藥用植物白芨塊莖揮發(fā)油組分的GC-MS分析及成分鑒定

*熊光華，周細(xì)根，肖 鳳

(1.井岡山大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展研究院，江西，吉安343009；2.井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西，吉安343009；3.井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江西，吉安 343009）

白芨（Bletilla striata），又名連及草或甘根，為蘭科白芨屬多年生藥用植物，廣泛分布于我國長江流域各省，其中以貴州產(chǎn)量最大，其質(zhì)量最好[1-2]。白芨始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，1963年以后各版的藥典中均有收載[3]。近年來，醫(yī)藥科學(xué)工作者對(duì)白芨的藥理作用、化學(xué)成分進(jìn)行了研究，證明白芨具有收斂止血、清熱利濕、通竅止痛、消腫生肌等功效，常用于治療結(jié)核咳血、外傷出血、燒燙傷、手足皸裂等癥[4-5]。當(dāng)前國內(nèi)外對(duì)白芨活性成分的研究主要集中在三萜類、多糖、甾體及其皂苷等方面，其藥用部位多為塊莖[6-7]。白芨塊莖的揮發(fā)性成分復(fù)雜且生物活性成分豐富，其很多組分具有緩解疲勞、鎮(zhèn)靜止疼、抗菌抗炎、抗氧化、提高免疫等多種生物學(xué)功能，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)、食品保健和日化工業(yè)等眾多領(lǐng)域，已成為當(dāng)前學(xué)者們研究的熱點(diǎn)之一[8-9]。

氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）聯(lián)用法是分析揮發(fā)性成分的一種重要測(cè)定手段，其具有高靈敏度、檢測(cè)時(shí)間短、分辨能力強(qiáng)、分離效率高和定性專屬性強(qiáng)的諸多優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于小分子和易揮發(fā)成分的分析，近年來在中藥農(nóng)殘、環(huán)境分析和醫(yī)藥研發(fā)等多個(gè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[10-11]。由于藥用植物白芨具有良好的應(yīng)用前景，同時(shí)關(guān)于白芨所含揮發(fā)性化學(xué)成分的研究目前還鮮有報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)擬提取白芨塊莖的揮發(fā)性油組分，利用GC-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)其揮發(fā)性成分進(jìn)行分離測(cè)定，并結(jié)合計(jì)算機(jī)質(zhì)譜檢索技術(shù)對(duì)揮發(fā)性組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

白芨植株于2020年3月采自于貴州省正安縣野外山區(qū)。挑選生長健康、無腐爛變質(zhì)的地下根莖部分，切取后同時(shí)加入變色硅膠密封保存于PE塑封袋內(nèi)，目的為防止樣品揮發(fā)性組分損失影響實(shí)驗(yàn)測(cè)定。實(shí)驗(yàn)樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后首先經(jīng)自來水清洗干凈后，然后經(jīng)硅膠脫水陰干、陶瓷研缽研磨粉碎、過40目網(wǎng)篩后密封于干燥潔凈的樣品瓶中，保存于-4 ℃冰箱中備用。

1.2 揮發(fā)性成分的提取

準(zhǔn)確稱取5 g 干燥的白芨塊莖粉末，分別用50 mL 二氯甲烷連續(xù)萃取3次。每次萃取適度搖動(dòng)15 min，而后靜置30 min，合并萃取液。然后，萃取液用揮發(fā)油提取器采用水蒸氣蒸餾法提取至揮發(fā)油量不再增加，經(jīng)30 g 無水硫酸鈉脫水過濾后，再用旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器濃縮，最后經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣瓶內(nèi)，供GC-MS實(shí)驗(yàn)備用。

1.3 GC-MS條件的優(yōu)化

氣相色譜條件：色譜柱為Agilent HP-5 GC毛細(xì)管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度為200℃；載氣為高純氦氣（>99.999%）；載氣流速為1 mL/min；進(jìn)樣量為1.0 μL；升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟?0 ℃，保持1 min 后，以3 /min℃ 升溫至110 ℃，保持1 min；再以20 /min℃ 升溫至220℃，保持1 min；再以5 /min℃ 升溫至250 ℃，保持4 min。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊（Elector ionization，EI）；電子能量為70 e V；離子源溫度：220 ℃；接口溫度：260 ℃；溶劑延遲時(shí)間為3 min；質(zhì)量分析器為三重四級(jí)桿；掃描模式為全掃描（Scan）；質(zhì)量掃描范圍為35～650 amu。

1.4 揮發(fā)性成分的定性定量分析

對(duì)得到的質(zhì)譜圖采用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫NIST 2018（National Institute of Standards and Technology）中成分的保留時(shí)間進(jìn)行檢索，再結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)資料進(jìn)行綜合分析，對(duì)檢索的主要揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定，初步確定其分子式及化學(xué)結(jié)構(gòu)。然后，再通過峰面積歸一化法確定揮發(fā)性成分各組分的相對(duì)百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 白芨揮發(fā)油的提取和GC-MS 條件的優(yōu)化

白芨塊莖粉末（5 g）經(jīng)二氯甲烷萃取后，以水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油組分，分離水油混合物經(jīng)無水硫酸鈉干燥后，得到有特殊香味的黃色油狀液體揮發(fā)油，得率約為0.35%。然后，揮發(fā)油經(jīng)濾膜過濾并稀釋后供GC-MS實(shí)驗(yàn)使用。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)色譜條件的優(yōu)化，使各組分均得到了較好的分離，優(yōu)化后的氣相色譜總離子流圖如圖1所示。然后，結(jié)合NIST質(zhì)譜圖庫檢索技術(shù)對(duì)分離的化合物進(jìn)行比對(duì)鑒定，同時(shí)利用色譜峰面積歸一化法測(cè)定了各成分的相對(duì)含量。

圖1 白芨塊莖揮發(fā)性組分的總離子流圖。Fig.1 Total ion currents (TICs) of volatile components in the tubers of Bletilla striata

2.2 樣品成分分析

從表1可以看出，在藥材植物白芨塊莖中共檢測(cè)到34種微量成分，包括10種醇、6種醛、4種酸、2種酮、7種烷烴、4種吡嗪、4種苯的衍生物和1種酯。其中，含量較高的化合物主要有醛類、醇類、酸類和苯的衍生物，其分別占總量的50.03%、19.22%、14.43%、10.24%。相對(duì)含量較高的組分有3-甲基丁醛（48.63 %）、乙酸（13.62%）、3-甲基-1-丁醇（12.26%）和4-氨基-3-甲基苯酚（8.94%）等。

表1 白芨塊莖揮發(fā)性成分的鑒定結(jié)果Table 1 Identification of volatile components in the tubers of B. striata

3 討論

道地藥材白芨為多年生草本植物，其主要產(chǎn)自貴州、四川、云南、湖南、湖北、浙江、江西等省份[12]。藥理活性研究表明，白芨具有消腫止血、增強(qiáng)免疫、抗菌抗炎、抗氧化、抗?jié)兒涂鼓[瘤等多種生物學(xué)活性，具有較高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[13-15]。另外有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，白芨膠具有活血止血作用，例如對(duì)家兔靜脈注射2%白芨膠液可顯著縮短其凝血時(shí)間，并加速紅細(xì)胞沉降率[16]。同時(shí)體外研究發(fā)現(xiàn)，白芨多糖能夠誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，且對(duì)小鼠的肝損傷有預(yù)防保護(hù)作用[17]。

白芨藥用部位多為塊莖。由表1分析可知，白芨塊莖中所含的最主要揮發(fā)性組分為3-甲基丁醛（異戊醛，48.63 %）。文獻(xiàn)資料表明，異戊醛天然存在于柑桔、檸檬等精油當(dāng)中，是合成鎮(zhèn)痙劑新握克丁和維生素 E 的中間體，同時(shí)它高度稀釋時(shí)具有類似蘋果的香氣，可用于配制各種水果型香精[18-19]。白芨中所含的高揮發(fā)性異戊醛組分被證明在為食品、醫(yī)藥品和香料的合成與研制中具有重要作用[20]。其次，白芨揮發(fā)性組分中含有高濃度的乙酸成分（13.62%），研究表明乙酸具有抑制害蟲生長以及抗植物病原菌和病毒等作用[21-22]。例如，有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)白芨塊莖中分離的組分對(duì)枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌及發(fā)癬菌均有明顯的抑制作用[23]。此外，酚類物質(zhì)也具有抗氧化、清除自由基、延緩衰老、預(yù)防心血管疾病和癌癥等多種生物活性[24-25]。本研究發(fā)現(xiàn)白芨中含有8.94% 的4-氨基-3-甲基苯酚，暗示白芨塊莖中的這些生物活性成分可能與白芨抗菌、抗炎以及抗癌、抗腫瘤等生物活性功能密切相關(guān)[26]。

由于白芨有較高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，近年來國內(nèi)外對(duì)白芨藥材的需求量正逐年增長[27]。因此，目前及今后一段時(shí)期內(nèi)對(duì)白芨種子萌發(fā)、種苗培育、病蟲害防治等制約規(guī)模化種植的關(guān)鍵技術(shù)研究將會(huì)是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[28]。此外，藥用植物白芨中含有較豐富的揮發(fā)性組分，并且其中的大多數(shù)化合物都具有廣泛的生理活性。因此針對(duì)白芨塊莖中所含揮發(fā)性組分的藥理作用研究，必將為道地藥材白芨資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)和理論參考。