一組與限制酶有關(guān)的疑難問題分析

（廣東省汕頭市澄海蘇北中學(xué) 廣東汕頭 515829）

限制性核酸內(nèi)切酶是一類在DNA分子特定部位的兩個(gè)脫氧核糖核苷酸之間的磷酸二酯鍵進(jìn)行切割的酶，簡(jiǎn)稱限制酶。根據(jù)限制酶的結(jié)構(gòu)，輔助因子的需求切位與作用方式，可將限制酶分為Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ三種類型。Ⅰ型限制性內(nèi)切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；Ⅱ型限制性內(nèi)切酶只催化非甲基化的DNA的水解；Ⅲ型限制性內(nèi)切酶同時(shí)具有修飾及認(rèn)知切割的作用。由于Ⅱ型限制性內(nèi)切酶所識(shí)別的位置多為短的回文序列（palin?drome sequence），所剪切的堿基序列通常即為所識(shí)別的序列，所以是基因工程上實(shí)用性較高的限制酶種類，如EcoRⅠ、HindⅢ。

1 區(qū)分限制酶、DNA連接酶、DNA酶和DNA聚合酶的方法

限制酶、DNA連接酶、DNA酶和DNA聚合酶是一組易于混淆的概念，原因是它們的作用均與脫氧核苷酸鏈上的磷酸二酯鍵有關(guān)。限制酶和DNA酶均可剪切磷酸二酯鍵，DNA連接酶和DNA聚合酶均可催化形成磷酸二酯鍵。限制酶和DNA連接酶用于剪切或連接DNA鏈（或片段），DNA酶和DNA聚合酶用于剪切或連接游離的脫氧核苷酸分子。在明確了以上聯(lián)系和區(qū)別后，教師可以引導(dǎo)學(xué)生構(gòu)建如圖1所示知識(shí)模型來幫助理解和掌握。

2 限制酶具有的存在特點(diǎn)和作用特點(diǎn)

限制酶主要是從原核生物中分離出來的，迄今已經(jīng)從近300多種不同的微生物中分離出約4 000種限制酶。限制酶在細(xì)菌細(xì)胞中普遍存在，幾乎在所有細(xì)菌的屬、種中都發(fā)現(xiàn)至少一種限制酶，多者在一屬中就有幾十種，例如在嗜血桿菌屬中（Haemophilus）現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的就有22種。有的菌株含酶量極低，很難分離定性；然而在有的菌株中，限制酶含量極高。如E.coli的pMB4（EcoRⅠ酶）和H.aegyptius（HalⅢ酶）就是高產(chǎn)酶菌株。據(jù)報(bào)道從10g的H.aegyptius的細(xì)胞中，就能分離提純出可剪切破壞l0 g λ噬菌體DNA的酶量。到目前為止，細(xì)菌是限制酶，尤其是特異性非常強(qiáng)的Ⅰ類限制酶的主要來源。

限制酶能特異性識(shí)別DNA序列中的回文序列并進(jìn)行剪切。有些限制酶的切割位點(diǎn)在回文的一側(cè)（如EcoRⅠ、BamHⅠ、Hind等），因而可形成黏性末端。另一些限制酶如AluⅠ、BsuRⅠ、BalⅠ、HalⅢ、HPaⅠ、SmaⅠ等，切割位點(diǎn)在回文序列中間，形成平末端。

3 不同種的限制酶識(shí)別的序列？

并非不同種類的限制酶一定識(shí)別不同的序列。有很多來源不同的限制酶有相同的堿基識(shí)別順序，這些種類的酶稱為異源同功酶。需要注意的是這些酶雖然有相同的識(shí)別序列，但它們的切點(diǎn)并不完全一樣。例如，XmaⅠ和SmaⅠ都識(shí)別六核苷酸CCCGGG，但XmaⅠ的切點(diǎn)在C↓CCGGG，而EmaⅠ的切點(diǎn)則在CCC↓GGG，前者切割DNA分子，形成帶有CCGG黏性末端的DNA片段，而后者則會(huì)形成平末端。當(dāng)然，也有識(shí)別序列和切點(diǎn)都相同的酶，如HapⅡ、HpaⅡ、MnoⅠ，都能識(shí)別序列CCGG且具有相同的切點(diǎn)。

4 宿主細(xì)胞的限制酶不會(huì)破壞自身DNA分子的原因

限制酶的限制作用實(shí)際就是一種通過限制性降解外源DNA來維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制。限制酶一般不會(huì)剪切自身DNA的原因，可能是不包含被自身限制酶識(shí)別的序列，也可能是通過甲基化修飾作用使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化來避免被識(shí)別，達(dá)到保護(hù)自身遺傳物質(zhì)的目的。例如，能產(chǎn)生防御病毒侵染的限制酶的細(xì)菌，其自身的基因組中雖然有該限制酶識(shí)別的序列，但是該識(shí)別序列或酶切位點(diǎn)被甲基化酶甲基化了。當(dāng)然也并不是說只要甲基化，所有限制酶就都不能切割。大多數(shù)限制酶對(duì)DNA甲基化敏感，因此當(dāng)限制酶目標(biāo)序列與甲基化位點(diǎn)重疊時(shí)，對(duì)酶切的影響實(shí)際上有3種可能，即不影響、部分影響、完全阻止。對(duì)甲基化DNA的切割能力是限制酶內(nèi)在的和不可預(yù)測(cè)的特性。因此，在基因工程中為了有效地切割DNA，必須同時(shí)考慮DNA甲基化和限制酶對(duì)該類型甲基化的敏感性。

5 基因工程中為通常要使用兩種或以上的限制酶的原因，以及不同限制酶的切割特點(diǎn)

基因工程操作步驟剪切目的基因片段和運(yùn)載體時(shí)，通常需要使用兩種或以上的限制酶，主要原因是在重組基因表達(dá)載體時(shí)，必須將目的基因片段“定向”拼接在啟動(dòng)子和終止子之間。另外，使用兩種限制酶剪切可以避免載體或目的基因片段的自環(huán)化，提高重組效率?？紤]到運(yùn)載體上標(biāo)記基因的保護(hù)、可供選擇的限制酶的種類限制等因素，可能需要兩種或以上的限制酶分別處理質(zhì)粒和包含目的基因的DNA片段。

理解清楚以上幾個(gè)問題后，對(duì)于分析與限制酶有關(guān)的基因工程等相關(guān)題目有很大的幫助。

【例1】某質(zhì)粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三種限制酶切割位點(diǎn)，同時(shí)還含有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素基因。利用此質(zhì)粒獲得轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草的過程如圖2所示。

在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，應(yīng)選用_____________兩種酶對(duì)_____________進(jìn)行切割，以保證重組DNA序列的唯一性。

解析：考慮到BamHⅠ會(huì)破壞目的基因，所以應(yīng)選用剩余的兩種酶：HindⅢ、SalⅠ。從題目信息可以看出，選擇兩種限制酶可以保證重組DNA序列的唯一性：即可避免質(zhì)粒的自環(huán)化提高重組率，又能保證目的基因的定向連接。

【例2】研究人員將抗鹽基因轉(zhuǎn)入普通煙草培育出抗鹽煙草，該過程所用的質(zhì)粒與含抗鹽基因的DNA上相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)分別如圖3、圖4所示。限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、BclⅠ、Sau3AⅠ、HindⅢ，它們識(shí)別的堿基序列和酶切位點(diǎn)分別為G↓GATCC、T↓GATCA、↓GATC、A↓AGCTT。圖5表示該過程中利用含目的基因的農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化作用的示意圖。請(qǐng)回答下列問題。

用圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，應(yīng)選用________限制酶切割質(zhì)粒，選用_______限制酶（一種）切割含目的基因的DNA片段。

解析：在圖3中找到啟動(dòng)子和終止子，明確目的基因插入的區(qū)段后，對(duì)相關(guān)限制酶進(jìn)行判斷：若使用HindⅢ處理，會(huì)將終止子后面的位置也切斷，造成產(chǎn)生的載體片段只包含啟動(dòng)子或終止子，排除；若使用Sau3AⅠ處理，由于其識(shí)別的序列↓GATC與BamHⅠ、BclⅠ所識(shí)別的序列G↓GATCC、T↓GATCA出現(xiàn)重疊，兩種抗生素抗性基因均會(huì)被破壞，排除；故而只能使用BamHⅠ處理。在圖4中選擇一種限制酶切出基因片段有兩種方案，HindⅢ或Sau3AⅠ，考慮到質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ處理后產(chǎn)生的黏性末端為GATC，與HindⅢ處理后產(chǎn)生的黏性末端AGCT不符，而與Sau3AⅠ處理后產(chǎn)生的黏性末端相同，故只能選用Sau3AⅠ。

從題干信息不難看出，不同限制酶是可以在同一位點(diǎn)進(jìn)行切割的，如Sau3AⅠ就可以對(duì)BamHⅠ或BclⅠ識(shí)別的序列進(jìn)行同位點(diǎn)切割。

本題情景要求分別使用不同種類的限制酶處理質(zhì)粒和包含目的基因的DNA片段，需要考慮的問題較大，故而難度較大。

6 通過不同限制酶切割結(jié)果判斷DNA酶切圖譜的方法

在已知DNA分子長(zhǎng)度的情況下，結(jié)合限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段長(zhǎng)度，判斷切割位點(diǎn)的數(shù)量；進(jìn)一步結(jié)合兩種或多種酶同時(shí)處理后產(chǎn)生的DNA片段長(zhǎng)度，判斷出具體的DNA酶切圖譜。

需要注意的是使用一種限制酶處理后若DNA分子長(zhǎng)度不變，可能是因?yàn)椴话R(shí)別序列，也可能切割的是只包含一個(gè)酶切位點(diǎn)的環(huán)狀DNA分子。

【例3】現(xiàn)有一長(zhǎng)度為1 000堿基對(duì)的DNA分子，用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ酶切后得到的DNA分子仍是1 000 bp，用KpnⅠ單獨(dú)酶切得到400 bp和600 bp兩種長(zhǎng)度的DNA分子，用EcoRⅠ、KpnⅠ同時(shí)酶切后得到200 bp和600 bp兩種長(zhǎng)度的DNA分子。下圖中表示該DNA分子的酶切圖譜正確的是 （ ）

解析：由于用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ酶切后得到的DNA分子仍是1 000 bp，且4個(gè)選項(xiàng)中均有EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，判斷為環(huán)狀DNA分子，排除A、B選項(xiàng)；用KpnⅠ單獨(dú)酶切得到4 00 bp和6 00 bp兩種長(zhǎng)度的DNA分子，說明在環(huán)狀DNA上有兩個(gè)KpnⅠ酶切位點(diǎn)，確定選擇D選項(xiàng)?？梢允褂脳l件用EcoRⅠ、KpnⅠ同時(shí)酶切后得到2 00 bp和6 00 bp兩種長(zhǎng)度的DNA分子對(duì)判斷進(jìn)行檢驗(yàn)。

【例4】現(xiàn)有一長(zhǎng)度為3 000堿基對(duì)的線性DNA分子，用限制性核酸內(nèi)切酶酶切后，進(jìn)行凝膠電泳，使降解產(chǎn)物分開。用酶H單獨(dú)酶切，結(jié)果如圖6A所示。用酶B單獨(dú)酶切，結(jié)果如圖6B所示。用酶H和酶B同時(shí)酶切，結(jié)果如圖6C所示。該DNA分子的結(jié)構(gòu)及其酶切圖譜是 （ ）

解析：通過圖6A電泳結(jié)果可知酶H在該線性DNA分子上只有一個(gè)酶切位點(diǎn)，由圖6B可知酶B在該線性DNA分子上有兩個(gè)酶切位點(diǎn)，僅根據(jù)這兩個(gè)結(jié)果是無法判斷酶H和酶B的切割位點(diǎn)關(guān)系的，如圖7所示的兩種情況都符合要求。

所以用酶H和酶B同時(shí)酶切就成為判斷兩種酶切位點(diǎn)的必要條件。由圖6C可知，同時(shí)使用兩種酶切產(chǎn)生的降解產(chǎn)物為1 400 bp、600 bp、400 bp，可確定為選項(xiàng)A。