脂聯(lián)素基因單核苷酸多態(tài)性與多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗的關(guān)系研究

朱艷 周琴 安潔 張劍治 李娟

摘要：目的? 探討脂聯(lián)素濃度、脂聯(lián)素基因第2外顯子的+45T/G（rs2241766）和第2內(nèi)含子的+276G/T（rs1501299）兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)、PCOS伴胰島素抵抗（IR）三者的關(guān)系，并探討其是否可以為臨床診療及預(yù)后提供數(shù)據(jù)依據(jù)。方法? 收集2017年1月～2019年1月昆山市中醫(yī)醫(yī)院就診年齡在20～35歲，符合鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)的PCOS患者和正常人各100例。采用分子生物學(xué)的方法對(duì)脂聯(lián)素基因進(jìn)行分型。比較兩組臨床資料、脂聯(lián)素濃度及脂聯(lián)素基因分型。結(jié)果? PCOS組的雄激素、雌激素、促黃體生成素、胰島素、膽固醇、甘油三酯、血糖高于對(duì)照組（P<0.05）;對(duì)照組的促卵泡生成素、泌乳素低于 PCOS 組（P<0.05）;PCOS組脂聯(lián)素水平和IR存在線性關(guān)系（P<0.05）;對(duì)照組脂聯(lián)素基因多態(tài)位點(diǎn)+276G/T（ rs1501299）不符合 HWE 遺傳定律，組間無(wú)法比較;兩組+45T/G（rs2241766）位點(diǎn)的基因型（TT、TG、GG）頻率分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），此位點(diǎn)基因型頻率與脂聯(lián)素濃度、HOMA-IR進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論? PCOS 組的脂聯(lián)素水平和IR呈負(fù)相關(guān)，脂聯(lián)素基因+45T/G（rs2241766）位點(diǎn)基因分型與PCOS伴IR患者無(wú)顯著關(guān)系，可能不參與 PCOS 發(fā)生。

關(guān)鍵詞：多囊卵巢綜合征;胰島素抵抗;脂聯(lián)素濃度;脂聯(lián)素基因多態(tài)性;+276G/T（rs1501299）;+45T/G（rs2241766）

中圖分類(lèi)號(hào)：R711.75? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.22.025

文章編號(hào)：1006-1959（2020）22-0087-05

Study on the Relationship Between Adiponectin Gene Single Nucleotide Polymorphism

and Polycystic Ovary Syndrome with Insulin Resistance

ZHU Yan，ZHOU Qin，AN Jie，ZHANG Jian-zhi，LI Juan

（Department of Gynecology，Kunshan Traditional Chinese Medicine Hospital，Kunshan 215300，Jiangsu，China）

Abstract：Objective? To investigate the adiponectin concentration， the +45T/G （rs2241766） and +276G/T （rs1501299） polymorphisms in the second exon of the adiponectin gene， and PCOS with insulin resistance （IR） The relationship between the three and explore whether it can provide data for clinical diagnosis and treatment and prognosis.Methods? From January 2017 to January 2019， 100 PCOS patients and 100 normal people who were 20-35 years old and met the Rotterdam standard were collected from Kunshan Traditional Chinese Medicine Hospital. Adiponectin genes were typed using molecular biology methods. The clinical data， adiponectin concentration and genotype of adiponectin were compared between the two groups. Results? Androgen， estrogen， luteinizing hormone， insulin， cholesterol， triglyceride， and blood sugar in the PCOS group were higher than those in the control group， the difference was statistically significant （P<0.05）; the control group had low follicle stimulating hormone and prolactin the PCOS group， the difference was statistically significant （P<0.05）; there was a linear relationship between adiponectin levels and IR in the PCOS group （P<0.05）; Adiponectin gene polymorphic site +276G/T （rs1501299） in the control group does not comply with the HWE genetic law and cannot be compared between groups; the frequency of genotypes （TT， TG， GG） at +45T/G （rs2241766） sites in the two groups the distribution comparison showed no statistically significant difference （P>0.05）. The correlation analysis between the genotype frequency of this locus and the adiponectin concentration and HOMA-IR showed that the difference was not statistically significant （P>0.05）.Conclusion? The level of adiponectin in the PCOS group is negatively correlated with IR. The genotyping of adiponectin gene +45T/G （rs2241766） has no significant relationship with patients with PCOS with IR， and may not be involved in the occurrence of PCOS.

Key words：Polycystic ovary syndrome;Insulin resistance;Adiponectin concentration;Adiponectin gene polymorphism;+276G/T （rs1501299）;+45T/G （rs2241766）

多囊卵巢綜合征（PCOS）是一種多基因遺傳、臨床異質(zhì)性、不可治愈性、進(jìn)展性發(fā)展的內(nèi)分泌功能紊亂性疾病，具有較高的發(fā)病率，據(jù)近期流調(diào)學(xué)統(tǒng)計(jì)全球發(fā)病率為5%～15%，而在我國(guó)漢族育齡期女性中的發(fā)病率為5.6%，占排卵障礙性不孕癥的30%～60%，甚至更高，亟待解決[1]。PCOS目前仍病因不清，且缺乏有效的治療手段，尚無(wú)法達(dá)到完全恢復(fù)下丘腦-垂體-卵巢軸的平衡性，臨床也常見(jiàn)子宮內(nèi)膜病變、心理病變、乳腺疾病、代謝綜合征等[2]，嚴(yán)重影響了女性的身心健康。研究表明，脂肪組織可分泌出多種細(xì)胞因子來(lái)參與機(jī)體內(nèi)分泌代謝及免疫等活動(dòng)。脂聯(lián)素（APN）作為脂肪細(xì)胞分泌的主要的能量調(diào)節(jié)因子之一，與胰島素敏感性、葡萄糖攝取和脂質(zhì)代謝密切相關(guān)[3]。亦有研究證實(shí)了血清脂聯(lián)素與PCOS胰島素敏感性?xún)烧唛g有較強(qiáng)關(guān)聯(lián)性，認(rèn)為脂聯(lián)素不僅參與PCOS胰島素抵抗（IR）的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，同時(shí)也與PCOS的發(fā)病有關(guān)。但部分研究者持相反態(tài)度[4]，認(rèn)為脂聯(lián)素與PCOS沒(méi)有明顯的相互關(guān)系。近年來(lái)，脂聯(lián)素基因（ADIPOQ）與 PCOS相關(guān)性的研究也成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。目前研究已發(fā)現(xiàn)的ADIPOQ單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)就有近30個(gè)，大多集中在第2外顯子的rs2241766和第2內(nèi)含子的rs1501299兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)上。研究發(fā)現(xiàn)[5-7]，這2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與肥胖、心血管疾病、IR和2型糖尿病密切相關(guān)。但是目前為止，這兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與PCOS相關(guān)性的研究結(jié)果尚有爭(zhēng)議。本研究通過(guò)分析 ADIPOQ 的上述2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)在PCOS患者與對(duì)照組之間基因型及等位基因頻率分布的差異，及脂聯(lián)素濃度與PCOS間的關(guān)系，來(lái)研究其是否與PCOS發(fā)病存在相關(guān)性，以期為PCOS的病因探索提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料? 經(jīng)昆山市中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查同意，收集2017年1月～2019年1月昆山市中醫(yī)醫(yī)院就診年齡在20～35歲，BMI在19～24（kg/m2），排除標(biāo)準(zhǔn)：①近3個(gè)月內(nèi)使用抗生素、糖皮質(zhì)激素、避孕藥、促排藥、抗糖尿病藥、降壓藥、精神類(lèi)藥等藥物史;②近期任何手術(shù)史;③有胃腸道疾病、活動(dòng)性感染、吸煙酗酒者。符合疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)的PCOS患者100例，健康人群100例作為對(duì)照組，研究對(duì)象均知情同意。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)? 選用歐洲人類(lèi)生殖和胚胎學(xué)研究中心和美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)會(huì)（ESHRE/ASRM）2003年1月頒布的鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)作為病例診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除以下疾病：如卵巢或腎上腺分泌雄激素腫瘤、高催乳素血癥、低促性腺激素低性腺激素性閉經(jīng)、柯興氏綜合征（cushing）、遲發(fā)性先天性腎上腺皮質(zhì)增生、甲狀腺功能異常。臨床至少需符合下述3條標(biāo)準(zhǔn)的其中2條：①很少排卵或不排卵;②高雄激素的臨床和（或）生化表現(xiàn)（臨床如：多毛、痤瘡、男性型脫發(fā)，生化：高水平的血清睪酮（T）或游離T，或自由雄激素指數(shù)（FAI）或硫酸脫氫表雄酮（DHEAS）升高;③超聲下的改變：任何一側(cè)卵巢的直徑在29 mm，存在≥12個(gè)卵泡，或（和）卵巢的體積>10 ml。

1.3方法

1.3.1臨床指標(biāo)? 性激素、空腹血糖（FBG）、空腹胰島素（FINS），計(jì)算HOMA-IR水平[HOMA-IR=FINS（mU/L）×FBG（mmol/L）/22.5]、甘油三酯，膽固醇、脂聯(lián)素濃度。于月經(jīng)正常來(lái)潮或閉經(jīng)患者于孕酮撤退性出血月經(jīng)周期的第3天上午（9～10時(shí)）空腹并靜坐約15 min后再抽取肘靜脈血。并用含有EDTA的抗凝管收集5 ml靜脈血。取1 ml保存到EP管-80 ℃保存。將剩余的血液放入離心機(jī)中4 ℃，1500 rpm，離心10 min，收集管中上部分黃色血清放到-80 ℃保存。

1.3.2脂聯(lián)素基因分型檢測(cè)? 采取經(jīng)典酚-氯仿經(jīng)典方法提取外周血基因組DNA（基因組 DNA 提取試劑盒選自上海生工）。根據(jù)脂聯(lián)素基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)各個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增引物使用PCR擴(kuò)增目的基因片段。PCR擴(kuò)增引物序列見(jiàn)表1，PCR反應(yīng)體系（25 μl） 包含100 ng提取DNA，1.0 UTaq酶，2 μl上游以及下游引物2×PCR buffer。PCR反應(yīng)條件：95 ℃變性6 min，94 ℃ 30 s，60℃ 30 s，72 ℃45 s 30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。限制性?xún)?nèi)切酶酶SmaI和BsmI酶切（Themo，美國(guó)）。酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，加入3μl GelRed 核酸染料，電泳結(jié)束后，打開(kāi)凝膠顯影儀，觀察并記錄結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? 本研究資料采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。運(yùn)用Shapiro-Wilk test結(jié)合正態(tài)圖檢驗(yàn)所分析數(shù)據(jù)的正態(tài)性?；蚨鄳B(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行 HEW 遺傳平衡檢驗(yàn)。按照定律所述，通過(guò)各種基因型的頻率計(jì)算等位基因的頻率，由等位基因的頻率計(jì)算出期望頻率值。將實(shí)際頻率值和期望頻率值進(jìn)行？字2檢驗(yàn)，如果P>0.05，那么觀望值符合預(yù)期值，結(jié)果符合HWE定律;如果P<0.05，則觀望值不符合預(yù)期值，結(jié)果不符合HWE定律。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（x±s）表示，兩組樣本均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，配對(duì)樣本均數(shù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，偏態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù) M（Q25，Q75）表示，采用兩獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)，多組比較采用秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組一般資料比較? PCOS組雄激素、雌激素、促黃體生成素、促卵泡生成激素、泌乳素、胰島素、膽固醇、甘油三酯、血糖、HOMA-IR高于對(duì)照組，脂聯(lián)素低于對(duì)照組，PCOS組初潮月經(jīng)紊亂發(fā)生率高于對(duì)照組（P<0.05）;兩組年齡、BMI、如飲酒、教育情況、體力勞動(dòng)情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表2。