循環(huán)腫瘤脫氧核糖核酸基因突變檢測在非小細胞肺癌中的應用價值

季鳳俊，秦愷，葉飛，陸松華

海安市人民醫(yī)院胸外科，江蘇 海安2266000

肺癌是常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率和致死率均較高，嚴重威脅人類的健康和生命。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的最常見類型[1]，通常部分NSCLC患者確診時已發(fā)展至晚期，預后極差。準確獲知腫瘤的生物學信息，從而在基因分型指導下進行個體化治療對于指導NSCLC患者的臨床用藥至關重要[2]。目前，臨床常規(guī)采用組織脫氧核糖核酸（transferred deoxyribonucleic acid，tDNA）檢測基因分型，但此檢測對身體的創(chuàng)傷性大，且對標本獲取有較高的要求。循環(huán)腫瘤脫氧核糖核酸（circulating tumor DNA，ctDNA）是人體血液中的小片段游離脫氧核糖核酸（cell free DNA，cfDNA），存在于外周血、腦脊液等體液中，主要由壞死或凋亡的腫瘤細胞釋放[3-4]。外周血ctDNA可被定性、定量和追蹤，將有可能為臨床腫瘤的早期診斷、預后預測及跟蹤隨訪等提供方便、快捷、特異、無創(chuàng)或微創(chuàng)的分子生物學檢測手段[1,5]。但外周血ctDNA是否可以替代組織tDNA成為常規(guī)基因檢測手段應用于臨床尚未可知。鑒于此，本研究檢測NSCLC患者血漿ctDNA的突變情況，并以組織tDNA為對照，評價其診斷效能，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2017年5月至2018年5月海安市人民醫(yī)院收治的90例NSCLC患者。納入標準：①經(jīng)病理學檢查確診為NSCLC；②患者可行腫瘤根治術(shù)；③切除的組織滿足檢測要求；④手術(shù)前后各個所需時間點的外周血齊全且滿足檢測要求。排除標準：①合并嚴重的心、肝、腎功能不全；②合并活動性結(jié)核及其他嚴重的感染性疾??；③存在精神疾病；④任何因素造成的樣本污染。90例NSCLC患者中，男48例，女42例；年齡35～78歲，平均（54.4±11.3）歲；腺癌72例，鱗狀細胞癌14例，神經(jīng)內(nèi)分泌癌2例，大細胞癌2例；腫瘤分期：Ia期36例，Ib期14例，Ⅱa期14例，Ⅱb期2例，Ⅲa期22例，Ⅳ期2例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，所有患者及家屬均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 血漿分離與DNA提取

抽取患者手術(shù)前、手術(shù)后各個所需時間段的外周血，以2000 r/min的離心速度離心15 min，分離出上層的血漿和下層的紅細胞。吸取上層血漿，動作需輕柔，避免吸取到中層白細胞，若一次分離后的血漿仍見少量紅細胞，需繼續(xù)離心，直至澄清血漿而無紅細胞殘余。采用Qiagen DNA提取試劑盒提取總DNA，嚴格按照試劑盒說明書的步驟進行操作，提取的總DNA可繼續(xù)進行ctDNA的分離或置于-80℃冰箱中備用。在外周血的采集中，若發(fā)生溶血則重新抽取外周血；外周血中提取的ctDNA經(jīng)過質(zhì)檢，若存在濃度過低、DNA已降解等情況，需重新提取ctDNA；小片段ctDNA同樣納入統(tǒng)計。

1.3 ctDNA分離與測序

采用Qiagen的薄膜柱吸附試劑盒從血漿中分離出ctDNA：嚴格按照試劑盒說明書對ctDNA的小片段進行回收，回收純化的ctDNA需要進行末端修復、A接頭連接、繼續(xù)鏈接捕獲試劑盒特定探針接頭，測序時可以特異性捕獲到NSCLC的驅(qū)動基因信息。對ctDNA進行上述處理后進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，然后利用深圳華大基因檢測公司的Ion Proton二代測序平臺進行測序，檢測基因包括表皮生長因子受體外顯子（epidermal growth factor receptor exon，EGFR exon）、TP53、erb-b2 受體酪氨酸激酶 2（erb-b2 receptor tyrosine kinase 2，ERBB2）、磷脂酰肌醇 3-激酶催化亞基α（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha，PIK3CA）基因，檢測內(nèi)容包括各個基因突變的例數(shù)、基因突變的位點和基因突變的類型（包括點突變、插入突變或缺失突變）。測序結(jié)果經(jīng)局部路線搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對后存在點突變、插入突變或缺失突變者定義為突變陽性，比對結(jié)果一致則為突變陰性。

1.4 組織DNA提取與分析

對腫瘤石蠟組織進行脫蠟、刮片處理后，使用Qiagen DNA提取試劑盒提取組織DNA，將組織DNA經(jīng)超聲波處理成大小為150～200 bp的小片段。后續(xù)文庫構(gòu)建方法和測序過程與ctDNA處理情況相同。

1.5 統(tǒng)計學方法

計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示。以tDNA突變情況為金標準，計算外周血ctDNA檢測腫瘤組織的靈敏度、特異度、陽性預測值、一致性以及手術(shù)前后基因突變頻率的變化情況。其中，特異度=真陰性例數(shù)（/真陰性+假陽性）例數(shù)×100%；靈敏度=真陽性例數(shù)/（真陽性+假陰性）例數(shù)×100%；陽性預測值=真陽性例數(shù)（/真陽性+假陽性）例數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)前外周血和組織中驅(qū)動基因突變對NSCLC的診斷效能

90例NSCLC患者中，有68例患者包含1個或多個驅(qū)動基因突變。68例突變的NSCLC患者中，多數(shù)患者同時存在于tDNA和ctDNA中，少數(shù)患者僅存在于ctDNA或僅存在于tDNA中。術(shù)前NSCLC患者外周血和組織中EGFRexon、TP53、ERBB2、PIK3CA基因突變診斷NSCLC的靈敏度分別為100.00%、100.00%、83.33%和100.00%，特異度分別為96.77%、100.00%、100.00%和97.62%，陽性預測值分別為93.33%、100.00%、100.00%和75.00%，一致性分別為97.78%、100.00%、97.78%和97.78%。

2.2 術(shù)前外周血和組織中DNA總體基因突變對NSCLC診斷效能的比較

tDNA診斷結(jié)果顯示，58例患者呈陽性，32例患者呈陰性。tDNA和對應的術(shù)前血漿ctDNA突變診斷的一致性為75.56%，術(shù)前血漿ctDNA突變診斷NSCLC的靈敏度為72.41%，特異度為81.25%，陽性預測值為87.50%。

2.3 手術(shù)前后NSCLC患者外周血ctDNA的突變頻率的比較

68例患者術(shù)前的血漿ctDNA檢測結(jié)果呈陽性，共發(fā)現(xiàn)存在34種突變。34種突變中，EGFRexon、TP53、ERBB2、PIK3CA的突變頻率分別為42.9%（30/70）、31.4%（22/70）、14.3%（10/70）、11.4%（8/70）。對所有基因突變手術(shù)前后的總體平均突變頻率進行比較發(fā)現(xiàn)，手術(shù)前血漿ctDNA的平均突變頻率為1.24，手術(shù)后血漿ctDNA的平均突變頻率為0.13。（表 1）

3 討論

目前，肺穿刺活組織檢查獲取的tDNA主要用于NSCLC患者基因突變的檢測，但是，NSCLC患者確診時多已為晚期，無法進行手術(shù)治療，從而難以獲取腫瘤組織。因此，采用tDNA進行NSCLC基因檢測在臨床靶向治療中的應用受到了限制。外周血ctDNA是循環(huán)腫瘤細胞、凋亡的腫瘤細胞、腫瘤細胞分泌的外分泌體等進入血液循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤DNA，材料容易獲得，而且對腫瘤分型無要求，具有無創(chuàng)性，可動態(tài)監(jiān)測腫瘤進展情況，因此，外周血ctDNA檢測成為了肺癌精準診斷和輔助治療的有效方法[6-9]。

本研究的90例NSCLC患者中，有68例患者包含1個或多個驅(qū)動基因突變。68例突變患者中，多數(shù)患者同時存在于tDNA和ctDNA中，少數(shù)患者僅存在于ctDNA或僅存在于tDNA中；術(shù)前，患者外周血和組織中EGFRexon、TP53、ERBB2、PIK3CA的ctDNA總突變情況比較，tDNA與對應的術(shù)前血漿ctDNA突變診斷的一致性為75.56%，術(shù)前血漿ctDNA突變診斷NSCLC的靈敏度為72.41%，特異度為81.25%，陽性預測值為87.50%，提示tDNA和ctDNA診斷NSCLC具有較好的一致性，也說明NSCLC術(shù)前外周血ctDNA用來監(jiān)測腫瘤驅(qū)動基因的突變情況具有較高的可靠性，因此，本研究繼續(xù)采用此法研究手術(shù)切除腫瘤組織后的患者外周血中ctDNA的突變情況，目的是探索外周血ctDNA驅(qū)動基因的突變可否進一步應用于監(jiān)測術(shù)后腫瘤的動態(tài)變化，從而為臨床對術(shù)后的進一步治療提供可靠依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，在四種驅(qū)動基因的所有突變中，手術(shù)前外周血ctDNA的平均突變頻率為1.24，腫瘤組織切除術(shù)后兩天外周血ctDNA的平均突變頻率為0.13，手術(shù)前后突變頻率明顯下降，說明術(shù)后外周血ctDNA驅(qū)動基因的突變情況可以有效反映術(shù)后腫瘤的動態(tài)恢復狀況。徐敏等[6]亦發(fā)現(xiàn)外周血ctDNA診斷NSCLC患者基因突變的結(jié)果與tDNA的符合率超過91%，可替代腫瘤組織切片得知基因突變情況，與本研究結(jié)果一致。另外，本研究的21例陽性患者樣本中，在20例患者的腫瘤組織和外周血ctDNA中均檢測到基因突變，有1例患者僅在血漿ctDNA中檢測到基因突變，這可能與腫瘤大小、檢測實驗環(huán)節(jié)的局限性和腫瘤潛在轉(zhuǎn)移等因素有關；其中，腫瘤潛在轉(zhuǎn)移的可能性最大，1例僅在血漿ctDNA中檢測到的突變可能是因為原發(fā)腫瘤DNA發(fā)生了轉(zhuǎn)移，因此，外周血ctDNA與組織腫瘤DNA存在某些不同的基因突變[10]。血液ctDNA的釋放被認為與腫瘤細胞的自行分泌或凋亡、壞死有關，同時檢測具有無創(chuàng)性的特點，成為了良好的預后預測分子指標。既往多項研究均發(fā)現(xiàn)血清ctDNA水平升高與腫瘤轉(zhuǎn)移、臨床分期及患者的生存情況有關，根據(jù)血清ctDNA水平可預測患者預后[11-14]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)外周血基因突變可用于NSCLC的診斷和術(shù)后動態(tài)監(jiān)測，其中，TP53、ERBB2、PIK3CA的臨床參考價值略低于EGFRexon，但也可與EGFRexon共同輔助完成對NSCLC的檢測。很多NSCLC相關的基因?qū)τ诩膊〉脑\斷可能均存在一定的價值，今后還會擴展基因研究的范圍，為NSCLC的診斷和治療提供更多可靠、有效的依據(jù)。因此，靶向測序檢測ctDNA可檢出NSCLC患者的突變基因，同時可監(jiān)測患者的手術(shù)治療效果，具有一定的可靠性，對NSCLC患者的早期診斷和治療具有一定的臨床應用價值。