百菌清降解菌的分離鑒定及功能基因分析

任曉潔，賀壯壯，單 昕，趙玉斌，宋元達(dá)，趙新河,,4

百菌清降解菌的分離鑒定及功能基因分析

任曉潔1,2，賀壯壯1，單 昕1，趙玉斌3，宋元達(dá)1，趙新河1,3,4※

（1. 山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，考林臘特列杰微生物脂質(zhì)國(guó)際研究中心，淄博 255000；2. 保齡寶生物股份有限公司，德州 253000；3. 魯洲生物科技有限公司，臨沂 276400；4. 重慶市科學(xué)技術(shù)研究院，重慶 401123）

百菌清是一種廣譜非內(nèi)源性農(nóng)藥，在土壤中難以降解，已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)環(huán)境污染的主要污染源之一。因此，其對(duì)環(huán)境的污染和被污染土壤的修復(fù)技術(shù)越來(lái)越受到關(guān)注。土壤環(huán)境中原位降解細(xì)菌的多樣性對(duì)于評(píng)價(jià)環(huán)境毒理學(xué)、生物降解性、自凈化能力和污染物的修復(fù)潛力具有重要價(jià)值。該研究從長(zhǎng)期被百菌清污染的土壤中收集大量樣本，分離到了14種能夠明顯降解百菌清的細(xì)菌。根據(jù)菌株形態(tài)和rDNA同源性分析，將它們分為假單胞菌屬（sp）、無(wú)色桿菌屬（sp）、蒼白桿菌屬（sp）、青枯菌屬（sp）和溶桿菌屬（sp）。其中溶桿菌屬是該研究中新發(fā)現(xiàn)的具有百菌清降解能力的功能菌屬，該發(fā)現(xiàn)擴(kuò)大了已知的百菌清降解菌的菌屬范圍。通過(guò)進(jìn)一步鑒定及生理生化分析，確定了該降解菌的分類地位及理化特征。此外，該研究通過(guò)基因文庫(kù)法克隆到了發(fā)揮關(guān)鍵降解作用的水解酶基因，并發(fā)現(xiàn)該基因與轉(zhuǎn)座子原件相連，二者組成代謝轉(zhuǎn)座子，具有水平轉(zhuǎn)移的分子基礎(chǔ)。通過(guò)揭示降解基因在細(xì)菌間的漂移機(jī)制，初步明確了降解菌的功能基因及其分布規(guī)律。

土壤；農(nóng)藥；細(xì)菌；基因克?。凰狡?/p>

0 引 言

百菌清（2, 4, 5, 6-四氯間苯二甲腈）是一種非內(nèi)吸性廣譜殺菌劑，對(duì)多種作物真菌病害具有防治作用。該農(nóng)藥性質(zhì)穩(wěn)定，殘效期長(zhǎng)，具有明顯的毒性蓄積。受到百菌清污染的農(nóng)業(yè)環(huán)境對(duì)人們的生活產(chǎn)生重大影響，該農(nóng)藥對(duì)人和動(dòng)物內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生干擾作用，會(huì)造成人和動(dòng)物雌性化、腺體病變和后代生命力退化，進(jìn)而影響人和動(dòng)物的生殖繁衍。因此，受百菌清污染土壤的修復(fù)技術(shù)也越來(lái)越受到人們的關(guān)注。農(nóng)藥進(jìn)入土壤后會(huì)對(duì)土壤微生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生一定的影響[1-3]。研究證明，百菌清會(huì)對(duì)不同的土壤微生物生長(zhǎng)造成相應(yīng)的刺激或者抑制[4-7]。馮波等[8]在模擬土壤生態(tài)系統(tǒng)中研究了百菌清對(duì)土壤微生物數(shù)量和酶活性的影響。研究后發(fā)現(xiàn)，土壤經(jīng)不同濃度百菌清處理后細(xì)菌、放線菌和真菌的生長(zhǎng)受到不同程度的抑制作用。Sigler等[9]也對(duì)百菌清污染的土壤微生物群落進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)百菌清能夠抑制或者刺激不同細(xì)菌的生長(zhǎng)，而真菌則全部被明顯抑制。在對(duì)土壤中生物酶的研究發(fā)現(xiàn)，百菌清對(duì)土壤酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、脲酶、蔗糖酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素分解酶均能夠產(chǎn)生一定的抑制作用[4,8,10]。因此，百菌清被廣泛證實(shí)能夠從多方面影響土壤微生態(tài)環(huán)境。

利用特種微生物降解土壤中的農(nóng)藥殘留是農(nóng)業(yè)土壤修復(fù)的重要手段之一。某些微生物可以將有機(jī)農(nóng)藥污染物作為原料進(jìn)行分解，從而達(dá)到降解的目的[11-12]。國(guó)內(nèi)外在利用微生物降解農(nóng)藥的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的有機(jī)農(nóng)藥降解菌，比如，人們分離到了眾多能夠分解對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷及其他有機(jī)磷的生物降解菌[13-15]。然而，在百菌清的生物降解研究中，只有少數(shù)降解菌得到了研究[16-18]。并且，在研究百菌清生物降解菌的過(guò)程中，其降解功能基因的分離及分析等工作十分欠缺。在其他農(nóng)藥降解菌的降解機(jī)理研究中發(fā)現(xiàn)，降解菌的生物多樣性與分子水平漂移機(jī)制相關(guān)。例如，研究發(fā)現(xiàn)降解有機(jī)磷基因的DNA中鳥嘌呤與胞嘧啶堿基對(duì)摩爾百分?jǐn)?shù)含量與降解菌自身染色體DNA中的鳥嘌呤與胞嘧啶堿基對(duì)摩爾百分?jǐn)?shù)含量明顯不同，降解基因如同一個(gè)外源侵入基因，插入到降解菌的DNA中，從而使其獲得了降解污染物的能力。此外，進(jìn)化上相近的降解基因從發(fā)育關(guān)系較遠(yuǎn)的微生物中被發(fā)現(xiàn)[19-21]，同樣也被認(rèn)為是降解基因通過(guò)水平轉(zhuǎn)移獲得[22]。目前，已有很多研究從諸多方面揭示了降解基因水平漂移的現(xiàn)象[23]，并證明發(fā)生基因的水平漂移，是微生物獲得降解功能的重要途徑。并且，已有大量研究獲得了多種降解農(nóng)藥的代謝轉(zhuǎn)座子。例如，Siddavattam等[24]發(fā)現(xiàn)有機(jī)磷降解基因存在于一個(gè)類轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)中；張瑞福等[25]發(fā)現(xiàn)7株菌中甲基對(duì)硫磷基因都與轉(zhuǎn)座元件IS6100緊密相連；Hoffmann[26]發(fā)現(xiàn)2,4-D降解菌中降解基因的基因簇兩側(cè)有IS1071和IS1380兩個(gè)轉(zhuǎn)座元件，組成一個(gè)30 kb的定位于染色體上的轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)。Top等[27-28]也研究了2,4-D降解質(zhì)粒在不同降解菌中的轉(zhuǎn)移作用及其對(duì)土壤中2,4-D降解的影響。然而，百菌清降解基因的代謝轉(zhuǎn)座元件尚無(wú)報(bào)道。

因此，研究百菌清的生物降解，豐富降解菌庫(kù)，研究百菌清降解菌的多樣性，并從基因水平克隆和分析發(fā)揮關(guān)鍵降解作用的基因等，能夠?yàn)榻窈笫馨倬逦廴就寥赖纳镄迯?fù)技術(shù)奠定理論基礎(chǔ)。本文通過(guò)百菌清降解菌的分離和鑒定，研究了百菌清降解菌的多樣性，并對(duì)百菌清降解基因及其在各菌屬中的散布機(jī)制進(jìn)行了初步研究，為受百菌清污染土壤的生物修復(fù)技術(shù)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 降解百菌清菌株的分離

分別從百菌清生產(chǎn)車間、生產(chǎn)車間的綠化帶和連續(xù)施用百菌清的農(nóng)田表層（0～15 cm）收集土壤樣品。分離所用的篩選培養(yǎng)基有基礎(chǔ)礦物鹽培養(yǎng)基（Minimal salt medium，MSM，普遍適用于各類微生物的篩選）、溶菌肉湯培養(yǎng)基（Lysogeny broth，LB，特別適用于細(xì)菌的篩選），馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Dextrose Agar，PDA，特別適用于放線菌的篩選）及高氏一號(hào)培養(yǎng)基（特別適用于真菌的篩選）。MSM培養(yǎng)基每升包含1.0 g NH4NO3、0.5 g MgSO4·7H2O、0.5 g (NH4)2SO4、0.5 g KH2PO4、0.5 g NaCl和1.5 g K2HPO4，pH值7.0。LB培養(yǎng)基每升含10.0 g胰蛋白、5.0 g酵母提取物和10.0 g NaCl（pH值7.0）。PDA培養(yǎng)基包含200.0 g馬鈴薯和20.0 g蔗糖（pH值7.0）。高氏一號(hào)培養(yǎng)基中含1.0 g KNO3、0.01 g FeSO4·7H2O、0.5 g K2HPO4、0.5 g NaCl、20.0 g淀粉（pH值7.2）。固體培養(yǎng)基的配制通過(guò)添加2.0%瓊脂來(lái)制備。各種培養(yǎng)基在121℃高壓滅菌20 min，將百菌清儲(chǔ)備液過(guò)濾除菌并添加到各種篩選培養(yǎng)基中，以使最終濃度達(dá)到5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、80、100 mg/L。全部試劑均為分析純。

采用稀釋平板法分離百菌清降解菌：將1 g土壤放入9 mL無(wú)菌水中，并在30 ℃下混合20 min。然后靜置30 min后，取出1 mL土壤懸浮液，并稀釋至其原始濃度的10-3、10-4、10-5。然后將每種濃度的200L稀釋液涂在含有百菌清的初篩培養(yǎng)基MSM上。在30 ℃下孵育2～7 d后，根據(jù)菌落周圍的水解環(huán)選擇分離株。挑選產(chǎn)生透明圈的單個(gè)菌落，在篩選培養(yǎng)基上劃線多次，并在含有百菌清的篩選培養(yǎng)基上重新檢查純化的菌株。

1.2 百菌清降解菌株的鑒定與表征

根據(jù)伯杰氏細(xì)菌學(xué)手冊(cè)，結(jié)合菌株16S rDNA及生理生化特性對(duì)其進(jìn)行鑒定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法提取基因組DNA。通過(guò)使用2個(gè)通用引物P1和P6，從其基因組DNA擴(kuò)增16S rRNA。其中，正向引物P1（59-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGCT-39）對(duì)應(yīng)于大腸桿菌16S rRNA基因的8-37位置，反向引物P6（59-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-39）對(duì)應(yīng)于大腸桿菌16S rRNA基因的1479-1506位置。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，變性（94 ℃，30 s）、退火（55 ℃，30 s）、延伸（72 ℃，90 s）作為一個(gè)循環(huán)，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。最后在72 ℃穩(wěn)定延伸10 min。PCR產(chǎn)物用凝膠提取試劑盒（TaKaRa Bio, Otsu, Japan）純化，并由中國(guó)北京的三博生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)用NCBI中的BLAST進(jìn)行DNA序列分析。從Genbank中調(diào)取親緣關(guān)系近的菌株的16S rDNA序列，用MEGA3.1進(jìn)行序列比對(duì)，計(jì)算遺傳距離，建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

用于菌種鑒定的生理生化實(shí)驗(yàn)包括革蘭氏染色，氧化酶，接觸酶，最適pH值，耐鹽性試驗(yàn)，硝酸還原試驗(yàn)，酪蛋白水解試驗(yàn)，產(chǎn)吲哚試驗(yàn)，七葉苷水解試驗(yàn)，尿素水解，吐溫80水解，淀粉水解，醌、極性脂、脂肪酸含量測(cè)定等，各生化反應(yīng)的具體方法參照[29]。

1.3 染色體DNA中鳥嘌呤和胞嘧啶堿基對(duì)的摩爾含量和DNA的同源性測(cè)定

根據(jù)細(xì)菌分類鑒定標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)菌染色體DNA中鳥嘌呤和胞嘧啶堿基對(duì)的摩爾含量及染色體DNA的同源性是將細(xì)菌鑒定到種的依據(jù)。鳥嘌呤和胞嘧啶堿基對(duì)的摩爾含量測(cè)定采用熱變性溫度（T值）法，所用儀器由Lambda Bio 20型紫外分光光度計(jì)、PTP-1 溫度控制儀、循環(huán)水浴和計(jì)算機(jī)組成。整個(gè)測(cè)定過(guò)程由UV Winlab 軟件控制。

1）T值的測(cè)定：將待測(cè)DNA樣品適當(dāng)稀釋，使其吸光度為0.2～0.5。以K12菌株的DNA作參比，以消除試驗(yàn)系統(tǒng)誤差。將稀釋后的DNA置于帶加熱裝置的紫外分光光度計(jì)中完成熱變性，根據(jù)變性過(guò)程中各溫度和對(duì)應(yīng)的相對(duì)吸光度繪制成DNA變性曲線，熱變性曲線中點(diǎn)的溫度即為T值。

2）所測(cè)T值帶入特定公式即可算出細(xì)菌染色體DNA的鳥嘌呤和胞嘧啶堿基對(duì)的摩爾含量。使用公式鳥嘌呤和胞嘧啶堿基對(duì)的摩爾含量= 51.2+2.08 [T()?T()]計(jì)算，其中T()為待測(cè)菌的T值；T()為大腸桿菌K12的T值。

細(xì)菌染色體DNA同源性的測(cè)定采用DNA-DNA雜交法，經(jīng)過(guò)DNA提取，剪切，變性，復(fù)性，從而測(cè)定兩株菌的DNA復(fù)性速率和同源性。將DNA置于溫度控制儀，并在100℃下變性10 min，變性結(jié)束后，將溫度控制儀的溫度設(shè)定為最適復(fù)性溫度[T=0.51(鳥嘌呤和胞嘧啶堿基對(duì)的摩爾含量)+ 47.0]。當(dāng)變性DNA樣品的溫度迅速降至最適復(fù)性溫度，并穩(wěn)定2 min后，開始復(fù)性反應(yīng)，一般進(jìn)行20 min。計(jì)算機(jī)可記錄260 nm處吸光值隨時(shí)間變化的復(fù)性反應(yīng)曲線，該曲線的斜率即為DNA 樣品的復(fù)性速率（通常用表示，單位為每分鐘吸光值的減少值）。DNA同源性（，%）根據(jù)公式計(jì)算：

=[4V?(V+V]/[2(V?V1/2]×100 （1）

式中V表示樣品A的自身復(fù)性速率，V表示樣品B的自身復(fù)性速率，V表示樣品a與b等量混合后的復(fù)性速率。

1.4 基因文庫(kù)構(gòu)建及功能基因篩選

提取溶桿菌RB-38的基因組DNA，取4g DNA，加入2L稀釋至 0.03 U/L的Sau3AI酶液，37℃消化，反應(yīng)35 min，瓊脂糖電泳，回收4-8 kb片段。由于Sau3A I與BamH I為同尾酶，所以采用內(nèi)切酶BamH I對(duì)載體pUC19進(jìn)行酶切，并用堿性磷酸酶（CIAP）處理。將酶切片段與酶切的pUC19載體連接，連接體系為10L，載體0.5L，外源8.2L，10×buffer 1L，連接酶0.3L，16 ℃過(guò)夜連接，然后取連接產(chǎn)物1L轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，電極槽為1 mm，電壓1 600 V。將基因文庫(kù)得到的轉(zhuǎn)化子在百菌清液體篩選培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)三代，最終收集菌體點(diǎn)種于百菌清篩選固體培養(yǎng)基上，觀察透明圈產(chǎn)生情況，從而篩選具有百菌清降解功能的基因片段。

2 結(jié)果與討論

2.1 百菌清降解菌的分離與鑒定

不同微生物對(duì)百菌清的耐受程度是不一樣的，為了選擇合適的培養(yǎng)濃度，保證降解菌不被過(guò)高濃度的農(nóng)藥抑制或殺死，在各篩選培養(yǎng)基中加入百菌清母液，制成農(nóng)藥梯度培養(yǎng)基，并觀察結(jié)果，見(jiàn)表1。結(jié)果顯示細(xì)菌對(duì)百菌清的耐受性最強(qiáng)，其在加有100g/mL百菌清的LB細(xì)菌培養(yǎng)基上的仍能大量存活，而真菌在添加同樣濃度百菌清的高氏一號(hào)培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。百菌清濃度超過(guò)60g/mL，用于分離真菌的高氏一號(hào)培養(yǎng)基上不出現(xiàn)菌落，而百菌清濃度低于40g/mL，用于分離細(xì)菌的LB平板上的菌落數(shù)過(guò)多，不利于后續(xù)操作。因此選擇百菌清終濃度為50g/mL的培養(yǎng)基進(jìn)行后續(xù)的培養(yǎng)。

表1 含不同濃度百菌清的培養(yǎng)基上菌落個(gè)數(shù)

由于待篩選的土壤中微生物的類型未知，因此我們初始選用適宜各種微生物生長(zhǎng)的微生物基礎(chǔ)培養(yǎng)基（基礎(chǔ)礦物鹽MSM培養(yǎng)基），加入50g/mL百菌清進(jìn)行篩選。本試驗(yàn)共分離純化出14株百菌清降解菌，它們?cè)诤邪倬宓腗SM平板上均有明顯的透明圈產(chǎn)生，見(jiàn)圖1。由培養(yǎng)結(jié)果可以看出，大部分篩選到的菌株可以在培養(yǎng)2 d之后就對(duì)百菌清產(chǎn)生明顯的降解作用，因此具有非常好的應(yīng)用潛力。

注：篩選平板為加有50 μg?mL-1百菌清的基礎(chǔ)礦物鹽MSM培養(yǎng)基，箭頭指示在菌落周圍產(chǎn)生降解圈的菌，為篩選到的具有百菌清降解功能的菌株。

經(jīng)革蘭氏染色，這些降解菌均為革蘭氏陰性菌，將這些分離到的菌株在含有百菌清的LB培養(yǎng)基上點(diǎn)種，驗(yàn)證其百菌清降解功能（圖2），這14株菌均有明顯的降解百菌清的能力。顯微鏡下觀察菌體的形態(tài)各有不同（表2）且均無(wú)芽孢。

注：RB-No. 為各降解菌株在篩選過(guò)程中的編號(hào)，下同。

表2 百菌清降解菌的表型特征

擴(kuò)增各降解菌株的16SrDNA，PCR產(chǎn)物純化回收后連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑取在Amp-X-gal-IPTG上的白斑，cracking檢測(cè)后，送北京三博生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI上用BLAST在線分析，結(jié)果顯示菌株RB-1、RB-4、RB-5、RB-6、RB-9、RB-12、RB-13、RB-23、RB-24的16S rDNA序列與假單胞菌屬（）的多株菌同源性達(dá)99%，菌株RB-16與無(wú)色菌屬（）的多株菌同源性達(dá)99%，菌株RB-28與蒼白桿菌屬（）多株菌同源性高達(dá)99%，菌株RB-29與青枯菌屬（）多株菌同源性達(dá)99%，菌株RB-31與RB-38與溶桿菌屬（）多株菌同源性達(dá)97%。通過(guò)分析比較將14株菌初步鑒定到屬的水平，如表3所示，并構(gòu)建了它們之間16S rDNA序列同源性系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。本研究表明百菌清降解菌種類廣泛，并以假單胞菌的數(shù)量和種類最多。在過(guò)去的研究中分離到的百菌清降解菌有氮單胞菌屬（），黃桿菌屬（），莫拉氏菌屬（），假單胞菌屬（），微球菌屬（）和蒼白桿菌屬（）等[16-18]。本試驗(yàn)分離到的假單胞菌屬和蒼白桿菌屬為已知的具有百菌清降解功能的菌屬，而無(wú)色菌屬、青枯菌屬及溶桿菌屬是最新分離到的具有百菌清降解功能的菌株。這說(shuō)明百菌清對(duì)土壤微生物種類的影響有可能還跟土壤類型、土壤性質(zhì)、土壤中土著微生物的分布及豐度等因素有關(guān)。本試驗(yàn)的篩選在前人研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步豐富了百菌清降解菌庫(kù)，增加了無(wú)色菌屬、青枯菌屬及溶桿菌屬的降解菌株。此外，本試驗(yàn)篩選到的溶桿菌屬的RB-31、RB-38與該屬內(nèi)其他標(biāo)準(zhǔn)菌株的同源性較低，16S rDNA序列同源性只有97%，該值處于細(xì)菌新種鑒定的臨界值，說(shuō)明其有可能成為該菌屬中的新種，因此選定這2株菌進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。

表3 百菌清降解菌的16SrDNA同源性比對(duì)結(jié)果

圖3 百菌清降解菌的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

用MEGA3.1軟件分別計(jì)算RB-31、RB-38與溶桿菌屬17株標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rDNA的遺傳距離，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4），結(jié)果表明RB-31和RB-38位于同一個(gè)分支，且與標(biāo)準(zhǔn)菌株GH1-9T的進(jìn)化關(guān)系最近，同源性分別為97.4%和97.2%。與其他標(biāo)準(zhǔn)菌株的同源性都低于97%。16S rDNA 序列同源性低于97%的菌一定不是同一個(gè)種，而具有97%或以上的相似性時(shí)，不能判定是哪個(gè)種，需要進(jìn)一步DNA-DNA雜交確定，因此要確定RB-31和RB-38是不是溶桿菌屬的新種需要將其分別于GH1-9T進(jìn)行DNA-DNA雜交。結(jié)果表明，RB-31與GH1-9T的DNA同源性為49.9%，RB-38與GH1-9T的DNA同源性為20.07%，RB-31與RB-38之間的DNA同源性超過(guò)70%，根據(jù)國(guó)際系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)委員會(huì)規(guī)定，DNA同源性≥70%，雜交分子的熱解鏈溫度差≤5℃為細(xì)菌種的最低界限[30]。由于兩株菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株GH1-9TDNA之間同源性均小于70%，而兩株菌之間DNA同源性超過(guò)70%，所以可以初步確定RB-31、RB-38代表溶桿菌屬的一個(gè)新種，為同一種內(nèi)的不同菌株。

2.2 分離菌株的生理生化特性

由于生理生化特征往往是菌株本身某種代謝途徑或某種酶的特有表現(xiàn)，它在某種程度上反映了菌株的本質(zhì)特征，因此本研究選取有代表性的菌株RB-38進(jìn)行生化性質(zhì)的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如表4。由前面結(jié)果已知，RB-38經(jīng)過(guò)16S rDNA測(cè)序被初步鑒定為溶桿菌屬，其與該屬內(nèi)其他標(biāo)準(zhǔn)菌株的同源性較低（97%左右），且與標(biāo)準(zhǔn)菌株GH1-9T的進(jìn)化關(guān)系最近，同源性為97.2%。因此，將其與標(biāo)準(zhǔn)菌株GH1-9T進(jìn)行生理生化特征的比較，結(jié)果表明RB-38與參比菌株GH1-9T生理生化特征相似，進(jìn)一步證明RB-38是溶桿菌屬的菌株。然而同一屬中不同種之間的菌株性狀也有個(gè)別不同之處（表4）。其中，RB-38較GH1-9T耐受的溫度范圍較窄，但它的耐酸堿能力和耐鹽能力范圍均比GH1-9T廣，這一突出的酸堿適應(yīng)性使得RB-38菌株在處理土壤及農(nóng)藥污染方面具有了更大的應(yīng)用潛質(zhì)。

2.3 百菌清降解基因的克隆及分布

將基因文庫(kù)得到的一萬(wàn)多株轉(zhuǎn)化子在百菌清液體篩選培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)三代，最終收集菌體點(diǎn)種于百菌清篩選固體培養(yǎng)基上，觀察透明圈產(chǎn)生情況，從而篩選具有百菌清降解功能的基因片段。篩選到的具有百菌清降解功能的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子編號(hào)838，提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子838的質(zhì)粒pU838再次轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行功能驗(yàn)證，效果如圖5。

對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒pU838測(cè)序分析，結(jié)果表明其插入片段為3 493 bp，通過(guò)NCBI BlastX和軟件DNAMAN5.2中的ORF finder的分析表明，這段序列上有3個(gè)ORF，且轉(zhuǎn)錄方向一致。其中ORF1編碼轉(zhuǎn)座酶，ORF2編碼ATP結(jié)合蛋白，ORF3編碼水解脫鹵酶。

經(jīng)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行Blast比對(duì)，ORF3編碼的氨基酸序列與sp. CTN-3中水解脫鹵酶氨基酸序列一致性達(dá)99%。推測(cè)發(fā)揮百菌清降解功能的應(yīng)該為此水解脫鹵酶（），推測(cè)百菌清在該酶的作用下苯環(huán)上的氯原子被水解，從而達(dá)到降解目的。

注：Escherichia coil ATCC 11775T為組外參照。

表4 菌株RB-38和標(biāo)準(zhǔn)菌株L.daejeonensis GH1-9T特征對(duì)比

注：GH1-9T為標(biāo)準(zhǔn)菌株 (standard strain)；+：陽(yáng)性反應(yīng); －：陰性反應(yīng)；W：微弱生長(zhǎng)。

Note:GH1-9Tis standard strain; +: positive reaction; －: negative reaction; W: weak growth.

圖5 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒pU838在大腸桿菌中的功能驗(yàn)證

針對(duì)ORF3的序列，設(shè)計(jì)特異引物，擴(kuò)增結(jié)構(gòu)基因，5′端引物P1（5′-AGAAAGCTTGACG ATGCCACTC-3′），引了I酶切位點(diǎn)，3′端引物P2 （5′-AAGTCTAGAGAGCAGGATCAAG GC-3′），引入了d III酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增產(chǎn)物與經(jīng)過(guò)相同酶切后的pUC19連接，使得結(jié)構(gòu)基因的起始密碼子在pUC19的啟動(dòng)子下融合表達(dá)，驗(yàn)證該閱讀框區(qū)域的功能，構(gòu)建的載體命名為pUchd。結(jié)果如圖6所示：大腸桿菌coil DH10B轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生了降解百菌清的透明圈，證明該開放閱讀框所編碼的水解脫鹵酶正是降解百菌清的功能酶，且該酶的表達(dá)不需要其他調(diào)控序列的存在。

進(jìn)一步對(duì)3個(gè)開放閱讀框之間的核苷酸序列分析表明在ORF1和ORF2兩側(cè)存在20 bp的反向重復(fù)序列，其中左側(cè)重復(fù)序列（IRL）為5′- AAAACTGGGCCACTTCGCGC-3′，右側(cè)重復(fù)序列（IRR）為5′-GCGCGAAGTGGCTCAGATTT-3′。這4個(gè)元件（IRL、ORF1、ORF2、IRR）之間的組成和排列關(guān)系與已知的IS21家族簡(jiǎn)單插入序列[31]具有典型的相似性，該家族插入元件均含有轉(zhuǎn)座酶編碼區(qū)、ATP-結(jié)合蛋白編碼區(qū)，并被2個(gè)簡(jiǎn)單的反向重復(fù)序列所包圍。IS21家族中，研究的比較多的是IS100，IS100的結(jié)構(gòu)特征于1994年就被Alexander等研究人員研究清楚，它全長(zhǎng)1 954 bp，兩端各有28 bp的反向重復(fù)序列，一個(gè)1 023 bp的轉(zhuǎn)座酶編碼區(qū)和一個(gè)783 bp的istB樣的ATP-結(jié)合蛋白的編碼區(qū)[32]。因此本研究在此也得到了一個(gè)IS21家族的新成員，定名其為IS-，其全長(zhǎng)1 926 bp，包含一個(gè)1 023 bp的轉(zhuǎn)座酶編碼區(qū)和一個(gè)657 bp的ATP-結(jié)合蛋白編碼區(qū)，兩端各有20 bp的反向重復(fù)序列。

注：2個(gè)箭頭均代表陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子E.coli DH101/pUchd。

為探索不同的百菌清降解菌中發(fā)揮降解作用的基因之間異同，本研究根據(jù)RB-38中已得到的序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物在序列中的位置及關(guān)系如圖7所示：P1，P2用于擴(kuò)增結(jié)構(gòu)基因，838上游P1，P2用于擴(kuò)增及上游序列。擴(kuò)增結(jié)果如圖8所示，供試菌中均可擴(kuò)增到與陽(yáng)性對(duì)照大小完全相同的條帶，選取部分陽(yáng)性條帶測(cè)序發(fā)現(xiàn)均為基因，然而并不是所有降解菌中都可以擴(kuò)增到與基因相連的上游序列，擴(kuò)增到上游序列的菌株有RB-4、RB-5、RB-13、RB-23、RB-24、RB-29，分別屬于假單胞菌屬和青枯菌屬。本研究分析發(fā)現(xiàn)，多株菌中百菌清降解酶基因均與簡(jiǎn)單插入序列IS-相連，組成一個(gè)代謝轉(zhuǎn)座子，因此推測(cè)該轉(zhuǎn)座子是百菌清降解酶基因水平轉(zhuǎn)移的分子基礎(chǔ)，百菌清降解基因在IS-的作用下水平轉(zhuǎn)移，并出現(xiàn)在多株降解菌中。

圖7 特異性引物的相對(duì)位置及關(guān)系示意圖

注：數(shù)字對(duì)應(yīng)于相應(yīng)的菌株序號(hào)RB-(N); Marker; 1kb plus DNA ladder

目前分離到的有機(jī)物降解菌分類廣泛，包括假單胞菌屬（）、無(wú)色桿菌屬（）、產(chǎn)堿菌株（）、屎擬桿菌（）、吉氏擬桿菌（）、芽孢桿菌屬（）、棒狀桿菌屬（）、土壤桿菌屬（）、黃桿菌屬（）、短桿菌屬（）、枝動(dòng)桿菌屬（）、黃孢原平革菌屬（）、曲霉屬（）、青霉屬（）、根霉屬（）、鐮刀菌屬（）、總狀共頭霉（）、諾卡氏菌屬（）、鏈霉屬（）等[11]。然而農(nóng)藥降解基因之間的保守性卻很高，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)李順鵬實(shí)驗(yàn)室分離到的7株甲基對(duì)硫磷降解菌分別為假單胞菌屬（）、無(wú)色桿菌屬（）、布魯氏菌（）和蒼白桿菌屬（），然而他們發(fā)揮降解作用的基因卻都是甲基對(duì)硫磷降解酶基因methyl parathion-degrading（gene）[12]。國(guó)內(nèi)外分離到了很多對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷及其他有機(jī)磷降解菌，他們分別屬于黃質(zhì)菌屬（），假單胞菌屬（），無(wú)色桿菌屬（）[13-15]，然而這些菌都合成有機(jī)磷農(nóng)藥水解酶基因organophosphorus pesticide degrading () gene，通過(guò)有機(jī)磷農(nóng)藥水解酶發(fā)生降解作用[33]。其中假單胞菌GM和黃質(zhì)桿菌sp. strain ATCC 27551中的基因完全相同，并與黃質(zhì)桿菌中該基因的同源性為98%。有機(jī)污染環(huán)境中污染物降解菌的多樣性及降解基因的保守性，揭示了污染環(huán)境中微生物之間也許存在著降解基因的交流。

目前已經(jīng)確定了3種基本的介導(dǎo)細(xì)菌間水平基因轉(zhuǎn)移的機(jī)制。細(xì)菌接合是依賴于細(xì)胞接觸的特定質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子從供體到受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移。自然轉(zhuǎn)化是在特定條件下細(xì)胞產(chǎn)生感受態(tài)并吸收自由DNA的過(guò)程。轉(zhuǎn)導(dǎo)是噬菌體介導(dǎo)的基因信息在供體和受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。一些試驗(yàn)現(xiàn)象和證據(jù)將研究者的思路引向了基因水平漂移的領(lǐng)域。首先人們發(fā)現(xiàn)進(jìn)化上相近的降解基因或基因簇其宿主菌的地理位置上很遠(yuǎn)[21]。而同一污染物不同菌株降解基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系與宿主菌16SrDNA的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系不一致。接著人們又發(fā)現(xiàn)降解有機(jī)污染物的基因與自轉(zhuǎn)移質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子等移動(dòng)基因元素相連：Siddavattam等[24]發(fā)現(xiàn)有機(jī)磷降解基因存在于一個(gè)類轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)中，張瑞福等[25]發(fā)現(xiàn)7株菌中甲基對(duì)硫磷基因都與簡(jiǎn)單插入序列IS6100緊密相連，同時(shí)降解基因或基因簇鳥嘌呤和胞嘧啶堿基對(duì)的摩爾含量與宿主菌的明顯不同，Hoffmann等[26]發(fā)現(xiàn)2,4-D降解菌P4a中降解基因的基因簇兩側(cè)有IS1071和IS1380兩個(gè)簡(jiǎn)單插入序列，組成一個(gè)30 kb（Kilobase，千堿基）的定位于染色體上的轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)。Top等[28]也研究了2,4-D降解質(zhì)粒在不同降解菌中的轉(zhuǎn)移作用及其對(duì)土壤中2,4-D降解的影響。因此宿主菌降解基因的水平轉(zhuǎn)移是造成降解菌多樣性及其環(huán)境適應(yīng)能力產(chǎn)生的很重要途徑。

3 結(jié) 論

本研究從百菌清生產(chǎn)車間，生產(chǎn)車間的綠化帶和連續(xù)施用百菌清的農(nóng)田表層采集土樣，利用稀釋平板法，在含有百菌清的平板上分離到14株百菌清降解菌，經(jīng)16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析將所有菌株鑒定到假單胞菌屬（）、無(wú)色桿菌屬（）、蒼白桿菌屬（）、青枯菌屬（）和溶桿菌屬（），并經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的鳥嘌呤和胞嘧啶堿基對(duì)的摩爾含量的測(cè)定、DNA-DNA雜交、化學(xué)鑒定及生理生化特征的鑒定最終將其中的2株鑒定到種的水平，為后續(xù)的工作奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)構(gòu)建了百菌清降解菌的基因組文庫(kù)，并從中克隆到了降解基因，初探了降解基因在污染環(huán)境中的多個(gè)菌株間水平轉(zhuǎn)移的分子基礎(chǔ)。本文的研究證明在百菌清污染的土壤中，微生物群落適應(yīng)污染的分子機(jī)制之一是百菌清降解基因在細(xì)菌間的水平轉(zhuǎn)移，降解基因的轉(zhuǎn)移使得部分細(xì)菌獲得了降解百菌清的能力，這是環(huán)境中百菌清降解菌多樣性產(chǎn)生的原因。然而并不是所有的降解菌降解能力的產(chǎn)生都是通過(guò)這種方式得到的，部分降解菌中雖然也有同樣的百菌清降解基因，但它們并沒(méi)有處在轉(zhuǎn)座元件的下游，這些基因有可能是降解菌本身就有的。因此對(duì)于該降解基因的起源還有待于進(jìn)一步的研究。

[1] Chu H, Gao G F, Ma Y, et al. Soil microbial biogeography in a changing world: Recent advances and future perspectives[J]. mSystems, 2020, 5(2): 1-12.

[2] Min H, Ye Y F, Chen Z Y, et al. Effects of butachlor on microbial populations and enzyme activities in paddy soil[J]. Journal of Environmental Sciences, 2001, 365: 581-595.

[3] Haque M N, Eom H J, Nam S E, et al. Chlorothalonil induces oxidative stress and reduces enzymatic activities of Na+/K+-ATPase and acetylcholinesterase in gill tissues of marine bivalves [J]. PLoS One. 2019, 14(4): 1-17.

[4] Ba?maga M, Wyszkowska J and Kucharski J. The influence of chlorothalonil on the activity of soil microorganisms and enzymes[J]. Ecotoxicology, 2018, 27(9): 1188-1202.

[5] Teng Y, Zhang M, Yang G, et al. Successive chlorothalonil applications inhibit soil nitrification and discrepantly affect abundances of functional genes in soil nitrogen cycling [J]. Environmental Science and Pollution Research International. 2017, 24(4): 3562-3571.

[6] Wu X, Cheng L, Cao Z, et al. Accumulation of chlorothalonil successively applied to soil and its effect on microbial activity in soil[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety. 2012, 81: 65-69.

[7] Devi Y B, Thounaojam Meetei T, Kumari N. Impact of pesticides on soil microbial diversity and enzymes: A review[J]. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 2018, 7(6): 952-958.

[8] 馮波，單敏，方華，等. 百菌清對(duì)土壤微生物數(shù)量和酶活性的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2006(3)：674-677.

Feng Bo, Shan Min, Fang Hua, et al. Effects of chlorothalonil on soil microbial populations and enzyme activities[J]. Journal of Agro-Environment Science, 2006(3): 674-677. (in Chinese with English abstract)

[9] Sigler W V, Turco R F. The impact of chlorothalonil application on soil bacterial and fungal populations as assessed by denaturing gradient gel electrophoresis[J]. Applied Soil Ecology, 2002, 21(2): 107-118.

[10] Yang X, Bennett B, Holz R C. Insights into the catalytic mechanism of a bacterial hydrolytic dehalogenase that degrades the fungicide chlorothalonil[J]. Journal of Biological Chemistry, 2019, 294(36): 13411-13420.

[11] 史秀珍. 百菌清降解菌的篩選及其降解特性研究[D]. 北京，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2007.

Shi Xiuzhen. Isolation and Characterization of A Chlorothalonil-Degrading Bacterium[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2007. (in Chinese with English abstract)

[12] Zhang R, Cui Z, Zhang X, et al. Cloning of the organophosphorus pesticide hydrolase gene clusters of seven degradative bacteria isolated from a methyl parathion contaminated site and evidence of their horizontal gene transfer[J]. Biodegradation, 2006, 17(5): 465-472.

[13] Ogbo F C. Conversion of cassava wastes for biofertilizer production using phosphate solubilizing fungi[J]. Bioresource Technology, 2010, 101: 4120-4124.

[14] Patel D K, Murawala P, Archana G, et al. Repression of mineral phosphate solubilizing phenotype in the presence of weak organic acids in plant growth promoting fluorescent[J]. Bioresource Technology, 2011, 102: 3055-3061.

[15] Horne I, Sutherland T D, Rebecca L, et al. Identification of an(organophosphate degradation) gene in an agrobacterium isolate[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68: 3371-3376.

[16] Liang B, Wang G, Zhao Y, et al. Facilitation of bacterial adaptation to chlorothalonil-contaminated sites by horizontal transfer of the chlorothalonil hydrolytic dehalogenase gene[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77(12): 4268-4272.

[17] Liang B, Li R, Jiang D, et al. Hydrolytic dechlorination of chlorothalonil by. CTN-11 isolated from a chlorothalonil-contaminated soil[J]. Current Microbiology, 2010, 61(3): 226-233.

[18] Atashgahi S, Liebensteiner M G, Janssen D B, et al. Microbial synthesis and transformation of inorganic and organic chlorine compounds[J]. Frontiers in Microbiology, 2018, 9: 1-21.

[19] Whyte L G, Smits T H, Labbe M D, et al. Gene cloning and characterization of multiple alkane hydroxylase systems inQ15 and NRRLB-16531[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68: 5933-5942.

[20] Chu H Y, Sprouffske K, Wagner A. Assessing the benefits of horizontal gene transfer by laboratory evolution and genome sequencing[J]. BMC Evolutionary Biology, 2018, 18(1): 1-21.

[21] Nielsen T K, Rasmussen M, Demanèche S, et al. Evolution of sphingomonad gene clusters related to pesticide catabolism revealed by genome sequence and mobilomics ofMH[J]. Genome Biology and Evolution. 2017, 9(9): 2477-2490.

[22] Muturi E J, Donthu R K, Fields C J, et al. Effect of pesticides on microbial communities in container aquatic habitats [J]. Scientific Reports, 2017(7): 1-10.

[23] Imperato V, Portillo-Estrada M, McAmmond B M, et al. Genomic diversity of two hydrocarbon-degrading and plant growth-promotingspecies isolated from the oil field of Bóbrka (Poland) [J]. Genes, 2019, 10(6): 1-22.

[24] Siddavattam D, Khajamohiddin S, Manavathi B, et al. Transposon-like organization of the plasmid-borne organophosphate degradation (opd) gene cluster found insp[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69: 2533-2539.

[25] 張瑞福，戴青華，何健，等. 七株有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的降解特性比較[J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué)，2004(5)：584-587.

Zhang Ruifu, Dai Qinghu, He Jian, et al. Comparison of degrading characteristics of seven organophosphate pesticide-degrading bacteria[J]. China Environmental Science, 2004(5): 584-587. (in Chinese with English abstract)

[26] Hoffmann D. A transposon encoding the complete 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid degradation pathway in the alkalitolerant strainP4a[J]. Microbiology, 2003, 149(9): 2545-2556.

[27] Top T, Courde L, McGowan C, et al. Phylogenetic analyses indicate independent recruitment of diverse gene cassettes during assemblage of the 2, 4-D catabolic pathway[J]. FEMS Microbiology Ecology, 1999, 28: 373-382.

[28] Top E M, Springael D, Boon N. Catabolic mobile genetic elements and their potential use in bioaugmentation of polluted soils and waters[J]. Fems Microbiology Ecology, 2002, 42(2): 199-208.

[29] Jin H, Zhou Y, Liu H, et al. Paenibacillus jilunlii sp. nov., a nitrogen-fixing species isolated from the rhizosphere of Begonia semperflorens[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2011, 61: 1350-1355.

[30] Hinchliff C E, Smith S A, Allman J F, et al. Synthesis of phylogeny and taxonomy into a comprehensive tree of life[J]. Proceedings of the National Academy of Ences of the United States of America, 2015, 112(41): 12764-12769.

[31] Kim B J, Kim K, Kim B R, et al. Identification of ISMyo2, a novel insertion sequence element of IS21 family and its diagnostic potential for detection of Mycobacterium yongonense[J]. BMC Genomics, 2015, 16: 1-9.

[32] Lima-Mendez G, Oliveira A D, Ross K, et al. Toxin-antitoxin gene pairs found in Tn3 family transposons appear to be an integral part of the transposition module[J]. mBio, 2020, 11(2): 1-19.

[33] Trinder M, McDowell T W, Daisley B A, et al.reduces organophosphate pesticide absorption and toxicity to drosophila melanogaster[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2016, 82(20): 6204-6213.

Isolation, identification and functional gene analysis of chlorothalonil degrading bacteria

Ren Xiaojie1,2, He Zhuangzhuang1, Shan Xin1, Zhao Yubin3, Song Yuanda1, Zhao Xinhe1,3,4※

(1255000,; 2...,253000,;3...,276400,; 4.,401123,)

Chlorothalonil (2, 4, 5, 6-tetrachloroisophthalonitrile, TPN) was used as a broad-spectrum and non-systemic fungicide in China. However, this pesticide has been classified as a “probable human carcinogen” by the U.S. Environment Protection Agency (US EPA), due to its highly toxic to birds, fish, and aquatic invertebrates. Alternatively, bioremediation can be expected to degrade, even remove organic pollutants, with the promising application prospects. The diversity of in situ degrading bacteria in a polluted environment is critical to evaluate environmental toxicology, biodegradability, self-purification ability, and remediation potential of pollutants. In this study, an attempt was made to apply the biodegradation for the control of pollution. Firstly, the soil samples were collected from the long-term chlorothalonil-contaminated field. Fourteen chlorothalonil-degrading bacteria producing transparent halos were isolated using the plate culture and chlorothalonil-selective medium. Using the morphology and 16S rDNA homology, the bacteria were then classified to genussp.,sp.,sp.,sp. andsp.sp. The RB-31and RB-38were newly discovered strains with chlorothalonil degradation ability. Two strains were determined into species level as. And their specific physiological properties were studied. Secondly, the genomic library of strainRB-38 was successfully constructed in the pUC19 vector usingcoil DH10B as the host strain, where about 10 000 clones were obtained from selective culture. A 3 494 bp of desired fragment was isolated from the library using the functional ability to degrade chlorothalonil. In the desired fragment, three open reading frames (ORFs) were tentatively identified by ORF findings and BLAST alignment on NCBI. Specifically, ORF3 encoded a hydrolytic dehalogenase. Through subcloning of this reading frame, it was proved that the degradation function of chlorothalonil was catalyzed by the enzyme encoded in this region, and no other regulation regions were required for its expression. Two ORFs upstream ofgene showed that ORF1 encoded a transposase, whereas, ORF2 encoded on IstB-like ATP-binding protein. Two ORFs were flanked by 20 bp terminal inverted repeat sequences (IR). The complete sequence presented a perfect structural similarity to IS21 transposon family members that all contain transposase coding region, ATP-binding protein coding region, and flanked by inverted repeat sequences. A new member of this family was discovered and designated as IS. Thegene was closely associated with the insertion sequence, to construct a catabolic transposon. Finally, thegene and the upstream ISfragment were cloned and identified from several genomic DNA of chlorothalonil-degrading bacteria using a PCR strategy. It infers that the sequence element of ISwas the molecular basis for the horizontal transfer in thegenes, leading that the gene exchange can occur among these degrading species. This study can enrich the chlorothalonil-degrading bacterial library, and to clone hydrolytic enzyme genes that played a key role in degrading from the genetic level. A dispersing mechanism of degrading gene was also proposed among different genus bacteria. This preliminarily clarified the functional gene and its distribution in degrading bacteria.

soils; pesticides; bacteria; gene cloning; horizontal drift

任曉潔，賀壯壯，單昕，等. 百菌清降解菌的分離鑒定及功能基因分析[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2020，36(19)：209-216. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.19.024 http://www.tcsae.org

Ren Xiaojie, He Zhuangzhuang, Shan Xin, et al. Isolation, identification and functional gene analysis of chlorothalonil degrading bacteria[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(19): 209-216. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.19.024 http://www.tcsae.org

10.11975/j.issn.1002-6819.2020.19.024

S482.2

A

1002-6819(2020)-19-0209-08

2020-05-30

2020-09-13

重慶市技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用發(fā)展重點(diǎn)項(xiàng)目（cstc2019jscx-gksbX0113）；國(guó)家博士后基金面上項(xiàng)目（2019M662362）；山東省自然科學(xué)基金博士項(xiàng)目（ZR2019BC099）；國(guó)家博士后基金面上項(xiàng)目（2019M650167）；山東省博士后創(chuàng)新項(xiàng)目（201902048）

任曉潔，博士，講師，主要從事發(fā)酵工程方面的研究。Email：renxiaojie2020@163.com

趙新河，博士，講師，主要從事發(fā)酵工程方面的研究。Email：zhaoxinhe@sdut.edu.cn