• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    流式細(xì)胞儀在本科生“分子生物學(xué)”課程實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用與實(shí)踐

    2020-12-23 04:19:23牛熙李升齊芬芳
    教育教學(xué)論壇 2020年45期
    關(guān)鍵詞:實(shí)驗(yàn)課程分子生物學(xué)

    牛熙 李升 齊芬芳

    [摘 要]為了能夠讓本科“分子生物學(xué)”實(shí)驗(yàn)課程更為新穎和豐富,提高大型儀器流式細(xì)胞儀的使用效率,根據(jù)分子生物學(xué)課程的實(shí)驗(yàn)教學(xué)特點(diǎn),結(jié)合理論教學(xué)的同時(shí),在實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)中使用流式細(xì)胞儀開展細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期檢測實(shí)驗(yàn)。通過實(shí)驗(yàn)課的開展,鍛煉學(xué)生基本實(shí)驗(yàn)技能,為今后科研工作打下良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

    [關(guān)鍵詞]流式細(xì)胞儀;分子生物學(xué);實(shí)驗(yàn)課程

    [基金項(xiàng)目]2019年貴州大學(xué)本科教學(xué)工程建設(shè)項(xiàng)目“貴州大學(xué)分子生物學(xué)課程本科教學(xué)工程建設(shè)項(xiàng)目”(JG201977);2018年貴州大學(xué)培育項(xiàng)目“香豬卵巢繁殖力相關(guān)lncRNA的鑒定與生物學(xué)功能分析”(黔科合平臺人才〔2018〕5781-40號);2015年貴州科技廳與貴州大學(xué)聯(lián)合基金項(xiàng)目“PDIA4基因多態(tài)性與香豬產(chǎn)仔數(shù)性狀關(guān)聯(lián)研究”(黔科合LH字〔2015〕7673)

    [作者簡介]牛 熙(1987—),女,貴州貴陽人,碩士,在讀博士,貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院實(shí)驗(yàn)師,研究方向?yàn)閯游锓肿由飳W(xué);齊芬芳(1986—),女,湖南株洲人,碩士,貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院博士研究生,遵義醫(yī)藥高等??茖W(xué)校講師(通信作者),研究方向?yàn)槲⑸锛皠游锓肿由飳W(xué)。

    [中圖分類號] G642.0[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A[文章編號] 1674-9324(2020)45-0-03[收稿日期] 2020-05-14

    20世紀(jì)50年代以來,以實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)作為生物學(xué)的前沿學(xué)科,其實(shí)驗(yàn)課的教學(xué)內(nèi)容就十分重要。[1-3]以貴州大學(xué)為例,目前本科生雖然開展的分子生物學(xué)課程,但仍以一些基本的實(shí)驗(yàn)操作為主,如動物基因組DNA提取,PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳、目的片段膠回收、大腸桿菌感受態(tài)的制備、目的基因連接與轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、植物葉片RNA的提取等,實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目較為簡單,造成本科生科研經(jīng)驗(yàn)和科研能力不足等問題。高校大型精密儀器作為提升實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量、培養(yǎng)高素質(zhì)人才,提高科研水平的重要保障條件[4-6],在本科生實(shí)驗(yàn)教學(xué)中增加大型精密儀器的使用,可讓本科生在掌握基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的同時(shí),為今后的科研提供較好的學(xué)習(xí)平臺。目前為了提升本科生的科研技能,貴州大學(xué)雖然開展了本科SRT項(xiàng)目設(shè)計(jì)、大學(xué)生創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新項(xiàng)目和實(shí)驗(yàn)室設(shè)備管理處開放項(xiàng)目[7],但只受益于部分本科生,大型精密儀器在本科實(shí)驗(yàn)中尚未普及。

    流式細(xì)胞儀(flow cytometer,F(xiàn)CM)作為大型精密儀器,能對處在直線、快速、流動狀態(tài)中的單個(gè)細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行分析及精確分選,目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和臨床檢驗(yàn)等領(lǐng)域[8-11]。因此,在本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中加入流式細(xì)胞儀的掌握,除了能夠提高大型精密儀器的使用效率,同時(shí)讓更多的本科生能夠有機(jī)會熟悉和掌握大型精密儀器的原理、方法和操作,提升學(xué)生的科研競爭力。

    目前貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院通過建設(shè),已擁有了能夠面向校內(nèi)外科研人員的生物科學(xué)大型儀器共享平臺[12]。目前該平臺主要開展了對外分析測試服務(wù),針對生物學(xué)學(xué)科教學(xué)主要是以參觀教學(xué)為主。我院流式細(xì)胞儀型號為BDFACS Aria Ⅱ(分析/分選型),除用于藥學(xué)相關(guān)研究外,還在本校的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備管理處開放項(xiàng)目資助下,結(jié)合理論課向部分本科生開放細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期以及黏蛋白13(mucin13,MUC13)與產(chǎn)腸毒素大腸桿菌F4ac型的結(jié)合實(shí)驗(yàn),取得了較好的實(shí)驗(yàn)效果。為了能夠讓更多的本科生了解流式細(xì)胞術(shù),計(jì)劃在本科生“分子生物學(xué)”課程實(shí)驗(yàn)教學(xué)中增加相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

    一、流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)和工作原理

    流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)主要包括以下幾個(gè)部分:(1)光學(xué)系統(tǒng)。由于流式細(xì)胞儀器主要是通過對光信號的采集和檢測來對樣品進(jìn)行分析的,因此光學(xué)系統(tǒng)在流式細(xì)胞儀中有著最為重要的作用。它由激發(fā)光源和若干組透鏡、濾光片和分光鏡等光學(xué)元件組成。(2)電子系統(tǒng)。電子系統(tǒng)作為流式細(xì)胞儀的大腦,主要負(fù)責(zé)將探測器產(chǎn)生的光電流信號進(jìn)行數(shù)字化,處理信號并儲存相關(guān)數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析。該系統(tǒng)主要由光電轉(zhuǎn)換器件、放大器和信號處理電路組成。(3)液流系統(tǒng)。該系統(tǒng)是由鞘液系統(tǒng)和樣品流動系統(tǒng)組成,主要負(fù)責(zé)將測試樣本從樣品管轉(zhuǎn)移至流動室,在鞘液的作用下,得到準(zhǔn)確的細(xì)胞熒光信息,然后樣品被分選出來(在細(xì)胞分選儀中)或移到廢液中。(4)數(shù)據(jù)系統(tǒng)。流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)系統(tǒng)主要是通過計(jì)算機(jī)以及分析軟件保障儀器運(yùn)行、數(shù)據(jù)的采集和分析。除上述固定基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)外,具有分選功能的流式細(xì)胞儀還包括分選系統(tǒng),該系統(tǒng)能根據(jù)某類細(xì)胞的特性,給這類細(xì)胞的液滴充以特定電荷,帶電荷的液滴進(jìn)入偏轉(zhuǎn)板靜電場時(shí)發(fā)生向左偏轉(zhuǎn)或向右偏轉(zhuǎn),落入固定的收集器內(nèi),不帶電的液滴則直接進(jìn)入到廢液槽中,從而達(dá)到獲得特定細(xì)胞的目的[13-15]。

    二、實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)

    以敵敵畏對人腎細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響為研究對象,結(jié)合學(xué)校實(shí)際情況、實(shí)驗(yàn)運(yùn)行成本及操作難度、時(shí)間等因素,計(jì)劃在本科生《分子生物學(xué)》課程實(shí)驗(yàn)教學(xué)中開展細(xì)胞凋亡檢測和細(xì)胞周期檢測2個(gè)實(shí)驗(yàn)。

    流式細(xì)胞儀的教學(xué)可分成理論教學(xué)和實(shí)驗(yàn)操作兩個(gè)部分。理論教學(xué)部分主要以教師集中授課方式進(jìn)行,教學(xué)內(nèi)容主要分為三個(gè)部分:(1)課堂講授流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展簡史及流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)和工作原理;(2)采取儀器現(xiàn)場觀摩、學(xué)生分組輪換的形式向?qū)W生闡述待測標(biāo)本經(jīng)過儀器的各結(jié)構(gòu)的情況,將流式細(xì)胞儀的檢測原理拓展并貫穿至儀器的各個(gè)結(jié)構(gòu)中,使學(xué)生對流式細(xì)胞儀有個(gè)比較清晰的認(rèn)識;(3)根據(jù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)向?qū)W生講授細(xì)胞凋亡檢測和細(xì)胞周期檢測實(shí)驗(yàn)的原理、方法、步驟、注意事項(xiàng)及考查方式等[13]。實(shí)驗(yàn)操作部分則以學(xué)生自主學(xué)習(xí)為主:首先在保障儀器對外服務(wù)的同時(shí),采取現(xiàn)場教學(xué)的方式對學(xué)生進(jìn)行儀器使用培訓(xùn);然后根據(jù)儀器使用情況及班級人數(shù),按照分組進(jìn)行細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的檢測;最后分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果,完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告[6]。

    三、實(shí)驗(yàn)實(shí)操部分課程設(shè)計(jì)

    (一)儀器使用培訓(xùn)

    儀器使用培訓(xùn)的教學(xué)內(nèi)容主要包括4個(gè)方面:(1)演示開機(jī)程序:首先確認(rèn)是否需要添加鞘液及傾倒廢液;然后逐一打開穩(wěn)壓電源、計(jì)算機(jī)、儀器主開關(guān)、激光光源控制器、控制軟件;最后強(qiáng)調(diào)開機(jī)過程中的注意事項(xiàng)。(2)運(yùn)行儀器控制軟件,講解軟件的構(gòu)成和使用。(3)利用BD公司培訓(xùn)用熒光微球,用單色和雙色實(shí)驗(yàn)演示細(xì)胞凋亡(Annexin V-FITC/PI雙色)及細(xì)胞周期(PI單色)的分析檢測方法。(4)演示關(guān)機(jī)程序及強(qiáng)調(diào)日常維護(hù)的注意事項(xiàng)。

    (二)實(shí)驗(yàn)操作設(shè)計(jì)

    1.實(shí)驗(yàn)一:敵敵畏對人腎細(xì)胞凋亡的影響。制備293T人腎細(xì)胞懸液(1×106cells/mL)。向12孔細(xì)胞培養(yǎng)板板中加入1mL細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng)至貼壁(5%CO2、37℃)后,加入含有不同濃度敵敵畏(可由學(xué)生自行設(shè)計(jì))的培養(yǎng)液處理1h。用胰蛋白酶消化細(xì)胞后收集于1.5mL的離心管中,低速短時(shí)離心后(1000r/min離心3min),加入PH7.5的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)清洗2~3次。將清洗后的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液(1~5×106 cells/mL),根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入適量的Binding Buffer懸浮細(xì)胞(100~500μL)。根據(jù)試劑盒說明書,向制好的懸浮細(xì)胞中加入適量Annexin V-FITC混勻后,再加入適量Propidium Iodide(PI)混勻,反應(yīng)5~15min(室溫避光)。所有樣品必須在1h內(nèi)進(jìn)行檢測[16,17]。

    2.實(shí)驗(yàn)二:敵敵畏對人腎細(xì)胞周期的影響。取293T人腎細(xì)胞(濃度:1×106cells/mL;狀態(tài):對數(shù)生長期)接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。在5%CO2、37℃的條件下培養(yǎng)細(xì)胞貼壁后,向293T人腎細(xì)胞加入含有不同濃度敵敵畏(可由學(xué)生自行設(shè)計(jì))的培養(yǎng)液。1h后,用胰蛋白酶處理并收集細(xì)胞。用PBS處理細(xì)胞后(2~3次),制成適當(dāng)濃度的單細(xì)胞懸液。取3mL單細(xì)胞懸液,1000r/min離心3min,去除上清液后,逐滴加入預(yù)冷的無水乙醇1.5ml(乙醇終濃度為75%),-20℃固定過夜。取出固定后的樣品,低速離心去除上清液。用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞后,低速離心收集細(xì)胞。加入RNaseA 150μL重懸細(xì)胞(需用PBS稀釋,濃度為250~500ug/ml)。最后加入150μL PI工作液,4℃避光染色30min,上機(jī)檢測[16]。

    (三)結(jié)果與分析

    1.實(shí)驗(yàn)一:敵敵畏對人腎細(xì)胞凋亡的影響。在正常人腎細(xì)胞中,磷脂酰絲氨酸(PhosphatidyISerine,PS)通常只分散在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè),經(jīng)過不同濃度敵敵畏處理后,人腎細(xì)胞就會發(fā)生不同程度凋亡。在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期,細(xì)胞膜中的PS會由細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V作為Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白(分子量為35~36kD),能特異性結(jié)合PS,故可利用用異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate,F(xiàn)ITC)標(biāo)記后的Annexin V鑒別出發(fā)生早期凋亡的細(xì)胞。碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)作為一種核酸染料,不能透過完整的細(xì)胞膜,而在中晚期凋亡細(xì)胞或者死亡細(xì)胞中,細(xì)胞核能被透過細(xì)胞膜的PI染紅。因此通常在細(xì)胞凋亡試劑盒中,使用Annexin V與PI來檢測處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞[11,12]。實(shí)驗(yàn)操作及數(shù)據(jù)分析均有學(xué)生自己獨(dú)立完成。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的結(jié)果后,學(xué)生利用軟件所給的雙參點(diǎn)數(shù)圖(圖1)[12],區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和死細(xì)胞,同時(shí)總結(jié)不同濃度敵敵畏處理人腎細(xì)胞后,細(xì)胞凋亡率、早期凋亡率、晚期凋亡率,分析敵敵畏對人腎細(xì)胞凋亡的影響。

    2.實(shí)驗(yàn)二:敵敵畏對人腎細(xì)胞周期的影響。在不同細(xì)胞周期狀態(tài)下,DNA的含量是不同的,其中G2/M期細(xì)胞的核酸含量是G0/G1期細(xì)胞的2倍。熒光染料PI可與雙鏈DNA分子特異性的結(jié)合,熒光強(qiáng)度的多少可以用來確定細(xì)胞中DNA的含量,從而明確細(xì)胞所處的周期狀態(tài)[16]。實(shí)驗(yàn)操作及數(shù)據(jù)分析均有學(xué)生自己獨(dú)立完成。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的結(jié)果后,學(xué)生利用MODFIT軟件分析單參數(shù)直方圖(圖2),學(xué)會分析細(xì)胞周期圖,分析細(xì)胞周期各時(shí)期所占比例,從而明確不同濃度敵敵畏對人腎細(xì)胞周期的影響[17]。

    四、結(jié)語

    目前,流式細(xì)胞儀已在醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等課程的實(shí)驗(yàn)教學(xué)中得到了應(yīng)用,但在分子生物學(xué)課程中的實(shí)驗(yàn)教學(xué)較少。隨著多學(xué)科交叉研究越來越廣泛,將流式細(xì)胞儀應(yīng)用在分子生物學(xué)課程實(shí)驗(yàn)教學(xué)中就顯得比較重要。將該實(shí)驗(yàn)課引入到本科生的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)課程,在最大程度發(fā)揮學(xué)校大型儀器資源優(yōu)勢的同時(shí),讓學(xué)生掌握基本實(shí)驗(yàn)技能,提高學(xué)生科研分析能力。

    參考文獻(xiàn)

    [1]柏素花.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的實(shí)踐與探討[J].科技信息(學(xué)術(shù)研究),2008(8):110-111.

    [2]李小潔,唐璟,童淑芬.本科生分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教改中存在的問題及對策[J].科技信息,2011(9):188,412.

    [3]崔銀秋,林鳳,逯家輝,等.建立與科研課題結(jié)合的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)新模式[J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索,2009,28(11):109-111.

    [4]許建峰.對高校大型儀器設(shè)備管理現(xiàn)狀分析與思考[J].實(shí)驗(yàn)室科學(xué),2012,15(4):193-196.

    [5]李建容,曾曉芳,趙德剛.自動嫁接機(jī)在高校實(shí)驗(yàn)教學(xué)課程中的應(yīng)用研究[J].中國多媒體與網(wǎng)絡(luò)教學(xué)學(xué)報(bào)(上旬刊),2019(9): 28-29.

    [6]吳安慶,聶晶,裴海龍,等.流式細(xì)胞儀在放射生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用[J].實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理,2017,34(1):184-186,190.

    [7]耿慧霞,王來,王強(qiáng).流式細(xì)胞儀在生物學(xué)中的應(yīng)用[J].生物學(xué)雜志,2005(4):44-45,51.

    [8]趙雷.17-DMAG對EGFR-TKI耐藥的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549和H1975作用的體外研究[D].石家莊:河北醫(yī)科大學(xué),2013.

    [9]閻璐.H.pylori對人牙周膜成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期影響的研究[D].太原:山西醫(yī)科大學(xué),2011.

    [10]喬光,洪怡.大型儀器設(shè)備在本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中使用問題的探討[J].實(shí)驗(yàn)室科學(xué),2017,20(4):207-209.

    [11]梁智輝,朱慧芬,陳九武.流式細(xì)胞術(shù)基本原理與實(shí)用技術(shù)[M].武漢:華中科技大學(xué)出版社,2008.

    [12]王書奎,周振英.實(shí)用流式細(xì)胞術(shù)彩色圖譜[M].上海:第二軍醫(yī)大學(xué)出版社,2004.

    [13]章海榮,韓玲,王萬銀,等.流式細(xì)胞儀在航海醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的設(shè)計(jì)與應(yīng)用[J].中國現(xiàn)代教育裝備,2015(17):19-21.

    [14]盧圣菲,冉雪琴,牛熙,等.印楝素對豬睪丸ST細(xì)胞的生長和基因表達(dá)的影響[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2019,27(4):677-683.

    [15]許亞楠,劉暢,張策,等.敵敵畏對腎細(xì)胞系293T增殖的影響[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2017,36(3):1184-1188.

    [16]江育瑩,包旭,李宏,等.化合物ZWF對A549細(xì)胞遷移、細(xì)胞周期和凋亡的作用[J].華西藥學(xué)雜志,2020,35(2):167-170.

    [17]劉華,張林西.流式細(xì)胞儀在細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革中的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(11):6958-6959.

    Discussion on the Application of Flow Cytometrer in the Experimental Teaching

    of "Molecular Biology" for Undergraduates

    NIU Xi1, LI Sheng1, QI Fen-fang1,2

    (1. Institute of Agro-Bioengineering, Guizhou University, Guiyang, Guizhou 550025, China;

    2. Zunyi Medical and Pharmaceutical College, Zunyi, Guizhou 563006, China)

    Abstract: According to the characteristics of experimental teaching in Molecular Biology, an opinion was proposed that flow cytometrer was used to detect cell apoptosis and cell cycle in experimental teaching of "Molecular Biology" for undergraduates. These experiments are carried out in order to enrich the content of experimental courses and improve the utilization rate of instruments. Through the practice of these experiments, students can improve their experimental skills. The course also can lay a good foundation for the technology work and scientific research and design in the future.

    Key words: flow cytometrer; Molecular Biology; experiment course

    猜你喜歡
    實(shí)驗(yàn)課程分子生物學(xué)
    西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)系
    中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系
    基于應(yīng)用型人才培養(yǎng)的網(wǎng)絡(luò)安全技術(shù)實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)改革
    亞太教育(2016年34期)2016-12-26 18:33:32
    淺析高中化學(xué)實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)方法改革
    亞太教育(2016年35期)2016-12-21 20:06:26
    智能信息處理實(shí)驗(yàn)課程建設(shè)
    關(guān)于采礦工程專業(yè)采煤學(xué)實(shí)驗(yàn)課程設(shè)置的探討
    本科生分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)教學(xué)改革初探
    以會計(jì)學(xué)為例建設(shè)財(cái)經(jīng)類實(shí)驗(yàn)課程體系
    商情(2016年40期)2016-11-28 09:42:42
    電視新聞攝像實(shí)驗(yàn)課程的基本教學(xué)方案
    ABO亞型Bel06的分子生物學(xué)鑒定
    欧美乱色亚洲激情| 欧美乱码精品一区二区三区| 久久久久性生活片| 欧美乱妇无乱码| 丰满人妻一区二区三区视频av | 中文字幕久久专区| 国产精品99久久久久久久久| 级片在线观看| 欧美国产日韩亚洲一区| 美女 人体艺术 gogo| 岛国在线免费视频观看| 精品乱码久久久久久99久播| 国产精品,欧美在线| 无遮挡黄片免费观看| 欧美三级亚洲精品| 国产乱人伦免费视频| 国产伦精品一区二区三区四那| 91麻豆av在线| 99热6这里只有精品| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 麻豆成人午夜福利视频| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲九九香蕉| 国产精品精品国产色婷婷| 热99在线观看视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 久久国产精品影院| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲专区字幕在线| 少妇的逼水好多| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 婷婷丁香在线五月| 香蕉国产在线看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 日本a在线网址| 嫩草影院精品99| 成在线人永久免费视频| 舔av片在线| 一个人免费在线观看的高清视频| 成年女人永久免费观看视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产高清视频在线观看网站| 亚洲激情在线av| 亚洲国产看品久久| 国产主播在线观看一区二区| 久久这里只有精品中国| 国产精品久久久人人做人人爽| 91av网一区二区| 一级a爱片免费观看的视频| 精品人妻1区二区| 国产乱人视频| 2021天堂中文幕一二区在线观| 一进一出抽搐gif免费好疼| 色哟哟哟哟哟哟| 亚洲成人免费电影在线观看| 国内精品美女久久久久久| 97碰自拍视频| 午夜影院日韩av| 欧美在线黄色| 丰满的人妻完整版| 国产精品久久久久久精品电影| 色在线成人网| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产三级中文精品| 村上凉子中文字幕在线| 色噜噜av男人的天堂激情| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产精品免费一区二区三区在线| 88av欧美| 88av欧美| 九九热线精品视视频播放| 日本精品一区二区三区蜜桃| 九九热线精品视视频播放| 天堂√8在线中文| 免费大片18禁| or卡值多少钱| 狠狠狠狠99中文字幕| 床上黄色一级片| a级毛片a级免费在线| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲人成伊人成综合网2020| 天堂影院成人在线观看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 99热这里只有是精品50| 欧美大码av| 无限看片的www在线观看| 午夜福利在线在线| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲五月天丁香| 特大巨黑吊av在线直播| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产高潮美女av| 深夜精品福利| 香蕉丝袜av| 九九热线精品视视频播放| 90打野战视频偷拍视频| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲成av人片免费观看| 欧美3d第一页| 麻豆国产av国片精品| 国产三级中文精品| 国产精品久久久久久久电影 | 久久久久精品国产欧美久久久| 中出人妻视频一区二区| 性欧美人与动物交配| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲av成人精品一区久久| 欧美最黄视频在线播放免费| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 成年女人看的毛片在线观看| 久久精品91蜜桃| 三级国产精品欧美在线观看 | 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲成a人片在线一区二区| 久久久国产成人精品二区| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲第一电影网av| 99热精品在线国产| 免费看光身美女| 成年女人看的毛片在线观看| 日韩欧美精品v在线| 久久99热这里只有精品18| 亚洲中文av在线| 18禁美女被吸乳视频| 午夜福利在线观看吧| 操出白浆在线播放| 亚洲国产中文字幕在线视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲专区字幕在线| 亚洲熟女毛片儿| 久久欧美精品欧美久久欧美| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 88av欧美| 18禁美女被吸乳视频| 国产真实乱freesex| 国产成人欧美在线观看| 男女那种视频在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 一区二区三区国产精品乱码| 国产精品亚洲美女久久久| 国产亚洲av高清不卡| 成人av一区二区三区在线看| 精品久久久久久,| 一进一出好大好爽视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 最近视频中文字幕2019在线8| 日韩av在线大香蕉| 母亲3免费完整高清在线观看| 好男人在线观看高清免费视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 99热6这里只有精品| 校园春色视频在线观看| 中文字幕av在线有码专区| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 亚洲在线观看片| 天堂网av新在线| 黑人操中国人逼视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲,欧美精品.| 天堂√8在线中文| 日韩欧美 国产精品| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 成人国产一区最新在线观看| 一本一本综合久久| 婷婷六月久久综合丁香| 美女免费视频网站| 色综合亚洲欧美另类图片| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国产精品 国内视频| xxxwww97欧美| 级片在线观看| 黑人操中国人逼视频| 国产一区二区三区视频了| 久久人人精品亚洲av| 久久这里只有精品中国| 校园春色视频在线观看| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲av五月六月丁香网| 身体一侧抽搐| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产精品一区二区三区四区久久| 制服丝袜大香蕉在线| 国产精华一区二区三区| 一本一本综合久久| 99久久精品国产亚洲精品| 高清在线国产一区| 成人精品一区二区免费| 国产精品亚洲一级av第二区| 91av网一区二区| 国产免费男女视频| 国产av麻豆久久久久久久| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 精品一区二区三区视频在线 | 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国产激情欧美一区二区| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产午夜精品论理片| 99视频精品全部免费 在线 | 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 51午夜福利影视在线观看| 久久久国产成人免费| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲一区二区三区不卡视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 午夜影院日韩av| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲av熟女| 国产真实乱freesex| 老司机福利观看| 久久精品国产综合久久久| 国产高清视频在线播放一区| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 五月玫瑰六月丁香| 18禁美女被吸乳视频| 国产成人aa在线观看| 级片在线观看| 99久久精品一区二区三区| 欧美日韩精品网址| 久久久久久人人人人人| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 久久久久久国产a免费观看| 老鸭窝网址在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产高清三级在线| h日本视频在线播放| 久久人人精品亚洲av| 国产高清视频在线观看网站| 性色av乱码一区二区三区2| 毛片女人毛片| 欧美3d第一页| 波多野结衣巨乳人妻| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲五月天丁香| 99久国产av精品| 中文资源天堂在线| 91字幕亚洲| 国产精品,欧美在线| 色精品久久人妻99蜜桃| 女人被狂操c到高潮| 在线观看舔阴道视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 色综合亚洲欧美另类图片| 91在线精品国自产拍蜜月 | 一本一本综合久久| 欧美大码av| 成年版毛片免费区| 一a级毛片在线观看| 日本a在线网址| 夜夜夜夜夜久久久久| 一级毛片高清免费大全| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产欧美日韩精品亚洲av| 老鸭窝网址在线观看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产亚洲精品一区二区www| 午夜福利高清视频| 精品人妻1区二区| 久久中文看片网| 夜夜爽天天搞| 婷婷丁香在线五月| 日韩精品中文字幕看吧| 欧美又色又爽又黄视频| 97超视频在线观看视频| 欧美激情在线99| x7x7x7水蜜桃| 亚洲av片天天在线观看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产成人精品久久二区二区91| 成年女人毛片免费观看观看9| 波多野结衣巨乳人妻| 久久欧美精品欧美久久欧美| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 麻豆成人午夜福利视频| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 麻豆久久精品国产亚洲av| 88av欧美| 久久久色成人| 麻豆一二三区av精品| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲中文av在线| 久久九九热精品免费| 中文字幕久久专区| 成人av一区二区三区在线看| 热99在线观看视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 成人亚洲精品av一区二区| 热99re8久久精品国产| 露出奶头的视频| 成年人黄色毛片网站| 成人一区二区视频在线观看| 好男人电影高清在线观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 精品电影一区二区在线| 深夜精品福利| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲av片天天在线观看| 午夜福利在线在线| 亚洲av第一区精品v没综合| 黄色丝袜av网址大全| 午夜两性在线视频| 99久久精品热视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 麻豆一二三区av精品| 亚洲精品在线观看二区| 叶爱在线成人免费视频播放| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产高潮美女av| 免费大片18禁| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲色图av天堂| 国产精品一及| 一本久久中文字幕| 怎么达到女性高潮| 亚洲专区中文字幕在线| 91av网站免费观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲av美国av| 免费在线观看亚洲国产| 亚洲av五月六月丁香网| 天堂动漫精品| 男人和女人高潮做爰伦理| 免费一级毛片在线播放高清视频| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲av熟女| 级片在线观看| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 一本精品99久久精品77| 99国产极品粉嫩在线观看| 男女视频在线观看网站免费| 国产成人av激情在线播放| 色在线成人网| 嫁个100分男人电影在线观看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 两个人的视频大全免费| 成人特级av手机在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 一个人看的www免费观看视频| 五月玫瑰六月丁香| 美女 人体艺术 gogo| 成人国产综合亚洲| 91麻豆精品激情在线观看国产| 高清毛片免费观看视频网站| 可以在线观看毛片的网站| 久久国产乱子伦精品免费另类| 老鸭窝网址在线观看| 九色国产91popny在线| 欧美又色又爽又黄视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 天堂网av新在线| 精品电影一区二区在线| 精品免费久久久久久久清纯| 精品日产1卡2卡| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲国产欧美人成| 国产单亲对白刺激| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国产精品爽爽va在线观看网站| 欧美成人免费av一区二区三区| 小说图片视频综合网站| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产69精品久久久久777片 | 巨乳人妻的诱惑在线观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 麻豆一二三区av精品| 亚洲成人中文字幕在线播放| 毛片女人毛片| 特级一级黄色大片| 深夜精品福利| xxxwww97欧美| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 一进一出抽搐gif免费好疼| 日韩欧美免费精品| 久久国产精品人妻蜜桃| 日韩欧美国产一区二区入口| 欧美黑人巨大hd| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 1024香蕉在线观看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| av福利片在线观看| 国产三级黄色录像| 欧美一级毛片孕妇| 波多野结衣高清无吗| 两性夫妻黄色片| 国产乱人伦免费视频| 极品教师在线免费播放| 国产成人av激情在线播放| av国产免费在线观看| 麻豆成人午夜福利视频| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 日本三级黄在线观看| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产精品98久久久久久宅男小说| 99在线人妻在线中文字幕| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 婷婷精品国产亚洲av在线| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲一区二区三区不卡视频| 色吧在线观看| 99久久国产精品久久久| 国产亚洲av高清不卡| 精品国产乱码久久久久久男人| 高潮久久久久久久久久久不卡| 最新中文字幕久久久久 | 亚洲第一电影网av| 日韩精品青青久久久久久| 99国产精品一区二区蜜桃av| 在线免费观看不下载黄p国产 | 少妇丰满av| 久99久视频精品免费| 中文亚洲av片在线观看爽| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 五月伊人婷婷丁香| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲电影在线观看av| 国产成人精品久久二区二区91| 欧美乱码精品一区二区三区| 精品乱码久久久久久99久播| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产爱豆传媒在线观看| 国产精品av久久久久免费| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 草草在线视频免费看| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 久久热在线av| 国产爱豆传媒在线观看| 好男人电影高清在线观看| 一夜夜www| 脱女人内裤的视频| 少妇丰满av| bbb黄色大片| 久久国产精品影院| 麻豆国产97在线/欧美| 久久人妻av系列| 99re在线观看精品视频| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 在线播放国产精品三级| 久久精品人妻少妇| 欧美乱妇无乱码| 亚洲国产精品合色在线| 久久久久久大精品| 国内精品久久久久精免费| 国产真人三级小视频在线观看| 欧美日韩一级在线毛片| 老司机在亚洲福利影院| 成人特级av手机在线观看| 亚洲在线观看片| 91麻豆精品激情在线观看国产| 国产激情久久老熟女| 午夜福利18| 女警被强在线播放| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 亚洲精华国产精华精| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 91av网站免费观看| 亚洲午夜理论影院| 国产黄a三级三级三级人| 久久久久精品国产欧美久久久| 最新中文字幕久久久久 | 国产高清videossex| 精品久久久久久,| 午夜精品久久久久久毛片777| 全区人妻精品视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲无线观看免费| 露出奶头的视频| 99久久精品一区二区三区| 哪里可以看免费的av片| 国产精品永久免费网站| www日本黄色视频网| 久久午夜亚洲精品久久| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲精品色激情综合| 久久草成人影院| 亚洲真实伦在线观看| 日韩有码中文字幕| 曰老女人黄片| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲av成人一区二区三| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 亚洲天堂国产精品一区在线| 久久亚洲精品不卡| 精品午夜福利视频在线观看一区| 波多野结衣高清无吗| 久99久视频精品免费| 日本黄大片高清| 禁无遮挡网站| 又紧又爽又黄一区二区| 免费搜索国产男女视频| 99国产精品一区二区三区| 国产精品精品国产色婷婷| 免费在线观看日本一区| 国产精品一区二区三区四区久久| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 美女午夜性视频免费| 成人鲁丝片一二三区免费| 久久欧美精品欧美久久欧美| 久久九九热精品免费| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 夜夜爽天天搞| 手机成人av网站| 男女之事视频高清在线观看| 一个人看视频在线观看www免费 | 中文字幕人成人乱码亚洲影| 夜夜夜夜夜久久久久| 欧美日本亚洲视频在线播放| xxxwww97欧美| 久久久久亚洲av毛片大全| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 他把我摸到了高潮在线观看| 免费在线观看成人毛片| 男人舔奶头视频| av女优亚洲男人天堂 | 免费看十八禁软件| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲无线在线观看| 99国产精品99久久久久| 亚洲中文av在线| 国内精品久久久久精免费| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲在线观看片| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久久精品大字幕| 亚洲av成人av| 免费在线观看日本一区| 日韩三级视频一区二区三区| 国产欧美日韩精品一区二区| 精品乱码久久久久久99久播| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产精品免费一区二区三区在线| 一本精品99久久精品77| 99久久精品一区二区三区| 深夜精品福利| 看免费av毛片| 亚洲无线在线观看| 中文字幕久久专区| 最新中文字幕久久久久 | 看片在线看免费视频| 色在线成人网| 国产精品av久久久久免费| 日韩欧美在线乱码| 综合色av麻豆| 国产熟女xx| 亚洲av第一区精品v没综合| 搞女人的毛片| 精品免费久久久久久久清纯| 日本熟妇午夜| 亚洲黑人精品在线| 日本成人三级电影网站| 国产成人影院久久av| 久久国产精品影院| 高清毛片免费观看视频网站| 国产99白浆流出| 1024手机看黄色片| 一区二区三区高清视频在线| 成人性生交大片免费视频hd| 999久久久国产精品视频| 黄色片一级片一级黄色片| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 大型黄色视频在线免费观看| 国产成人aa在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 欧美中文日本在线观看视频| 搡老岳熟女国产| 国产成人啪精品午夜网站| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲avbb在线观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 99久久综合精品五月天人人| 国内揄拍国产精品人妻在线| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 99久久精品热视频| 国产精品一区二区免费欧美| www.999成人在线观看| 怎么达到女性高潮| 日韩三级视频一区二区三区| 国产1区2区3区精品| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 看黄色毛片网站| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 中文字幕高清在线视频| 午夜福利免费观看在线| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产黄色小视频在线观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 天天添夜夜摸| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 丝袜人妻中文字幕| 国产极品精品免费视频能看的| 后天国语完整版免费观看| 精品电影一区二区在线|