巖黃連與抗生素配伍后對金黃色葡萄球菌體外抑菌效果的比較

孫桃桃，蔣 平，鐘枝梅，方 妍，楊雨晴，單浩浩，左瑞華

（1.皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，安徽，六安237012；2.安徽省中藥資源保護(hù)與持續(xù)利用工程實(shí)驗(yàn)室，安徽，六安237012）

近年來，抗生素藥物的快速發(fā)展和廣泛使用，使細(xì)菌性感染類疾病在治療過程中出現(xiàn)了很多問題，如細(xì)菌耐藥性和耐藥菌的傳播等[1]。何源等[2]對重慶市生牛乳中金黃色葡萄球菌耐藥譜調(diào)查發(fā)現(xiàn)，檢出的金黃色葡萄球菌對于青霉素G、紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、頭孢他啶、苯唑西林、頭孢喹肟、諾氟沙星、環(huán)丙沙星等均有不同程度的耐藥，其中對青霉素G 耐藥性最強(qiáng)，高達(dá)89.19%，其次為紅霉素、克林霉素，分別為62.16%，60.16%，而四重耐藥的金黃色葡萄球菌高達(dá)35.14%?？梢娂?xì)菌耐藥性之嚴(yán)重，導(dǎo)致在臨床中可用的抗生素種類越來越少。

雖然抗菌中藥的使用，可以有效緩解細(xì)菌耐藥性等問題，但由于中藥的抗菌效率不及抗生素，導(dǎo)致其在臨床抗感染過程中很少單獨(dú)使用；而大多與抗生素一起聯(lián)合應(yīng)用于抗感染治療。謝思露等[3]研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊賓和青霉素聯(lián)合用藥，對金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的抑菌有相加作用，水飛薊賓和紅霉素聯(lián)合用藥對金黃色葡萄球菌的抑菌有相加作用，對表皮葡萄球菌的抑菌效果有協(xié)同作用。這說明中藥與西藥聯(lián)用可以有效增強(qiáng)臨床抗菌藥效，降低抗生素的使用量。但是在臨床應(yīng)用時(shí)應(yīng)注意中藥和西藥之間的配伍效應(yīng)。

巖黃連為罌粟目罌粟科中草藥，具有清熱解毒、利濕、止痛止血等功效，對腹瀉、痢疾等疾病有很好療效。同時(shí)也有研究報(bào)道，巖黃連內(nèi)的巴馬汀成分對腸道致病菌和化膿性球菌也有明顯抑菌作用[4]。但是，巖黃連對金黃色葡萄球菌的抑菌效果及其與抗生素的聯(lián)合抑菌效果卻不知曉。因此，本試驗(yàn)主要探究巖黃連及其與抗生素的聯(lián)合用藥后對金黃色葡萄球菌抑菌效果，以期對細(xì)菌性疾病的治療提供參考。

1 材料

1.1 菌種

金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株（CMCC 26112），由北京豫鼎鑫捷科技有限公司惠贈。

1.2 藥品和試劑

巖黃連，購自成都潽禧草堂；注射用青霉素鈉，批號:H45021515，購自于桂林南藥股份有限公司；注射用頭孢拉定，批號：H20067737，購自于山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司；注射用磷霉素鈉，批號H43020770，購自于湖南科倫制藥有限公司；左氧氟沙星，批號：170714022-A，購自六安華源制藥有限公司。LB瓊脂，批號：20171030-00，杭州微生物試劑有限公司；LB液體，批號：20170921，青島海博生物科技有限公司；MH 瓊脂，貨號：HB6232，青島海博生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 巖黃連藥液的制備

取適量干燥的巖黃連飲片，研磨，過80目篩，準(zhǔn)確稱取巖黃連粉末50 g 置于燒杯中，加250 mL純水，混勻，浸泡30 min，進(jìn)行2次水提，合并2次濾液，離心除質(zhì)，減壓濃縮，加水定容，使巖黃連生藥濃度為1 g/mL，高壓滅菌，置于4 ℃保存。

2.2 抗生素工作液的配制

將頭孢拉定、磷霉素鈉和青霉素用生理鹽水配成終濃度為0.5 mg/mL。而左氧氟沙星原液濃度為0.5 mg/mL。

2.3 培養(yǎng)基的配制

根據(jù)說明書配置LB瓊脂培養(yǎng)基和LB肉湯培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)PH，高壓滅菌；量取配好的MH瓊脂培養(yǎng)基5 mL 于離心管中，高壓滅菌后，備用。

2.4 懸菌液的制備

按照四區(qū)劃線法將活化的金黃色葡萄球菌菌液接種到LB瓊脂培養(yǎng)基上，37℃，培養(yǎng)24 h，使用接種針挑取1～2個(gè)細(xì)菌菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，在恒溫條件下，搖床搖動24 h。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將金黃色葡萄球菌濃度稀釋到1.5×105CFU/mL。

2.5 最小抑菌濃度（MIC）測定

按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室國家標(biāo)準(zhǔn)委員會（NCCLS）推薦的方法，向已滅菌的MH瓊脂培養(yǎng)基中加入抗生素工作液和巖黃連藥液，使得抗生素終濃度為：16、8、4、2、1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625 μg/mL，巖黃連藥液的終濃度為320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25 mg/mL。每次實(shí)驗(yàn)分別作3個(gè)陰性對照和陽性對照組?；靹?，加入到6孔板里，待冷凝備用。

分別向含藥培養(yǎng)基和陽性對照組各孔中加入100 μL 菌液（1.5×105CFU/mL），陰性對照組加入等量的生理鹽水。涂布后，37℃培養(yǎng)，24 h 后觀察試驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)以無金黃色葡萄球菌生長的濃度為MIC。每個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)，每個(gè)濃度也做3次重復(fù)。

2.6 體外聯(lián)合抑菌試驗(yàn)（FIC）

采用棋盤稀釋法來分別測定巖黃連藥液與頭孢拉定、左氧氟沙星、青霉素、磷霉素聯(lián)合使用時(shí)對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，以各藥單測時(shí)MIC值的2倍、1倍、0.5倍、0.25倍、0.125倍組合，測定步驟同“2.5最小抑菌濃度( MIC)測定”。并按照下面FIC計(jì)算公式計(jì)算其FIC，每個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，每個(gè)濃度也做3次重復(fù)。

表1 配伍效應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)[5]Table 1 Classification standard of compatibility of medicines

3 結(jié)果

如表2所示，頭孢拉定、左氧氟沙星、青霉素、磷霉素、巖黃連藥液對金黃色葡萄球菌的MIC分別為1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、20 mg/mL。根據(jù)FIC值的判斷標(biāo)準(zhǔn)，巖黃連與磷霉素聯(lián)用后1＜FIC 2≦，表現(xiàn)為無關(guān)作用；巖黃連與頭孢拉定、青霉素、左氧氟沙星聯(lián)用后FIC 0.5≦ ，表現(xiàn)為協(xié)同作用。

表2 巖黃連與四種抗生素聯(lián)合用藥時(shí)對金黃色葡萄球菌體外抑菌作用Table 2 Inhibitory effect of CSB combined with four antibiotics on Staphylococcus aureus in vitro

4 討論

巖黃連，其味苦、性涼，具有清熱解毒、利濕、止痛止血等功效，對腹瀉、痢疾、口舌糜爛等病癥具有很好療效。王奇志等[6]研究發(fā)現(xiàn)，巖黃連中含有去氫巖黃連堿、小檗堿、巴馬汀、黃連堿等成分。Aghayan 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿和巴馬汀對燒傷后感染的銅綠假單胞菌具有明顯的抑制作用。Severina 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿和巴馬汀能通過金黃色葡萄球菌菌膜的多抗藥性泵，從而達(dá)到抑制金黃色葡萄球菌生長的作用。這也表明巖黃連具有抗菌抑菌的作用。本研究結(jié)果表明，巖黃連的MIC為20 mg/mL，具有相對高效的抑菌效果。

雖然中藥具有相對高效的抑菌效果，但是由于多數(shù)中藥在臨床抑菌抗菌方面起效慢，很難進(jìn)行大面積的推廣應(yīng)用。中西藥聯(lián)合使用可以有效解決中藥起效慢等問題。李學(xué)思等[9]研究發(fā)現(xiàn)，青霉素G與黃芩、黃連素等聯(lián)用具有較好抑制金黃色葡萄球菌的作用；羅開碧等[10]用黃連、三七、蒲公英等中草藥與抗生素聯(lián)用治療豬圓環(huán)病毒與細(xì)菌混合感染，結(jié)果使治愈率提高5.55%，表明中藥能有效增強(qiáng)抗生素的臨床療效，或二者之間具有較好的協(xié)同作用。本研究結(jié)果表明，巖黃連與青霉素、頭孢拉定、左氧氟沙星聯(lián)用后表現(xiàn)為協(xié)同作用；巖黃連與磷霉素聯(lián)用后表現(xiàn)為無關(guān)作用。

雖然中西藥聯(lián)用有許多優(yōu)勢，但是不合理的中西藥結(jié)合使用反而會產(chǎn)生藥效拮抗、增強(qiáng)毒性、不良反應(yīng)等，這給臨床上會帶來很大的危害[11]。韓瑩等[11]發(fā)現(xiàn)，洋金花等與強(qiáng)心苷類藥物聯(lián)用易引起患者中毒。陳四玉等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，清開靈與頭孢曲松鈉聯(lián)用后對金黃色葡萄球菌的抑制呈拮抗作用。研究表明不合理的中西藥聯(lián)合應(yīng)用不僅危害機(jī)體的健康，而且會增加患者的經(jīng)濟(jì)成本，造成資源的浪費(fèi)。因此，中西藥聯(lián)用要更加科學(xué)、合理、規(guī)范。