GATA-3、TSLP和細(xì)胞因子在嗜酸粒細(xì)胞性慢性鼻竇炎伴有鼻息肉中的表達(dá)及意義

段世宏 袁逸銘 劉增平 李勇

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030

慢性鼻竇炎（chronic rhinosinusitis，CRS）是耳鼻咽喉頭頸外科的多發(fā)病和常見(jiàn)病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，細(xì)胞因子在其發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。GATA-3是特異性表達(dá)在Th2（2型T輔助細(xì)胞）細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，GATA-3不僅在幼稚CD4+T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化過(guò)程中起關(guān)鍵作用，而且是Th2細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄所必需的，在呼吸道變應(yīng)性炎癥性疾病的發(fā)病過(guò)程中具有重要作用［1］。胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）是IL-7樣細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)Th2炎癥反應(yīng)和調(diào)控GATA-3表達(dá)［2］。但GATA-3在嗜酸粒細(xì)胞性慢性鼻竇炎伴有鼻息肉（eosinophilic chronic rhinosinusitis with nasal polyps，ECRSwNP）的發(fā)病機(jī)制中研究甚少。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)GATA-3和TSLP在ECRSwNP和非嗜酸粒細(xì)胞性慢性鼻竇炎伴有鼻息肉（non-eosinophilic chronic rhinosinusitis with nasal polyps，non-ECRSwNP）中表達(dá)，并用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)IL-4和IL-5的含量，探究GATA-3和TSLP在ECRSwNP發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月至2018年12月在蘭州大學(xué)第二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科行鼻內(nèi)鏡手術(shù)的48例慢性鼻竇炎伴有鼻息肉患者（CRSwNP）和20例行單純鼻中隔矯正術(shù)的患者（對(duì)照組）。CRSwNP組48例中，男 28例，女 20例，年齡（24.0±11.2）歲，其中ECRSwNP 25例（ECRSwNP組），non-ECRSwNP 23例（non-ECRSwNP組）。對(duì)照組20例中，男11例，女9例，年齡（21.0±8.5）歲。CRSwNP患者的診斷符合CRS的診斷標(biāo)準(zhǔn)（2018）。所有患者無(wú)前期鼻部手術(shù)病史，術(shù)前一個(gè)月內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素、抗組胺藥及抗生素。術(shù)中取CRSwNP患者鼻息肉組織和鼻中隔偏曲矯正術(shù)患者部分下鼻甲組織，一部分經(jīng)液氮冷凍后放入-80℃冰箱凍存?zhèn)銻T-PCR或ELISA分析，另一部分經(jīng)10%多聚甲醛固定6～8h脫水石蠟包埋行免疫組織化學(xué)染色。本研究方案獲得蘭州大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要試劑。單抗IL-4 ELISA試劑盒（ab215089，abcam），單抗 IL-5 ELISA 試劑盒（ab215536，abcam）；RNA 抽提試劑（Trizol，Invitrogen），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR036A，TaKaRa），SYBR 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 試劑盒（RR820A，TaKaRa）；兔抗人 GATA-3單克隆抗體（ab199428，abcam），TSLP 多克隆抗體（ab47943，abcam），免疫組織化學(xué)染色試劑盒（SP-9001，中山金橋），DAB顯色試劑盒（ZLI-9018，中山金橋）。

1.2.2 蘇木精—伊紅染色（hemoxylin-eosin，HE）和免疫組織化學(xué)染色。對(duì)鼻息肉的石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后，進(jìn)行HE染色，顯微鏡高倍視野（×400）下對(duì)全部炎性細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，每張切片可隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)算嗜酸粒細(xì)胞占總的炎性細(xì)胞的百分比均值，若＞10%為嗜酸粒細(xì)胞性CRSwNP，其余為非嗜酸粒細(xì)胞性CRSwNP［3］。GATA-3免疫組織化學(xué)染色采用SP法，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，染色后的切片經(jīng)梯度乙醇溶液脫水，二甲苯溶液透明，中型樹(shù)膠封片，顯微鏡觀(guān)察陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞的判定標(biāo)準(zhǔn)：GATA-3以細(xì)胞質(zhì)、TSLP主要以細(xì)胞質(zhì)和部分細(xì)胞核呈棕黃色顆粒樣著色為陽(yáng)性表達(dá)，細(xì)胞不著色為陰性表達(dá)。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)?？俁NA提取采用Trizol試劑按操作說(shuō)明進(jìn)行，紫外分光光度儀檢測(cè)RNA濃度和純度；取1μg總RNA，應(yīng)用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄20μL體系：5×prime script RT master mix 4μL，RT Enzyme Mix 1μL，Oligo DT primer 1μL，Randomer 6 mers1μL，Total RNA 1μg，RNase Free dH2O補(bǔ)足至20μL體系，混勻后37℃逆轉(zhuǎn)錄15min，85℃滅火逆轉(zhuǎn)錄酶5sec，降至4℃。逆轉(zhuǎn)錄的cDNA放于-20℃冰箱保存，用于PCR擴(kuò)增。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng) PCR引物由上海生工公司合成，GATA-3 引物為：forword：5′-CGAGATGGCACGGGACACTA-3′，reverse：5′-TGGTCTGACAGTTCGCACAGG-3′；TSLP 引物為：forword：5′-CGCCTATGAGCAGCCACATT-3′，reverse：5′-TCTTCTTCATTGCCTGAGTAGCATT-3′；內(nèi)參基因 β-actin 引物為：forword：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，reverse：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAG AAGCA-3′。應(yīng)用 TaKaRa 試劑盒，25μL 反應(yīng)體系：SYBRGreen Mix 12.5μL，PCR forword primer 1μL，PCR reverse primer 1μL，cDNA 2 μL，dH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 30s，95℃ 5s，60℃30s，40 個(gè)循環(huán)，最后 95℃ 15s，60℃ 30s，95℃ 15s。結(jié)果計(jì)算：相對(duì)定量用 2（-△△Ct）方法。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。分別取鼻息肉與對(duì)照下鼻甲組織各100mg，加入5mL PBS液充分勻漿后，置于1.5mL離心管，3000r/min 4℃離心10min，取上清液，將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管，-80℃保存待測(cè)。采用IL-4和IL-5單抗ELISA試劑盒檢測(cè)分離上清液中IL-4、IL-5的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。率的比較采用 χ2檢驗(yàn)；IL-4、IL-5、GATA-3 mRNA和TSLP mRNA的表達(dá)量用（±s）表示，進(jìn)行組間t檢驗(yàn)；用Pearson法分析兩變量間的相關(guān)性，應(yīng)用Graph-Pad Prism5.0繪制圖表，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鼻息肉的組織學(xué)類(lèi)型及GATA-3的表達(dá) ECRSwNP和Non-ECRSwNP兩組病理學(xué)見(jiàn)圖1a、b，ECRSwNP可見(jiàn)上皮下間質(zhì)明顯的嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)，Non-ECRSwNP偶見(jiàn)嗜酸粒細(xì)胞。ECRSwNP組GATA-3 mRNA表達(dá)均高于non-ECRSwNP組和對(duì)照組（t值分別為2.678，2.296，P均＜0.01），見(jiàn)圖2。免疫組織化學(xué)結(jié)果證實(shí)在ECRSwNP組可見(jiàn)GATA-3陽(yáng)性細(xì)胞，主要位于黏膜下炎癥細(xì)胞，而non-ECRSwNP組和對(duì)照組中見(jiàn)少量陽(yáng)性細(xì)胞或未見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞，見(jiàn)圖 3a、b、c。ECRSwNP 組、non-ECRSwNP組和對(duì)照組GATA-3表達(dá)陽(yáng)性率分別為80%（20/25）、17.4%（4/23）、10%（2/20）。組間兩兩比較，ECRSwNP組GATA-3表達(dá)陽(yáng)性率均高于non-ECRSwNP 組和對(duì)照組（χ2值分別為 20.789，18.783，P均＜0.05）。

圖1 鼻息肉組織染色（HE染色×400）

圖2 三組中GATA-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.2 TSLP表達(dá) ECRSwNP組TSLP mRNA表達(dá)高于non-ECRSwNP組和對(duì)照組（t值分別為3.224，2.567，P均＜0.01），見(jiàn)圖4。免疫組織化學(xué)結(jié)果證實(shí)在ECRSwNP組可見(jiàn)TSLP陽(yáng)性細(xì)胞，主要位于上皮細(xì)胞和間質(zhì)的炎癥細(xì)胞，而non-ECRSwNP組和對(duì)照組中見(jiàn)少量陽(yáng)性細(xì)胞或未見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞，見(jiàn)圖5a、b、c。ECRSwNP組、non-ECRSwNP組和對(duì)照組TSLP陽(yáng)性率分別為86.8%、34.3%和25%。組間兩兩比較，ECRSwNP組TSLP表達(dá)陽(yáng)性率高于non-ECRSwNP組和對(duì)照組（χ2值分別為17.52，19.645，P＜0.05）。

圖3 GATA-3免疫組織化學(xué)染色（×400）

圖4 三組中TSLP mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.3 IL-4和IL-5的含量測(cè)定 ECRSwNP組IL-4含量均高于non-ECRSwNP組和對(duì)照組（t值分別為2.957，3.295，P均＜0.05），non-ECRSwNP 組和對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.215，P＞0.05）；ECRSwNP 組 IL-5含量均高于non-ECRSwNP組和對(duì)照組（t值分別為4.362，4.775，P均＜0.05），non-ECRSwNP 組和對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.578，P＞0.05）。見(jiàn)表 1。

2.4 GATA-3、TSLP表達(dá)與IL-4和IL-5含量的相關(guān)性 ECRSwNP組、non-ECRSwNP組和對(duì)照組中IL-4和IL-5含量與GATA-3mRNA表達(dá)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，證實(shí)GATA-3與IL-4、IL-5兩種細(xì)胞因子之間存在顯著相關(guān)性（r值分別為 0.475，0.502，P均＜0.05）；TSLP與IL-4、IL-5兩種細(xì)胞因子之間存在顯著相關(guān)性（r值分別為 0.523，0.462，P均＜0.05）；GATA-3 與TSLP之間存在顯著相關(guān)性（r值分別為0.742，0.622，P均＜0.05）。

圖5 TSLP免疫組織化學(xué)染色（×400）

表1 三組IL-4和IL-5的含量（pg/mg，±s）

表1 三組IL-4和IL-5的含量（pg/mg，±s）

組別 n I L-4 I L-5 E C R S w N P 2 5 1 3 1.4±5 8.2 7 5.4±2 5.6 N o n-E C R S w N P 2 3 3 5.3±2 8.2 2 5.2±1 2.1對(duì)照組 2 0 3 2.1±2 1.5 2 1.3±1 1.6

3 討論

CRS臨床表現(xiàn)呈現(xiàn)高度異質(zhì)性，臨床上依據(jù)是否伴有鼻息肉可分為CRS伴有鼻息肉和不伴鼻息肉。又依據(jù)鼻息肉組織中嗜酸粒細(xì)胞性浸潤(rùn)程度分為ECRSwNP 和 Non-ECRSwNP［4］。CRS伴有鼻息肉主要免疫病理學(xué)特征是誘導(dǎo)較強(qiáng)的Th2免疫反應(yīng)和嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)增多［5］。GATA-3在Th2細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄中起關(guān)鍵作用，是Th1/Th2免疫反應(yīng)的基本轉(zhuǎn)化因素［6］。GATA-3可促進(jìn)Th2細(xì)胞分化和誘導(dǎo)Th2細(xì)胞因子的分泌及抑制Th1細(xì)胞因子等機(jī)制促進(jìn)Th2免疫應(yīng)答。但GATA-3在Th2細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用依然不清楚，因此明確GATA-3在ECRSwNP發(fā)病機(jī)制中的作用以及在此基礎(chǔ)上進(jìn)行干預(yù)治療有重要的意義。

CRSwNP是一種嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)增多的呼吸道炎癥性疾病，多種細(xì)胞因子存在于鼻息肉組織的微環(huán)境中，這些細(xì)胞因子可影響嗜酸粒細(xì)胞的產(chǎn)生、移行、浸潤(rùn)、活化和死亡等生物學(xué)活性。其中Th2細(xì)胞因子IL-5在鼻息肉發(fā)病過(guò)程中具有重要作用，IL-5對(duì)嗜酸粒細(xì)胞具有廣泛作用，參與嗜酸粒細(xì)胞的趨化、活化和抗凋亡的過(guò)程，是鼻息肉中嗜酸粒細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)的關(guān)鍵因子。IL-4是B細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成IgE所必需的，可直接促進(jìn)B細(xì)胞增殖并合成IgE。而且參與了Th1/Th2細(xì)胞間相互調(diào)控，研究表明GATA-3對(duì)IL-5表達(dá)具有調(diào)控作用，在Th2細(xì)胞分化過(guò)程中IL-4可誘導(dǎo)GATA-3表達(dá)，且是受時(shí)間限制的指令性轉(zhuǎn)化過(guò)程［7］。IL-4可通過(guò)激活因子6（STAT-6）激活轉(zhuǎn)錄因子GATA-3，STAT-6是T細(xì)胞上GATA-3表達(dá)主要調(diào)控因子。將GATA-3導(dǎo)入敲除STAT-6基因的T淋巴細(xì)胞可誘導(dǎo)GATA-3表達(dá)，且可促進(jìn)Th2細(xì)胞因子的分泌［8］。GATA-3表達(dá)可誘導(dǎo)IL-4和IL-5表達(dá)增高及干擾素-α表達(dá)降低［9］。變應(yīng)性鼻炎鼻黏膜組織中GATA-3表達(dá)增高與IL-4和IL-5上調(diào)有關(guān)［10］。本研究結(jié)果顯示在ECRSwNP中GATA-3和IL-4、IL-5表達(dá)增高，二者之間表達(dá)呈正相關(guān)，與Sun等［11］發(fā)現(xiàn)相似，說(shuō)明GATA-3表達(dá)與IL-4、IL-5表達(dá)存在一致性，提示在ECRSwNP中GATA-3參與了IL-4、IL-5表達(dá)的合成。

TSLP主要由上皮細(xì)胞，角蛋白細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞和肥大細(xì)胞產(chǎn)生，介導(dǎo)天然和適應(yīng)性Th2反應(yīng)，TSLP作用于樹(shù)突狀細(xì)胞從而誘導(dǎo)CD4+的T細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-5和IL-13，而在Th2免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用。在Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞（ILC2s）TSLP具有誘導(dǎo)GATA-3表達(dá)的能力，TSLP增加細(xì)胞表達(dá)GATA-3蛋白的頻率，并且GATA-3刺激導(dǎo)致GATA-3mRNA表達(dá)增加［2］。在Th2細(xì)胞TSLP可提高STAT-5的磷酸化和IL-4、IL-5和IL-13產(chǎn)生，STAT-5可直接與GATA-3結(jié)合，上調(diào)GATA-3表達(dá)［12］。GATA-3可能作為IL-4、IL-5和 IL-13的反式激活因子，需要由IL-33和TSLP提供附加信號(hào)。本研究結(jié)果顯示在ECRSwNP中GATA-3和TSLP表達(dá)增高，二者之間表達(dá)呈正相關(guān)，與Mj?sberg等［2］發(fā)現(xiàn)相似，說(shuō)明GATA-3表達(dá)增高與TSLP密切相關(guān)。提示TSLP促進(jìn)GATA-3表達(dá)和IL-4和IL-5產(chǎn)生，GATA-3表達(dá)誘導(dǎo)IL-4和IL-5表達(dá)增高，從而促進(jìn)ECRSwNP發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究采用免疫組化和實(shí)時(shí)熒光定量PCR在蛋白和mRNA水平證實(shí)GATA-3、TSLP表達(dá)在ECRSwNP顯著增高，IL-4和IL-5表達(dá)也相應(yīng)增高，并且GATA-3、TSLP表達(dá)與IL-4和IL-5含量正相關(guān)，GATA-3、TSLP參與了ECRSwNP的發(fā)病機(jī)制，提示其可能作為治療ECRSwNP的新靶點(diǎn)。