基于時間、OD600值及平板計數(shù)法測定嗜酸乳桿菌數(shù)量的方法

劉霞 曾鳳嬌 于航 白國輝 田源

1.遵義醫(yī)科大學，貴州 遵義 563000；2.貴州省普通高等學校口腔疾病研究特色重點實驗室，貴州 遵義 563000；3.遵義醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院，貴州 遵義 563000

嗜酸乳桿菌（lactobacillus acidophilus，LA）屬于乳桿菌屬，是革蘭氏陽性桿菌，桿的末端呈圓形，乳白色菌落，邊緣卷曲。顯微鏡下觀察可見以單個、成雙或者短鏈排列［1］。嗜酸乳桿菌為一種廣泛存在于人及動物腸道內(nèi)的益生菌，研究表明嗜酸乳桿菌在維持胃腸道的生理功能中發(fā)揮重要作用［2-4］。最新研究發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌與齲病密切相關(guān)，兒童牙菌斑中變形鏈球菌與嗜酸乳桿菌均可作為齲風險評估中危險因素的檢測指標［5］；對齲病微生物的相關(guān)研究表明，微生物的群落組成變化會影響齲病的臨床進展狀態(tài)，嗜酸乳桿菌和戈登鏈球菌的陽性檢測結(jié)果與活躍性齲明顯相關(guān)［6］。

細菌濃度測定方法有很多，如平板菌落計數(shù)法、顯微鏡計數(shù)法、比濁法、分光光度法［7］等，單獨使用一種方法來測定細菌菌液濃度有其各自的優(yōu)點和缺點。本研究試圖通過兩種方法相結(jié)合的方式來尋找一種更加簡便有效的菌液濃度測定方法。OD600是指某種溶液在600nm波長處的吸光值，一定濃度范圍內(nèi)，菌液中細菌濃度與其液體光密度（OD值）成正比，因此可以利用紫外分光光度計測定菌液的OD值來推測菌液濃度［8］。平板計數(shù)法是將檢測樣品稀釋至相應倍數(shù)的液體，再取一定量樣品培養(yǎng)至相應固體瓊脂板，形成肉眼可見的單菌落，再根據(jù)稀釋倍數(shù)和取樣量計算原樣品濃度。本實驗將OD600與平板計數(shù)法與時間相結(jié)合，希望找到一個更加簡便有效測定菌液濃度的方法，為實驗提供幫助。

1 實驗材料

1.1 菌株、試劑及儀器 嗜酸乳桿菌（貴州省普通高等學?？谇患膊⊙芯刻厣攸c實驗室保存）；MRS肉湯（品牌：Solarbio貨號：M8540），瓊脂粉（索來寶，北京）；紫外分光光度計（Backman，德國）、厭氧培養(yǎng)箱（型號：BACTRON EZ-2，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 嗜酸乳桿菌的培養(yǎng)與鑒定。①培養(yǎng)基配置：MRS固體培養(yǎng)基：稱取MRS肉湯4.8g，瓊脂粉2.8g，溶解于100mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min，冷卻至60℃左右倒入無菌培養(yǎng)皿，置4℃冰箱備用。MRS液體培養(yǎng)基：稱取MRS肉湯4.8g溶解于100mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min備用；②菌種復蘇及培養(yǎng)：將甘油保種的嗜酸乳桿菌解凍后，超凈臺內(nèi)用無菌接種環(huán)取適量菌液采用連續(xù)劃線法接種于MRS固體培養(yǎng)皿上，37℃厭氧箱（80%N2，10%H2，10%CO2）內(nèi)培養(yǎng) 24h；③菌種鑒定：培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)皿，超凈臺內(nèi)用接種環(huán)在直徑為1mm的菌落上取適量細菌涂布于載玻片上，進行革蘭染色（初染→媒染→脫色→復染），顯微鏡下進行形態(tài)學鑒定；④菌種擴大培養(yǎng)：超凈臺內(nèi)取MRS液體培養(yǎng)基于15mL離心管內(nèi)，無菌接種環(huán)挑取鑒定完成后的菌落擴大培養(yǎng)于離心管中，37℃厭氧箱培養(yǎng)。

1.2.2 嗜酸乳桿菌菌液濃度的測定。①紫外分光光度計測定菌液OD600值：挑取鑒定成功的嗜酸乳桿菌單菌落于裝有MRS液體培養(yǎng)基的離心管中，37℃厭氧箱培養(yǎng)20h，將菌液顛倒均勻后取適量菌液，紫外分光光度計600nm波長，以MRS液體培養(yǎng)基作為參照測定一個初始OD600值后繼續(xù)培養(yǎng)，再分別于2h、4h、6h、8h（總時長分別為 22h，24h，26h，28h），測定其 OD600值；②平板菌落計數(shù)：每個時間點測定OD600值后，超凈臺內(nèi)準備9只15mL離心管，編號，每管內(nèi)加入0.9mLMRS液體培養(yǎng)基，取0.1mL初始菌液到1號離心管中，依次類推以10為梯度從102～1010進行菌液稀釋，將稀釋后的菌液每管取0.1mL涂布于MRS固體培養(yǎng)皿，37℃厭氧箱培養(yǎng)24h后進行菌落計數(shù)，可推算出菌液濃度=（菌落數(shù)×稀釋度/0.1CFU/mL）。

2 結(jié)果

2.1 嗜酸乳桿菌的培養(yǎng)及鑒定結(jié)果 培養(yǎng)皿中嗜酸乳桿菌生長良好，肉眼觀為乳白色、凸起、邊緣卷曲的菌落；革蘭染色后顯微鏡下觀察細菌被染為紫色，呈桿狀，以單個，成雙或者短鏈排列，為革蘭陽性桿菌，證明該細菌為嗜酸乳桿菌。見圖1。

圖1 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)及革蘭染色

2.2 各時間段OD600與平板菌落計數(shù)結(jié)果 分光光度計測定液體培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)20h時OD值為0.784，22h、24h、26h、28hOD 值分別為 1.019、1.094、1.329、1.389，平板菌落計數(shù)見圖2。不同時間點OD值、菌液稀釋度及菌落數(shù)結(jié)果見表1。結(jié)果表明，在稀釋倍數(shù)為102～105時，平板菌落數(shù)均大于200個，可忽略不計；當厭氧培養(yǎng)22h，OD值達1.0時，稀釋107倍后菌落計數(shù)為3，可計算出原菌液濃度為3×107/0.1=3×108CFU/mL，將菌液與培養(yǎng)基取等體積稀釋后濃度為1.5×108CFU/mL，即得到0.5號麥氏濁度標準管的細菌濃度。

圖2 平板菌落計數(shù)圖

表1 隨時間變化不同稀釋度的菌落平板計數(shù)（CFU）

3 討論

抑菌試驗是指在體外測定樣品的抑菌或殺菌能力，常用的方法包括紙片法和最小抑菌濃度法［9］。紙片法又叫抑菌圈法，是將待測藥物滴在紙片上置于含有一定濃度菌液的瓊脂平板中擴散，從而使其周圍的細菌生長受到抑制而形成抑菌圈，根據(jù)抑菌圈的大小來判定藥物的抑菌效果。最小抑菌濃度法是將一定濃度的抗菌藥物稀釋至不同濃度后接種受試菌株，通過測定菌株在不同濃度藥物培養(yǎng)基內(nèi)的生長情況定量檢測該藥物的最低抗菌濃度。而不管使用哪種方法，都需要將菌液調(diào)整到一個適宜的濃度。

細菌濃度測定方法有很多，平板菌落計數(shù)法操作復雜，所需時間長，顯微鏡計數(shù)法需要相應儀器；比濁法雖然簡單，但容易受外界環(huán)境或者培養(yǎng)基顏色影響，準確性欠佳；分光光度法則需要制作標準曲線［10］。每一種測定方法都有其相應的缺點和優(yōu)點。所以，將平板菌落計數(shù)法和分光光度法結(jié)合起來，觀察菌液隨著培養(yǎng)時間的變化。經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌厭氧培養(yǎng)22h，OD600值達到1.0時，稀釋107倍后菌落計數(shù)為3，可推算出原菌液濃度將菌液與培養(yǎng)基取等體積稀釋后，即得到0.5號麥氏濁度標準管的細菌濃度。這種方法簡便、高效、準確性較單純比濁法好，且不需要借助特殊儀器，能夠為我們的基礎(chǔ)實驗提供幫助。