結(jié)合蛋白的細胞器中釋放，可以進一步增加細胞內(nèi)Ca2+水平。細胞毒性產(chǎn)物引發(fā)不可逆的線粒體損傷，引發(fā)炎癥、細胞壞死和程序性細胞死亡。

2.4 PI3K/Akt/mTORC1與細胞凋亡

腦缺血再灌注中的細胞凋亡由許多因素誘導，包括興奮毒性，自由基增多，炎癥，線粒體和DNA損傷，以及細胞色素c從線粒體中釋放，細胞凋亡發(fā)生在輕度缺血性損傷后，特別是在缺血性半影內(nèi)[26]。細胞凋亡是一個耗能過程，因此再灌注可以通過恢復氧和能量來增加了細胞凋亡[27]。缺血后，半胱天冬酶活化促進細胞相關(guān)的信號蛋白，例如Bcl-2的下調(diào)和Bax/Bids以及死亡受體家族的上調(diào)。半胱天冬酶3的活化可以激活下游的因子，半胱天冬酶1,3,8和9都參與腦缺血神經(jīng)細胞的凋亡[28]。迄今為止，已有研究表明信號傳導通路PI3K/Akt/mTORC1參與細胞凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)，從而對腦缺血再灌注損傷起到保護作用[29]。

Teng-Fei Li 等研究表明[30]，通過白楊素預處理調(diào)節(jié)PI3K /Akt/mTOR通路，減少了大鼠腦缺血/再灌注損傷所引起的神經(jīng)損傷。先將白楊素預處理7天，隨藥物濃度的增加，給藥組與I / R組相比，p-PI3K，p-Akt，p-mTOR呈現(xiàn)增加趨勢，TNF-α，IL-6，IL-1β呈現(xiàn)減少趨勢。白楊素通過調(diào)節(jié)PI3K / Akt / mTOR通路減少炎癥反應，對腦缺血再灌注損傷起到保護作用。

2.5 PI3K/Akt/mTORC1與炎癥因子

缺血性損傷引發(fā)腦實質(zhì)中的炎性級聯(lián)，其可通過許多機制進一步放大組織損傷。在閉塞的幾分鐘內(nèi)，出現(xiàn)促炎基因的上調(diào)，產(chǎn)生炎癥因子，如血小板活化因子，腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α , TNF-α）和白細胞介素1β（interleukin 1 β , IL-1 β）等。在血管內(nèi)皮黏附因子表達后，中性粒細胞、巨噬細胞和單核細胞迅速轉(zhuǎn)移到腦損傷部位發(fā)生炎癥反應，由活化的炎性細胞和受損神經(jīng)元（NO，超氧化物和前列腺素類等）產(chǎn)生的毒性介質(zhì)可以放大組織損傷。腦缺血再灌注早期先是由中性粒細胞發(fā)生反應到達缺血區(qū)域發(fā)生炎癥作用[31]，隨后巨噬細胞和單核細胞的產(chǎn)生進一步加劇了炎癥反應。信號傳導通路PI3K/Akt/mTORC1參與相關(guān)炎癥因子，從而對細胞的增殖和凋亡起到調(diào)節(jié)作用[32]。

川陳皮素是一種多甲氧基黃酮，Yuzhen Zheng等[33]研究表明，用100 mg和200 mg的川陳皮素腹腔注射后在大鼠局部腦缺血再灌注損傷模型中，通過蛋白免疫印跡法觀察發(fā)現(xiàn)蛋白水平表達均增加的蛋白有Akt，mTOR。蛋白水平表達均減少的蛋白有IL-β，TNF-α和IL-6。說明川陳皮素通過調(diào)節(jié)信號通路Akt/mTOR，減少了炎癥反應和自噬，發(fā)揮對細胞的保護作用。

3 結(jié)論與展望

在腦缺血再灌注損傷的出現(xiàn)、發(fā)展全過程中，自噬發(fā)揮著多重作用。適當激發(fā)自噬，能夠起到對再灌注過程中的神經(jīng)細胞的保護作用。但如果自噬加劇，將會造成細胞死亡。關(guān)鍵在于如何調(diào)節(jié)細胞自噬發(fā)揮對機體的保護作用。自噬通過調(diào)節(jié)通路PI3K/Akt/mTORC1減少了腦缺血再灌注中神經(jīng)細胞的損傷。隨著對自噬及PI3K/Akt/mTORC1信號通路的研究不斷深入，通過藥物對自噬的合理干預調(diào)控，期望其能應用與臨床，為缺血性腦卒中的防治開拓新的思路。