多指標綜合加權(quán)評分法優(yōu)選復方夏枯草洗劑提取工藝研究*

陸雪琴 ，趙 亮 ，周 潔 ，段彥娟 ，張春燕 ，朱建勇 ，翟曉翔 ，2

（1.上海中醫(yī)藥大學附屬第七人民醫(yī)院皮膚科，上海 200137；2.南京中醫(yī)藥大學，南京 210023；3.上海中醫(yī)藥大學附屬第七人民醫(yī)院中心實驗室，上海 200137）

復方夏枯草洗劑處方由夏枯草、丹參、威靈仙、木賊、板藍根、大青葉、皂角刺、鴨跖草、薏苡仁、制香附共10味中藥組成，為上海市第七人民醫(yī)院皮膚科臨床驗方。該復方中藥外用治療尋常疣具有臨床療效好、對皮膚無刺激性的優(yōu)點，可以極大提高患者、尤其兒童的順應性，減輕痛苦，提高療效。本研究旨在按照國家食品藥品監(jiān)督管理總局對醫(yī)療機構(gòu)應用傳統(tǒng)工藝配制中藥制劑的要求，擬將復方夏枯草洗劑研制成院內(nèi)制劑，使該制劑規(guī)范化應用于臨床，保證藥物的安全性、穩(wěn)定性、有效性和可控性。本研究采用正交實驗設計，以迷迭香酸、丹酚酸B的含量及出膏率為考察指標[1-2]，對料液比、提取時間、提取次數(shù)等因素進行考察，優(yōu)選復方夏枯草洗劑的最佳提取工藝，確保該藥物的工藝穩(wěn)定，質(zhì)量可控[3-4]。

1 材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀（Agilent 1260），美國安捷倫公司；電子天平（CP225D），北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；超聲清洗儀（DL720-A），上海之信儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（N-1300-WB），日本EYELA公司；電熱恒溫水浴鍋（HWS28型），上海一恒科學實驗有限公司；電熱恒溫干燥箱（DNG-9140A），上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 藥物與試劑 對照品迷迭香酸（批號：111871-201706）、丹酚酸 B（批號：111562-201716），均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純試劑，美國Fisher公司；水為超純水，其余試劑均為分析純。夏枯草等10味藥材均購自上?？禈蛩帢I(yè)有限公司，符合2015版《中華人民共和國藥典》相關規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：以0.1%磷酸溶液為流動相A，以甲醇為流動相B，洗脫程序見表 1；流速：1.0 mL/min；柱溫：28.0 ℃；檢測波長：286 nm；進樣量：10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取迷迭香酸、丹酚酸B對照品適量，加50%甲醇溶液溶解，配制成濃度分別為 115 μg/mL，1 700 μg/mL 混合對照品溶液，備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 稱取1日處方量藥材共155 g，加10倍量水，煎煮2次，每次1 h，合并濾液，減壓濃縮至100 mL，精密吸取1 mL濃縮液，置5 mL的容量瓶中，加50%甲醇溶液定容至5 mL，即得。

2.1.4 陰性對照品溶液的制備 稱取除夏枯草、生丹參之外的藥材，按照“2.1.3”項下方法，制備缺夏枯草、生丹參的陰性對照溶液。

2.2 迷迭香酸、丹酚酸B專屬性實驗 分別吸取混合對照品溶液，供試品溶液，陰性對照品溶液各10 μL，按“2.1.1”項下進行分析，2 種指標性成分與其相鄰的色譜峰分離系數(shù)均大于1.5，并且各組分互不干擾，理論塔板數(shù)符合要求，陰性無干擾，專屬性良好。見圖1。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 精密吸取 1、2.5、5、10、12.5、15、20 μL的混合對照品溶液，注入液相色譜儀，按照“2.1.1”項下的方法進行測定，記錄峰面積。以進樣量為橫坐標（X），以峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得各組分線性方程、相關系數(shù)、線性范圍分別為Y迷迭香酸=674.85X-2.427 7，r=1.000 0，0.115～2.3 μg；Y丹酚酸B=319.26X-7.741 6，r=1.000 0，1.7～34 μg，在相應進樣范圍內(nèi)線性關系良好。

2.3.2 精密度實驗 精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液 5 μL，按“2.1.1”項下色譜條件重復進樣6次，記錄峰面積，計算迷迭香酸、丹酚酸B的RSD分別為0.31%、0.22%，表明儀器的精密度良好。

2.3.3 重復性實驗 按“2.1.3”項下的方法分別制備6份供試品溶液，分別進樣10 μL，記錄迷迭香酸、丹酚酸B的峰面積，計算迷迭香酸、丹酚酸B的RSD分別為0.53%、0.59%，表明方法重復性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性實驗 取“2.1.3”項下方法配制供試品溶液，分別于室溫放置 0、2、4、8、16、32 h。按“2.1.1”項下色譜條件進樣 10 μL，測定峰面積，計算迷迭香酸、丹酚酸B的RSD分別為1.24%、0.54%，表明供試品溶液在32 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率實驗 取已知指標成分含量的供試品溶液1份，在線性范周內(nèi)分別加入一定量的迷迭香酸、丹酚酸 B 對照品溶液，各 6 份，按“2.1.1”項下色譜條件測定含量，結(jié)果見表2。迷迭香酸和丹酚酸B的平均回收率為101.6%和97.3%，RSD分別為2.16%和1.89%，說明本方法回收率良好。

2.4 單因素實驗

2.4.1 料液比對提取率的影響 稱取1日處方量藥材，約155 g，共6份，補足吸水量，料液比分別按1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12 和 1∶14 煎煮 1 次，每次 0.5 h，煎液濃縮至 100 mL。按“2.1.3”項下方法分別配制迷迭香酸、丹酚酸 B 的供試品溶液。按“2.1.1”項下方法進行含量測定，結(jié)果見表 3。實驗顯示，1∶4、1∶6 提取兩種主成分含量偏低，1∶14提取兩種主成分提高不明顯，經(jīng)選擇選取 1∶8、1∶10 和 1∶12 為正交實驗料液比進一步考察。

2.4.2 提取時間對提取率的影響 稱取1日處方量藥材，約155 g，共5份，補足吸水量，加10倍水，煎煮 1 次，分別煎煮 0.5、1、1.5、2、2.5 h，煎液濃縮至100 mL。按“2.1.3”項下方法分別配制迷迭香酸、丹酚酸B的供試品溶液。按“2.1.1”項下方法進行含量測定，結(jié)果見表4。實驗顯示，兩種主成分含量隨煎煮時間的增加有明顯的下降趨勢，所以選擇0.5、1、1.5 h為正交實驗提取時間進一步考察。

圖1 復方夏枯草洗劑的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of Compound Xiakucao Lotion

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

表2 加樣回收率實驗結(jié)果Tab.2 Results of recovery test

表3 料液比對提取率的影響結(jié)果（n=3）Tab.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction yield(n=3)mg/mL

2.5 正交實驗

2.5.1 正交實驗設計 以復方夏枯草洗劑處方藥材濃縮提取液中迷迭香酸、丹酚酸B的含量及干膏得率為指標，采用L9（34）正交實驗進行考察料液比，提取時間，提取次數(shù)等因素，優(yōu)選出最佳的提取工藝，因素水平見表5。

2.5.2 正交實驗方案 按照“2.1.3”項下的方法，對正交設計各組的方案進行提取，制備各組供試品溶液，按照“2.1.1”項下的色譜條件進行含量測定，記錄峰面積，計算各供試品溶液中迷迭香酸、丹酚酸B的含量，結(jié)果見表6。

表4 提取時間對提取率的影響結(jié)果（n=3）Tab.4 Effect of extraction time on extraction yield(n=3)mg/mL

表5 正交實驗因素水平表Tab.5 Orthogonal experiment factor level table

2.5.3 干膏得率的測定 精密量取各組濃縮提取液25 mL，分別置已干燥至恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，置105℃的烘箱中干燥至恒質(zhì)量，取出，置干燥器中冷卻后，迅速稱定質(zhì)量，計算出膏率，結(jié)果見表6。

2.5.4 正交實驗結(jié)果分析 根據(jù)指標因素對提取工藝影響貢獻的大小的差異分配權(quán)重系數(shù)，復方夏枯草洗劑由夏枯草、生丹參、威靈仙、木賊等10味藥組成，夏枯草與生丹參為君藥，分別選取兩味藥材的主成分迷迭香酸和丹酚酸B為定量質(zhì)控指標；干浸膏收率也可反應本方中有效成分的提取效率，故也選定為考察指標，并給予相應權(quán)重系數(shù)。即迷迭香酸含量（W1）的權(quán)重系數(shù)為0.4，丹酚酸B含量（W2）的權(quán)重系數(shù)為 0.4，干浸膏收率（W3）的權(quán)重系數(shù)率為 0.2 進行加權(quán)求和[2]，綜合評分 W（%）=0.4W1/Wmax1+0.4W2/Wmax2+0.2W3/Wmax3。綜合加權(quán)評價結(jié)果見表9和表10。

由表7中結(jié)果分析可知，料液比和提取時間對提取效果無顯著影響。各因素對綜合評分的影響依次為 C＞B＞A，最優(yōu)提取工藝為 C3B1A1，即 1∶8，0.5 h，3次。最后確定最佳提取工藝為加8倍水，煎煮0.5h，提取3次。

2.6 驗證實驗 稱取1日處方量藥材，共3份，按照確定的最佳提取工藝C3B1A1進行驗證實驗，即加入8倍量的水，提取3次，每次0.5 h，提取液合并濃縮至 100 mL，按照“2.1.3”項下的方法制備供試品溶液，按照“2.1.1”項下方法測定迷迭香酸、丹酚酸 B的含量。實驗結(jié)果見表8，綜合評分值達113.21%～114.12%，結(jié)果顯示，該工藝準確可靠，可行性好，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。

表6 復方夏枯草洗劑提取工藝的L9（34）正交實驗設計與結(jié)果（n=3）Tab.6 L9(34)orthogonal design and results of optimizing extraction process for Compound Xiakucao Lotion(n=3)

表7 方差分析表Tab.7 Analysis of variance table

表8 驗證實驗結(jié)果Tab.8 Verify experimental results

3 討論

復方夏枯草洗劑中的君藥為夏枯草和生丹參，結(jié)合文獻資料，本文選用夏枯草、生丹參中主要成分迷迭香酸和丹酚酸B作為含量檢測指標[1-2]，其含量測定方法主要參考《中華人民共和國藥典》2015年版（一部）相關藥材項下含量測定方法[5]，2種指標性成分的檢測波長藥典中分別為330 nm和286 nm[5]，經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)采用波長286 nm，能很好地同時檢測到兩味藥材中主成分的含量，故采用此波長來檢測復方夏枯草洗劑樣品，同時結(jié)合相關文獻[6-8]進行制定。

尋常疣是一種發(fā)生于皮膚淺表的慢性良性贅生物，由人類乳頭瘤病毒（HPV）感染引起[9]。作為皮膚病門診中最常見的皮膚病之一，尋常疣雖然易于診斷，但由于可自身接種，臨床上治療非常棘手，復發(fā)率居高不下，對患者的生活質(zhì)量造成極大的影響。目前，臨床上尚無特異性抗病毒藥物可用于HPV感染，尋常疣有較多的治療方法，主要包括有兩類手段，一類是使用物理或化學方式直接損壞表皮的疣體，另一類是使用免疫調(diào)節(jié)劑改善人體的細胞免疫功能[10]。前者屬于有創(chuàng)治療，存在諸多弊端，如治療過程較為痛苦、容易形成創(chuàng)面、恢復周期長、容易感染等，并且有著較高的復發(fā)率。而使用免疫調(diào)節(jié)劑的有效率不佳，患者面臨較高的治療成本和時間成本。中藥外用治療尋常疣有一定的優(yōu)勢，具有毒副作用小、費用低廉、療效顯著等特點，應借助現(xiàn)代科學實驗技術進一步深入研究。

復方夏枯草洗劑為上海市第七人民醫(yī)院皮膚科的經(jīng)驗方，前期臨床研究結(jié)果表明復方夏枯草洗劑能夠有效減輕尋常疣的角質(zhì)增生與炎癥反應，療效顯著。本研究采用多指標綜合加權(quán)評分法優(yōu)選復方夏枯草洗劑提取工藝，確定最佳提取方法，為復方夏枯草洗劑的開發(fā)提供完備的實驗基礎，使其作為院內(nèi)制劑更規(guī)范化應用于臨床。