一株硫酸銨耐性菌株的分離鑒定及其特征研究

龍婉婉，王金鳳，廖永輝，賀根和

（1.井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西，吉安343009；2.江西省紅壤丘陵區(qū)農(nóng)業(yè)環(huán)境污染防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西，吉安343009）

0 引言

離子型稀土礦是我國(guó)重要的戰(zhàn)略資源，主要分布在南方的江西、廣東、福建等省份，其中以江西省贛州市開(kāi)采時(shí)間最早、開(kāi)采量最多。由于早期采用的池浸、堆浸工藝較為落后，稀土冶煉過(guò)程中使用了大量的硫酸銨、碳酸氫銨等化學(xué)試劑，堆場(chǎng)土壤中殘留的氨氮不僅會(huì)通過(guò)滲濾作用進(jìn)入地下水體，而且在雨水的沖刷和地表徑流的作用下經(jīng)溝渠匯入附近的河流，造成礦區(qū)附近土壤及水體嚴(yán)重的氨氮擴(kuò)散性污染[1-2]。因此，贛南稀土礦區(qū)堆場(chǎng)土壤氮污染的修復(fù)已刻不容緩。

礦區(qū)污染土壤修復(fù)已成為世界普遍關(guān)注的環(huán)境問(wèn)題之一。礦區(qū)廢棄地的修復(fù)方法有很多，有使用一定的固體材料，對(duì)礦業(yè)開(kāi)采留下的礦坑或淪陷區(qū)進(jìn)行充填的物理填充恢復(fù)技術(shù)和表土轉(zhuǎn)換、物理隔離等物理修復(fù)方法技術(shù)[3]，以及利用施加化學(xué)物質(zhì)對(duì)氨氮的控制、人工控制其酸堿度的化學(xué)修復(fù)方法技術(shù)。近年來(lái)，微生物修復(fù)方法由于成本較低，環(huán)境友好等特征在礦區(qū)廢棄地污染治理中得到廣泛應(yīng)用[3-4]。越來(lái)越多的研究表明，將微生物與載體（有機(jī)肥、黏土礦物、生物碳、磷灰石、硅藻土等）結(jié)合做成的生物有機(jī)復(fù)合材料是微生物修復(fù)技術(shù)最為有效的方式[5-6]。然而針對(duì)贛南稀土礦區(qū)氨氮污染場(chǎng)及酸性環(huán)境場(chǎng)的微生物修復(fù)技術(shù)的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，微生物種質(zhì)資源及相關(guān)的基礎(chǔ)理論研究也不夠深入，這極大限制了微生物修復(fù)技術(shù)在稀土礦區(qū)氨氮高污染土壤中的研究。

贛南稀土尾礦土壤長(zhǎng)期被高濃度硫酸銨脅迫，必然讓更多的本土微生物具有適應(yīng)該脅迫的進(jìn)化趨勢(shì)（微生物的一些基因可能被誘導(dǎo)表達(dá)或DNA序列發(fā)生特定的改變），使微生物更具有穩(wěn)定耐性基因資源，從而通過(guò)形態(tài)，生理生化的適應(yīng)性來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)硫酸銨的適應(yīng)性[7]。本研究從贛南稀土礦區(qū)高濃度硫酸銨污染的稀土尾礦土壤中，篩選硫酸氨耐受性微生物，研究其對(duì)硫酸銨耐性的生理生化特性。研究結(jié)果可為稀土礦區(qū)土壤的生態(tài)環(huán)境修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)對(duì)促進(jìn)礦區(qū)及周邊農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)保護(hù)、實(shí)現(xiàn)國(guó)家生態(tài)文明建設(shè)和贛南蘇區(qū)振興發(fā)展戰(zhàn)略具有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 供試土壤樣品采集及處理

供試土壤樣品取自江西省贛州市龍南縣足洞稀土釔礦區(qū)（24°51'46"N，114°50' 35" E）2～20 cm的土層。土壤樣品的部分理化性質(zhì)如下：pH 為4.4，總氮2 g/Kg，總磷0.033 g/Kg，TOC2.08 g/Kg，Yi 3.4 mg/Kg，Nd 0.52 mg/Kg，氨氮380.56mg/Kg，硫酸根離子45.33mg/Kg，土壤樣品硫酸銨含量較高。樣品取好后用封口袋封裝帶回實(shí)驗(yàn)室，風(fēng)干、磨碎并過(guò)2 mm 篩后，取土壤10 g 加入90 mL 無(wú)菌去離子水中，搖床震蕩2小時(shí)后靜置30 min，取上清備用。

1.2 硫酸銨耐性菌株的培養(yǎng)與分離

取新鮮的土壤溶液1 mL加入到9 mL含硫酸銨濃度為0.1 mol/L的新鮮LB 培養(yǎng)基中(葡萄糖5 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母提取物2 g/L，NaCl2g/L，制霉菌素50 mg/L，pH 7.0)，37℃搖床振蕩24 h。靜置后取1mL 溶液，加入含硫酸銨濃度為0.2 mol/L 的LB液體培養(yǎng)基中，28℃搖床振蕩培養(yǎng)約24 h。用同樣的馴化方法，直到LB培養(yǎng)液中硫酸銨濃度提高至1.0 mol/L。取最后一次馴化的培養(yǎng)液用稀釋平皿法涂布于固體培養(yǎng)基平板上，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平板，于28℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24～48 h 后形成單菌落。隨機(jī)挑取培養(yǎng)基上單個(gè)獨(dú)立長(zhǎng)勢(shì)較好的菌落，置于1.5 mL 離心管并編號(hào)，管中加入30μL的LB液體培養(yǎng)基置于搖床，28℃、200 r/min 進(jìn)行富集培養(yǎng)1 h 后，加甘油于?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 菌株P(guān)CR-RFLP分析及種屬鑒定

運(yùn)用巢式PCR（nested-PCR）完成分離菌的16 S rDNAs 的擴(kuò)增。第一輪反應(yīng)（體積25 μL）含1 μL（大約1 ng）DNA 為模板，0.5 μL 引物（10 μM），2μL的dNTP混合物（2.5 mM），1.5μLMgCl2（25 mM），2.5 μL10×PCR 反應(yīng)緩沖液和0.2 μL Taq DNA 聚合酶（5 U/μL，Takara）。在第一輪反應(yīng)的引物為：27f (5'- AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG -3')和1492r (5'-TACCT TGTTA CGAC TT- 3')。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃30 s，55℃40 s，72℃1 min，共10個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。第二輪反應(yīng)以第一輪反應(yīng)的PCR 產(chǎn)物為模板，引物為：63f（5'-CAGGC CTAAC ACATG CAAGT C-3'）和1389r（5'-ACGGG CGGTG TGTAC AAG-3'）。在這一輪反應(yīng)中，設(shè)置30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)條件同第一輪反應(yīng)。PCR 結(jié)束后，產(chǎn)物用含1%溴化乙錠的瓊脂糖凝膠電泳、檢測(cè)（大約1500 bp 長(zhǎng)度的片段為目標(biāo)片段）。

將PCR 產(chǎn)物分別用限制性內(nèi)切核酸酶HhaI 和RsaI 消化（37℃，1 h）。酶切DNA 片段用2%的瓊脂糖凝膠電泳分離,經(jīng)溴化乙錠染色和凝膠成像系統(tǒng)成像后,所得DNA 帶型圖譜在GIS 凝膠分析軟件輔助下進(jìn)行人工比較分析。以基因片段多態(tài)圖譜為基礎(chǔ)進(jìn)行聚類(lèi)，聚合到一起的具有相同圖譜的克隆視為相同的基因型。每一個(gè)基因型作為一個(gè)分類(lèi)操作單位（OTU, Operational Taxonomic Unit）或稱(chēng)為唯一基因型[7]。將16 S rDNA PCR 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離并用瓊脂糖凝膠分離純化試劑盒進(jìn)行純化。通過(guò)TA 克隆技術(shù)將純化后的16S rDNA 片段轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α 中，氨芐青霉素及藍(lán)白斑篩選挑取陽(yáng)性克隆子送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的16 S rDNA 序列進(jìn)行比對(duì)分析，獲得最相近菌株的16 S rDNA 序列。通過(guò)MEGA5.0 軟件，用Neighbor-joining 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.4 菌株的形態(tài)特征

將耐性菌株接種到LB固體培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)48 h 后進(jìn)行生理生化檢測(cè)，檢測(cè)內(nèi)容包括：革蘭氏染色、V.P.測(cè)定、吲哚的產(chǎn)生、硝酸鹽還原反應(yīng)、水解反應(yīng)（脲素、山梨醇）和碳源利用情況（葡萄糖、精氨酸、甘露醇、麥芽糖、蘋(píng)果酸、苯乙酸）。測(cè)定方法參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》。

1.5 菌株對(duì)硫酸銨脅迫的響應(yīng)特征

挑取純化后的菌株于LB液體培養(yǎng)基中，28℃，200 rpm/min 過(guò)夜培養(yǎng)，取該菌液1 mL接種于100 mL 的LB液體培養(yǎng)基中，并向培養(yǎng)基中添加硫酸銨，使其終濃度分別為0.1、，0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mol/L，28℃，200 rpm/min搖床培養(yǎng)，每隔相同時(shí)間進(jìn)行取樣，測(cè)定其OD600值，并在24 h 測(cè)定菌株的FDA 水解酶[8]、蛋白酶、脫氫酶和過(guò)氧化氫酶的活性[9]。

1.6 菌株對(duì)pH變化的響應(yīng)特征

挑取純化后的菌株于LB 液體培養(yǎng)基中，28℃，200 rpm/min 過(guò)夜培養(yǎng)，取該菌液1mL 接種于100 mL的不同pH 值（2.5～8.5）的LB 液體培養(yǎng)基中，28℃，200 rpm/min 搖床培養(yǎng)，每隔相同時(shí)間進(jìn)行取樣，測(cè)定其OD600值，同時(shí)測(cè)定菌株的FDA 水解酶、蛋白酶、脫氫酶和過(guò)氧化氫酶的活性。

1.7 菌株對(duì)不同抗生素的響應(yīng)特征

取1 mL 活化的菌液接種于LB培養(yǎng)基，分別添加氨芐青霉素、四環(huán)素、硫酸鏈霉素和氯霉素四種抗生素，同時(shí)添加終濃度為0.5 mol/L的硫酸銨，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)，28℃，200 rpm/min搖床培養(yǎng)24 h，測(cè)定其OD600值。同時(shí)，測(cè)定非敏感性培養(yǎng)液中FDA 水解酶、蛋白酶、脫氫酶和過(guò)氧化氫酶的活性。

1.8 菌株對(duì)氨氮和硫酸鹽的降解效果

挑取純化后的菌株于LB液體培養(yǎng)基中，28℃，200 rpm/min 過(guò)夜培養(yǎng)，取該菌液1 mL 接種于100 mL的LB液體培養(yǎng)基中，并向培養(yǎng)基中添加硫酸銨，使其終濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mol/L，28℃，200 rpm/min 搖床培養(yǎng)，每隔相同時(shí)間進(jìn)行取樣，測(cè)定溶液中氨氮和硫酸鹽的濃度[10]。

1.9 數(shù)據(jù)分析

用Excel 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸銨耐性菌株的分離

在含硫酸銨的LB富集培養(yǎng)基上馴化分離獲得5個(gè)菌株。經(jīng)過(guò)對(duì)5個(gè)菌株進(jìn)行劃線分離后挑取單菌落保存?zhèn)溆茫?biāo)記為1～5）。

2.2 菌株的PCR-RFLP分析

運(yùn)用巢式PCR（nested-PCR）對(duì)菌株1～5進(jìn)行16 S rDNAs 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物分別用限制性內(nèi)切核酸酶RsaI 和HhaI 消化（37℃，1 h），酶切后的電泳圖譜見(jiàn)圖1。圖中DNA 酶切的結(jié)果顯示為同一種基因型。

圖1 菌株16S rDNA PCR-RFLP結(jié)果圖Fig. 1 Strain of 16S rDNA PCR-RFLPproduct

2. 3菌株的形態(tài)和生理生化特征

在LB固體平板上，菌株LNa 菌落不透明、乳白色、小而扁平、圓形、菌落中間厚，向四周逐漸變薄（圖2a）。革蘭氏反應(yīng)陽(yáng)性，桿狀（圖2b）。菌株LNa 的生理生化特性見(jiàn)表1。

圖2 菌株LNa 菌落形態(tài)及革格蘭氏染色Fig. 2 Colony morphology and Gram's staining results of Strain LNa

表1 菌株LNa 的生理生化測(cè)定Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strai n LNa

2.4 硫酸銨耐性菌的種屬特征

選取菌株LNa 的16 S rDNA 序列，經(jīng)TA 克隆、測(cè)序測(cè)定后在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast 序列比對(duì)分析，確定了其種屬分類(lèi)地位（圖3）。RDP聚類(lèi)分析表明菌株LNa 屬于短波單胞菌屬(Brevundimonassp.)，相似性為99%，菌株命名為Brevundimonassp. LNa。

圖3 菌株LNa 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)圖Fig. 3 Phylogenetic tree derived from 16S rDNA sequence of the Brevundimonas sp. strain LNa

2. 5菌株對(duì)硫酸銨脅迫的響應(yīng)特征

由圖4可知，在低于1 mol/L 硫酸銨的條件下，菌株均能正常生長(zhǎng)。當(dāng)硫酸銨的濃度為0.1 mol/L時(shí)，在接種6 h 后，菌株開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)，18 h后生長(zhǎng)速度減慢，進(jìn)入穩(wěn)定期。隨著硫酸銨濃度的升高，菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)期的時(shí)間有所延后，說(shuō)明硫酸銨對(duì)菌株的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，而且會(huì)隨著硫酸銨的濃度升高而增強(qiáng)（圖4a）。同時(shí)，這種生長(zhǎng)抑制作用也影響菌的FDA 水解酶、蛋白酶、脫氫酶和過(guò)氧化氫酶的活性，使其呈現(xiàn)不同程度的下降，其中降幅最大的是蛋白酶。此外，當(dāng)脅迫濃度上升到0.5 mol/L后，菌株過(guò)氧化氫酶活性維持在一定水平后幾乎不再發(fā)生變化（圖4b）。

圖4 菌株LNa 對(duì)硫酸銨脅迫的響應(yīng)特征Fig.4 Response characteristics of strain LNa to ammonium sulfate stress

2.6 菌株對(duì)不同pH值的響應(yīng)特征

菌株的最適生長(zhǎng)pH 在6～7.5之間，在最適pH條件下，接種6 h 后，菌株生長(zhǎng)速率最快，12 h 后生長(zhǎng)速度減慢。在pH 低于5.0 或高于8.0 的條件下，菌株幾乎不生長(zhǎng)（圖5a）。測(cè)定不同pH 條件下菌液中FDA 水解酶、蛋白酶、過(guò)氧化氫酶、脫氫酶的酶活力發(fā)現(xiàn)，在0.5 mol/L硫酸銨脅迫濃度下，菌株的蛋白酶、脫氫酶和過(guò)氧化氫酶活性隨pH的升高變化不明顯，但FDA 水解酶活性隨著pH 升高呈顯著上升趨勢(shì)（圖5b）。

圖5 菌株LNa 對(duì)不同pH值的響應(yīng)特征Fig. 5 Response characteristics of strain LNa to different pH values stress

2.7 菌株對(duì)不同抗生素的響應(yīng)特征

為測(cè)試菌株的抗生素敏感性，將菌株分別接種到含有氨芐青霉素、氯霉素、硫酸鏈霉素和四環(huán)素及相同濃度的硫酸銨的培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)菌株對(duì)氨芐青霉素、氯霉素和四環(huán)素敏感，而對(duì)硫酸鏈霉素不敏感。

表2 菌株LNa 的抗生素敏感性試驗(yàn)Table 2 Antibiotics sensitive tests of strain

在相同硫酸銨濃度（0.5 mol/L）不同濃度的硫酸鏈霉素的處理?xiàng)l件下，LNa 菌株酶活性如圖6所示。在硫酸鏈霉素脅迫下，菌液中的FDA 水解酶、蛋白酶、脫氫酶、過(guò)氧化氫酶相比沒(méi)加硫酸鏈霉素的菌液中酶活力低，F(xiàn)DA 水解酶活力整體上表現(xiàn)為先上升后下降，最后趨于穩(wěn)定的變化趨勢(shì)，在脅迫濃度為30 μg/ml 時(shí)達(dá)到最大值，增幅達(dá)42.3%。

圖6 不同濃度硫酸鏈霉素對(duì)菌株LNa 酶活力的影響Fig.6 Effects of different concentrations of streptomycin sulfate on the enzyme activity of LNa strain

2.8 菌株對(duì)氨氮和硫酸鹽的降解效果

菌株LNa 接種6 h 后，菌株LNa 能不同程度地降低培養(yǎng)基中氨氮和硫酸鹽濃度，在0.7 mol/L硫酸銨脅迫下降解效果最好，氨氮濃度能降低約29%（圖7a），硫酸鹽濃度降低約36.7%（圖7b）。

圖7 菌株對(duì)氨氮和硫酸鹽的降解效果Fig. 7 Degradation effects of strain LNa to ammonia nitrogen and sulfate

3 討論

贛南稀土礦由于硫酸銨、碳酸氫銨等富含NH4+和SO42-藥劑的大量使用，土壤遺留大量NH4+和SO42-，這些離子不易被富集，導(dǎo)致礦山周邊土壤和水環(huán)境受到了嚴(yán)重的污染，對(duì)生態(tài)環(huán)境安全造成了極大的威脅[5]。按照“礦山池浸工藝”，每生產(chǎn)1噸稀土氧化物將產(chǎn)生1000～1200噸廢水，破壞160～200 m2的地表植被，剝離表土300 m3，大量廢水伴隨著尾砂使土壤退化、水源和農(nóng)田受到污染，礦山周?chē)纳鷳B(tài)環(huán)境日趨惡化[6]。因此，對(duì)稀土的開(kāi)采不單要改進(jìn)開(kāi)采方式和工藝，還要治理已經(jīng)被污染和即將被污染的土壤和水體。大量研究表明利用微生物治理被污染的土壤和水體是一種經(jīng)濟(jì)且有效的方法手段[11-14]。然而，目前稀土礦區(qū)利用微生物進(jìn)行堆場(chǎng)土壤污染治理與修復(fù)的研究并不多見(jiàn)。

本研究利用傳統(tǒng)微生物分離方法并結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)從富含稀土釔的贛州龍南稀土礦區(qū)土壤中分離硫酸銨耐受菌株[15]。通過(guò)富集馴化、酶切、PCR-RFLP分析、基因測(cè)序及NCBI 序列比對(duì)，確定了一株短波單胞菌屬（Brevundimonassp）硫酸銨耐受菌株LNa，該菌株對(duì)硫酸銨的最高耐受濃度可達(dá)0.9 mol/L，表現(xiàn)出對(duì)硫酸銨較強(qiáng)的耐受性。Tsubouchi 等[16]在海底發(fā)現(xiàn)一株好氧異養(yǎng)型的短波單胞菌，表現(xiàn)出較強(qiáng)的反硝化脫氮作用。Naqqash等[17]發(fā)現(xiàn)了一株短波單胞菌，發(fā)現(xiàn)該菌在植物根際具有較強(qiáng)的固氮作用。通過(guò)以上分析并結(jié)合我們的研究結(jié)果可知，短波單胞菌屬細(xì)菌可能對(duì)硫酸銨具有較好的轉(zhuǎn)化效果。

然而，高咪等[18]通過(guò)運(yùn)用Illumina Mi Seq 高通量測(cè)序技術(shù)研究了稀土堆場(chǎng)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)微生物種群中存在假單胞桿菌屬細(xì)菌，但卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Brevundimonas細(xì)菌。該種菌在其它有關(guān)硫酸銨抗性微生物的研究中也鮮有報(bào)道?？梢?jiàn)，Brevundimonas sp. LNa 是一株新發(fā)現(xiàn)的硫酸銨耐受菌株，對(duì)研究稀土堆場(chǎng)土壤硫酸銨的轉(zhuǎn)化有著非常重要的意義。

微生物對(duì)環(huán)境脅迫因子的耐受性容易受溶液pH、初始脅迫濃度、生物量及吸附時(shí)間等因素的影響[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)酸影響菌株LNa 對(duì)硫酸銨的耐受性，菌株最適生長(zhǎng)pH在6-7之間。pH 低于5.0或高于8.0的條件下，菌株幾乎不生長(zhǎng)。在低于1 mol/L 硫酸銨的條件下，菌株生長(zhǎng)正常，隨著硫酸銨濃度的升高，菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)期的時(shí)間延后，并且會(huì)隨著硫酸銨的濃度升高抑制作用顯著增強(qiáng)，表現(xiàn)出明顯的雙脅迫現(xiàn)象，這與大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果是一致的。

微生物對(duì)外界環(huán)境脅迫的抗性機(jī)制主要有二種方式。第一種是體外方式，即當(dāng)微生物體受到脅迫時(shí)，通過(guò)合成分泌一些螯合物與脅迫因子結(jié)合，阻止其被細(xì)胞所吸收[21]；第二種是體內(nèi)方式，將被吸收至細(xì)胞內(nèi)的脅迫因子與某些蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，通過(guò)一些酶促反應(yīng)解除毒害，使細(xì)胞能夠正常地生存下去[22-23]。我們對(duì)菌株LNa 培養(yǎng)過(guò)程對(duì)硫酸銨、酸及抗生素等脅迫因子響應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn)，菌株的抗性與蛋白酶、水解酶等代謝酶的活性變化有關(guān)，但其分解利用高濃度硫酸銨的機(jī)制還需進(jìn)一步的深入研究。

4 小結(jié)

本研究發(fā)現(xiàn)了一株硫酸銨耐受菌株Brevundimonassp. LNa，該菌株在高濃度的硫酸銨下能正常生長(zhǎng)，表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗性，并對(duì)硫酸鹽和氨氮都有較強(qiáng)的分解或轉(zhuǎn)化能力。菌株的發(fā)現(xiàn)可望給自然狀態(tài)下難以修復(fù)的被NH4+和SO42-離子污染的稀土礦區(qū)土壤和水體的治理開(kāi)辟了新思路。