定量蛋白質(zhì)組和乙酰基蛋白質(zhì)組絕經(jīng)前后卵巢組織的定量差異分析

史松，易金玲，劉雁林

（新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830011）

0 引言

絕經(jīng)定義為由于靜止的原始卵泡池耗盡和卵巢卵泡活性喪失而導(dǎo)致的月經(jīng)永久終止，通常發(fā)生在平均51歲（40-60）歲。盡管這是一個自然過程，但更年期仍會在身體和情感上嚴(yán)重影響女性，這與中年的社會心理問題密切相關(guān).大多數(shù)報道的更年期表現(xiàn)是潮熱和盜汗。此外，更年期還可能導(dǎo)致骨質(zhì)流失，乳腺疾病，心血管系統(tǒng)問題，情緒和認(rèn)知功能障礙，性問題等。圍絕經(jīng)期卵巢癌的風(fēng)險也升高了，流行病學(xué)調(diào)查評估了更年期的副作用，而絕經(jīng)過渡期的生物轉(zhuǎn)化很少評估，因此對更年期缺乏系統(tǒng)的了解[1]。這項(xiàng)研究應(yīng)用了TMT標(biāo)記的LCMS / MS，結(jié)合抗體親和純化的乙?；亩危瑏矸治鼋^經(jīng)前和絕經(jīng)后卵巢組織中的整體蛋白質(zhì)組和乙酰蛋白質(zhì)組。通過比較蛋白質(zhì)的表達(dá)絕經(jīng)后和絕經(jīng)前婦女，我們系統(tǒng)地分析了從絕經(jīng)前到絕經(jīng)后的分子水平變化，并計(jì)算了乙?；稽c(diǎn)周圍序列特征的規(guī)律性。

1 人體卵巢組織的收集

符合以下入選標(biāo)準(zhǔn)的患者被認(rèn)為有資格收集樣品。①年齡在45-60歲之間；②在手術(shù)前至少六個月內(nèi)未服用任何類固醇激素藥物；③絕經(jīng)前婦女的卵巢良性囊腫行膀胱切除術(shù)或附件切除術(shù)或絕經(jīng)后婦女的附件切除術(shù)作良性疾病。所有受試者均未患病，例如癌癥或器官衰竭。最后分別從三名月經(jīng)正常，年齡分別為46、48和51的婦女以及另外三名年齡在52、59和59絕經(jīng)的婦女中分別采集了2、6和8的新鮮冷凍卵巢樣本。

2 蛋白質(zhì)提取和胰蛋白酶消化

將樣品在液氮中均化并轉(zhuǎn)移至試管中。然后，將四份裂解緩沖液（8M尿素，1%蛋白酶抑制劑混合物）添加到樣品中，放置30分鐘。在PTM實(shí)驗(yàn)中，還向裂解緩沖液中添加了抑制劑，例如3μMTSA和50 mM NAM以進(jìn)行乙酰化。在高強(qiáng)度超聲處理機(jī)（Scientz）上在冰上超聲處理三次后，將樣品在冰上完全溶解30分鐘。沉淀剩余的細(xì)胞碎片，并通過在4°C下于12,000 g離心10分鐘來去除。使用ΒCA試劑盒獲得所得的上清液用于蛋白質(zhì)水平測試。

然后在56℃下用5 mM二硫蘇糖醇消化蛋白質(zhì)30分鐘，并在室溫下避光使用11 mM碘乙酰胺進(jìn)行15分鐘烷基化。然后，將100 mM TEAΒ添加到尿素中在蛋白質(zhì)溶液中稀釋至＜2M。接下來，胰蛋白酶加入溶解在緩沖液中的胰蛋白酶與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為1:50的過夜消化。在胰蛋白酶與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為1:100的條件下進(jìn)行第二次消化4小時。

2.1 TMT標(biāo)簽。按要求指示，使用Strata X C18 SPE色譜柱（Phenomenex）對消化的肽進(jìn)行脫鹽處理。簡而言之，將0.5M TEAΒ和TMT試劑中的肽混合物進(jìn)一步用乙腈處理，在室溫下孵育2小時，脫鹽并干燥。

2.2 高效液相色譜（HPLC）分離肽。通過高pH反相HPLC用C18色譜柱（5μm粒徑，10 mm內(nèi)徑，250 mm長）分離胰蛋白酶肽。為了洗脫，在60分鐘內(nèi)將8%-32%的乙腈（pH 9.0）梯度洗脫成60個餾分。要生成18個總的蛋白質(zhì)組，將其合并（最終分?jǐn)?shù)1 = 1、19、37、55，73；最后分?jǐn)?shù)2 = 2，20，38，56，74；最后分?jǐn)?shù)3 = 3，21，39，57，75；………；最終分?jǐn)?shù)18 = 18、36、54、72）。將樣品分別分為18和6部分后，將樣品通過真空離心干燥。

2.3 乙?；牡挠H和富集。為了富集乙?；揎椀碾?，將胰蛋白酶肽在NETN緩沖液（100 mM NaCl，1 mM EDTA，50 mM Tris-HCl，0.5%NP-40，pH 8.0）中進(jìn)行孵育（在乙?；贵w珠存在下）（批號PTM104，PTM Βio）在4℃過夜。通過用0.1%三氟乙酸處理使結(jié)合的肽解離。真空干燥后，按照制造商的指示，使用C18 ZipTips（Millipore）對肽樣品進(jìn)行脫鹽，以用于LC-MS/MS[2]。

2.4 LC-MS/MS。用0.1%的甲酸（溶劑A）配制胰蛋白酶肽標(biāo)本，然后將其上樣到自制的反相分析柱（長度為15 cm，ID為75μm）上。梯度在26分鐘內(nèi)從6%增加到23%溶劑Β（0.1%甲酸的98%乙腈溶液），在8分鐘內(nèi)增加23%-35%，并在3分鐘內(nèi)增加到80%，并保持3分鐘（流速），400 nL/min）在EASY-nLC 1000 UPLC系統(tǒng)上。

2.5 結(jié)果和討論卵巢中全局和乙?；鞍踪|(zhì)組的鑒定和定量。我們同時使用3個卵巢絕經(jīng)前樣本和3個卵巢樣本，通過TMT標(biāo)記同時鑒定和定量了全球和乙酰蛋白質(zhì)組圖譜絕經(jīng)后卵巢樣本分別為3個。值得注意的是，根據(jù)TMT標(biāo)記和LC-MS / MS對總蛋白和乙酰基蛋白進(jìn)行定量通常包括以下步驟。首先，從卵巢蛋白質(zhì)中回收6組消化的肽并進(jìn)行TMT標(biāo)記；其次，將6組標(biāo)記的肽平均混合。第三，對于全球蛋白質(zhì)組分析，通過HPLC分離為60個餾分，合并為18個餾分，脫鹽后通過高分辨率LC-MS/ MS直接分析。用于乙酰基蛋白質(zhì)組分析，通過HPLC分離為60個餾分，合并為6個餾分，通過HPLC富集乙?；倪M(jìn)行了基于抗體的修飾富集，脫鹽和質(zhì)譜分析。通過應(yīng)用這種方法，可以同時評估全局蛋白和乙?；鞍椎谋磉_(dá)變化[3]。

TMT標(biāo)記的LC-MS/MS與HPLC的預(yù)分離相結(jié)合，可以進(jìn)行全面的蛋白質(zhì)組圖譜分析，并且覆蓋范圍廣。結(jié)合乙酰化肽富集方法，該策略有助于同時評估整體蛋白質(zhì)組變化程度和乙酰蛋白質(zhì)表達(dá)變化。

對于卵巢中的整體蛋白質(zhì)組，已鑒定出4210種蛋白質(zhì)，其中3551種蛋白質(zhì)一式三份進(jìn)行定量分析。差異表達(dá)蛋白質(zhì)的數(shù)量達(dá)到了可量化蛋白質(zhì)總量的5-10%。比較絕經(jīng)后組和絕經(jīng)前組在1.3倍變化閾值和t檢驗(yàn)P＜0.05時的蛋白表達(dá)水平，共發(fā)現(xiàn)151種蛋白上調(diào)而65種蛋白下調(diào)。

為了驗(yàn)證抗體的特異性，在我們的研究中使用MS/MS數(shù)據(jù)搜索了一些額外的?；稽c(diǎn)。與3047個乙酰化位點(diǎn)相比，MS/MS原始數(shù)據(jù)中僅檢測到35個琥珀酰化位點(diǎn)和43個丙二?；稽c(diǎn)。因此，我們得出結(jié)論，本研究中使用的抗體對琥珀?；哂懈叨忍禺愋?。

3 圍絕經(jīng)期婦女與絕經(jīng)后婦女差異蛋白和乙酰化蛋白的功能分析

為了探討差異表達(dá)蛋白的功能注釋，根據(jù)基因本體論比較了絕經(jīng)后和絕經(jīng)前標(biāo)本的生物學(xué)過程，細(xì)胞成分和分子功能。通常，最明顯不同的生物過程包括細(xì)胞，單一生物和代謝過程以及生物調(diào)節(jié)，這些通常是生命的基礎(chǔ)。細(xì)胞成分主要集中在細(xì)胞，細(xì)胞器和細(xì)胞外區(qū)室。最重要的分子功能包括蛋白質(zhì)結(jié)合和催化活性。上述發(fā)現(xiàn)也適用于檢測到的差異性乙酰蛋白。此外，我們對檢索到的差異蛋白和乙?；鞍走M(jìn)行了主要三類以外的富集分析[4]。

4 絕經(jīng)前和絕經(jīng)后組織之間差異表達(dá)和乙?；鞍椎耐緩礁患?/h2>

接下來，我們探索了基于KEGG數(shù)據(jù)庫的差異蛋白揭示的途徑富集。選擇25條上調(diào)和25條下調(diào)的途徑絕經(jīng)前后卵巢組織中的151種上調(diào)蛋白和65種下調(diào)蛋白。絕經(jīng)后卵巢中最上調(diào)的途徑是補(bǔ)體和凝血級聯(lián)，而最下調(diào)的是ECM-受體相互作用。對于差異化的乙酰化蛋白質(zhì)，唯一的上調(diào)途徑是檸檬酸鹽循環(huán)，而最下調(diào)的途徑是單純皰疹感染，胞吞作用和金黃色葡萄球菌感染。這些發(fā)現(xiàn)表明，在絕經(jīng)后，凝結(jié)被激活，同時能量供應(yīng)增加，以滿足卵巢的消耗需求。隨著補(bǔ)體途徑的增加，卵巢試圖增強(qiáng)免疫力，同時變得更容易感染，這表明絕經(jīng)后卵巢變得越來越弱。

5 蛋白質(zhì)乙?；哪割}分析

為了檢測乙?；稽c(diǎn)周圍的氨基酸序列，采用基序分析來探索靠近特定乙?；稽c(diǎn)的氨基酸序列，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)以分析結(jié)果。乙酰化位點(diǎn)前景和背景上的氨基酸與整個大小匹配，并計(jì)算出基序得分和倍數(shù)變化。以這種方式，測定了乙?；稽c(diǎn)附近的氨基酸及其各自的統(tǒng)計(jì)顯著性[5]。

6 當(dāng)前研究結(jié)果和未來發(fā)展方向的意義

更年期是自然過程，但對于50歲以上的女性而言卻伴隨著復(fù)雜的變化。更年期，這被認(rèn)為是一個轉(zhuǎn)折點(diǎn)，可能在某些女性中發(fā)生得更早。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）估計(jì)，到2050年，將有10億婦女年齡在60歲以上，這表明絕經(jīng)后婦女的人數(shù)將超過10億，這已成為全世界公共衛(wèi)生關(guān)注的問題。絕經(jīng)前后婦女經(jīng)常表現(xiàn)出更年期的體征和癥狀，其中更年期過渡期最常見的是潮熱，盜汗，反復(fù)疲勞，甚至記憶力減退和輕度抑郁.對于嚴(yán)重癥狀，激素療法可用于緩解或治療。目前，多項(xiàng)調(diào)查，薈萃分析和流行病學(xué)研究已經(jīng)探索了與更年期相關(guān)的潛在因素及其對老年婦女及其家庭的醫(yī)療保健和生活質(zhì)量的潛在副作用[6]。

7 結(jié)論

總之，這是絕經(jīng)前和絕經(jīng)后卵巢樣品中蛋白質(zhì)組和修飾蛋白質(zhì)組的首次系統(tǒng)探索。通過全面的蛋白質(zhì)組學(xué)和乙酰蛋白質(zhì)組學(xué)分析，研究了絕經(jīng)前和絕經(jīng)后卵巢組織中蛋白質(zhì)表達(dá)和乙?；淖兓?。然后，詳細(xì)評估了絕經(jīng)期過渡期分子功能，生物學(xué)過程，細(xì)胞成分，途徑和基序的差異性變化。全球蛋白質(zhì)或乙?；鞍踪|(zhì)表達(dá)水平的特定變化可能構(gòu)成卵巢病理的潛在標(biāo)志，并幫助開發(fā)更年期癥狀的治療方法并最終改善婦女的醫(yī)療保健。