山竹果皮提取物“芒果醚”抑制乳腺癌細胞MCF-7增殖與遷移

黃凱悅， 劉敏燕， 陳 婷， 陸昌瑞， 趙 越， 邵志宇， 張云龍

(東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院， 上海 201620)

據(jù)統(tǒng)計，全世界每年約170萬新發(fā)乳腺癌病例，但其預(yù)防環(huán)境進展緩慢[1-2]。目前，癌癥臨床療法包括化療、放療、手術(shù)、免疫治療和其他方法[3]，個性化治療也在不斷推進，以減小副作用，提高總體生存率[4]。在乳腺癌治療中非手術(shù)療法也很重要，非手術(shù)抗癌方法主要有化療和放療，都會誘發(fā)氧化應(yīng)激來殺死癌細胞。雖然放/化療會對正常細胞造成傷害[5]，但仍是癌癥治療的標準方法[6-7]。近年來，科學(xué)界和制藥行業(yè)在乳腺癌研究方面取得了顯著進展，幾乎所有類型乳腺癌治療都已進入靶向治療階段[8]，化學(xué)合成藥物通常是癌癥化療的唯一選擇[9-10]，因而有效抑制腫瘤生長且低毒的靶向治療藥物是患者迫切需要的[11]。抗腫瘤藥物按來源可分為化學(xué)合成藥物(如烷化劑、抗代謝藥等)或天然藥物(如紫杉醇、喜樹堿等)[12-13]。天然抗瘤藥物開發(fā)最受關(guān)注，因其來源豐富，高效、低毒且副作用小[12]。

莽吉柿(Garciniamangostana)即山竹，主要分布于東南亞，屬于藤黃科[13]。 其果皮含有大量的粗纖維，果膠和多酚。研究表明，山竹果皮提取物具有抗癌作用[14]，以及抗病毒和抗氧化[15-16]作用。在東南亞，這種提取物被用作治療多種疾病的藥物，現(xiàn)已有數(shù)百年的歷史[17]。另外，山竹果皮提取物中存在芒果醚及4種已知氧雜蒽酮(2-5)[13]，并且芒果醚最早被泰國科學(xué)家在雷公藤植物中發(fā)現(xiàn)并證實其對4類腫瘤細胞存在毒性：MCF-7(人乳腺癌)，KB(人口腔癌)，HeLa(人宮頸癌)和HT-29(人結(jié)腸癌)。芒果醚全稱為3,4-dihydro-5,9-dihydroxy-8-methoxy-7-(3-methoxy-3-methylbutyl)-2,2-dimethyl-2H,6H-pyrano-[3,2-b]xanthen-6-one，分子式為C25H30O7，是一種淡黃色針狀晶體，其結(jié)構(gòu)式見圖1[13]。

圖1 芒果醚結(jié)構(gòu)式

本課題組從山竹果皮內(nèi)提純了一種芒果醚，并以吉西他濱(Gemcitabine，簡稱Gem)作為陽性對照24 h給藥處理乳腺癌細胞，進一步檢測其具有促發(fā)生細胞凋亡和降低細胞遷移的作用，并探析其分子機制，以期對乳腺癌治療藥物開發(fā)提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

芒果醚由本課題組提純獲取，吉西他濱由邵志宇課題組提供。MCF-7、MCF-10、MDA-MB-231和SUM1315MO2細胞均購于中科院細胞庫(上海)；1×DMEM培養(yǎng)基購于Cellmax公司、胰酶酚紅-EDTA消化液、100×雙抗(青霉素&鏈霉素混合溶液)及胎牛血清均購于Gibco公司；細胞培養(yǎng)板購于Costar公司；二甲基亞砜(DMSO)購于MESGEN公司；CCK-8試劑盒和DPBS緩沖液購于上海碧云天公司；Hoechst 33342染液購于上海翊圣生物科技有限公司；TEMED、預(yù)染Marker、脫脂奶粉、Tris base、甘氨酸、Tween 20、氯化鈉和丙烯酰胺均購于生工生物工程(上海)股份有限公司；SDS購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；無水甲醇、無水乙醇均購于上海云麗經(jīng)貿(mào)有限公司；二抗(羊抗兔)、Actin購于北京聚合美生物科技公司；一抗(Bax、Bcl-2、Cytochrome C、Precaspase-9)購于CST公司；BSA購于BIOSHARP公司。

人源乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB-231、SUM1315MO2和人正常乳腺細胞MCF-10均在含有10%的胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素溶液的1×DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并放置于5% CO2體積分數(shù)的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，并每隔12 h在普通光學(xué)顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)。

分別取出適量芒果醚和吉西他濱粉末溶于DMSO藥物原液。再將芒果醚藥物原液稀釋配成16、20、24、28和32 μmol/L，將Gem藥物原液稀釋配成20、40和60 μmol/L。不加任何藥物的細胞設(shè)為對照，濃度為0 μmol/L。

1.2 CCK-8細胞增殖和毒性實驗

利用CCK-8試劑盒，嚴格按照試劑盒提供的說明進行操作來檢測芒果醚和Gem兩種藥物對MCF-7、MCF-10、MDA-MB-231和SUM1315MO2細胞24 h后的細胞增殖和毒性情況。

1.3 Hoechst 33342染色實驗

使用Hoechst 33342染液檢測 Gem和芒果醚給藥 24 h后MCF-7 細胞的凋亡情況。

1.4 MCF-7的細胞劃痕遷移實驗

利用槍頭在培養(yǎng)MCF-7細胞的6 cm皿底沿直徑線劃1道痕跡，分別培養(yǎng)24 h后，取出細胞板，在倒置熒光顯微鏡下觀察芒果醚、Gem給藥24 h的劃痕面積變化情況并拍照保存。

1.5 蛋白免疫印跡實驗

蛋白免疫印跡試驗(Western Blot，簡稱WB)檢測方法：芒果醚、Gem 給藥 MCF-7細胞24 h后，將細胞裂解制樣，恒壓(190 V，45 min)電泳結(jié)束后，濕法轉(zhuǎn)膜(100 V，80 min)，孵育一抗、二抗后拍照并保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 芒果醚具有顯著抑制乳腺癌細胞MCF-7生長活性

不同濃度的Gem和芒果醚24 h給藥處理MCF-7、MCF-10、MDA-MB-231和SUM1315MO2等4種細胞后，評估乳腺癌細胞的生存情況。如圖2(a)所示，芒果醚以劑量依賴性方式顯著降低了MCF-7細胞存活率，但是給藥濃度超過24 μmol/L時，細胞生存率基本沒有變化，因而選取16、20和24 μmol/L等3個濃度進行研究。進一步實驗確定MCF-7細胞給藥24 h的IC50為20 μmol/L。如圖2(b)所示，當(dāng)Gem以60 μmol/L的濃度作用24 h時，細胞存活率約為50%，即 Gem的IC50值為24 h的60 μmol/L。圖2還表明，芒果醚對MCF-10、MDA-MB-231和SUM1315MO2等3種細胞的毒性很低，Gem對MCF-7、MDA-MB-231和SUM1315MO2等3種細胞都有活性抑制，對MCF-10細胞影響很低。本實驗主要探究芒果醚的作用，后續(xù)實驗只選擇MCF-7細胞作為研究對象。

2.2 芒果醚與Gem可以誘導(dǎo)MCF-7細胞凋亡

圖3所示為芒果醚給藥處理MCF-7細胞可誘發(fā)產(chǎn)生凋亡小體，并存在劑量依賴現(xiàn)象，即隨著給藥濃度升高，芒果醚對細胞凋亡誘導(dǎo)作用隨之加強，凋亡小體增多。不同的是，在相同給藥時間內(nèi)芒果醚作用后誘導(dǎo)產(chǎn)生的凋亡小體相較于Gem來說數(shù)量偏多，從而也反映了在較低給藥濃度下芒果醚對MCF-7細胞的凋亡作用更強。

芒果醚和Gem以不同濃度給藥處理MCF-7、MCF-10、MDA-MB-231、SUM1315MO2 這4種細胞24 h后的CCK-8檢測結(jié)果，未給藥組設(shè)為對照。(a)芒果醚給藥4種細胞，濃度依次為0、16、20、24、28和32 μmol/L；(b)Gem給藥4種細胞，濃度依次為0、20、40和60 μmol/L(***P< 0.0001、**P<0.001、*P<0.05)

(a)和(e)對照組，給藥濃度為0；(b)～(d)芒果醚給藥MCF-7，濃度依次為16、20和24 μmol/L；(f)～(h)Gem給藥MCF-7，濃度依次為20、40和60 μmol/L

2.3 芒果醚可促發(fā)乳腺癌細胞MCF-7的凋亡途徑

根據(jù)之前得到的IC50數(shù)值及凋亡小體染色結(jié)果，可針對細胞凋亡信號通路相關(guān)蛋白進行Western Blot檢測。Bcl-2、Precaspase 9、Bax和Cytochrome C這4種蛋白因子是細胞凋亡信號通路上的關(guān)鍵信號分子，通過檢測給藥前后這4種蛋白因子的變化情況對芒果醚可致MCF-7細胞凋亡的分子機制做初步判斷。圖4顯示芒果醚和Gem都可以下調(diào)Bcl-2和Precaspase 9的表達，上調(diào)Bax和Cytochrome C蛋白表達，并且以劑量依賴性方式發(fā)生顯著變化。這些檢測結(jié)果說明Gem和芒果醚致死MCF-7細胞與細胞凋亡信號通路息息相關(guān)。

(a)芒果醚給藥MCF-7，濃度依次為0、16、20和24 μmol/L；(b)Gem給藥MCF-7，濃度依次為0、20、40和60 μmol/L。未給藥組設(shè)為對照；給藥時間為24 h

(a)芒果醚作用MCF-7細胞的劃痕實驗，給藥濃度為0、16、20和24 μmol/L；(b)Gem作用MCF-7細胞的劃痕實驗，給藥濃度為0、20、40和60 μmol/L；(c)兩種化合物給藥24 h后的細胞劃痕愈合面積定量分析圖。未給藥組設(shè)為對照

2.4 芒果醚可抑制MCF-7細胞遷移

如圖5(a)和圖5(b)所示，未給藥組的劃痕處的傷口愈合面積明顯大于其他給藥組，各給藥組的傷口愈合面積隨著時間和給藥濃度增加而出現(xiàn)劃痕處細胞遷移量減少的現(xiàn)象，表現(xiàn)為愈合面積減小。如圖5(c)所示，對給藥前后劃痕面積變化的定量分析中發(fā)現(xiàn)，24 h后未給藥組劃痕面積很小，傷口愈合面積幾乎覆蓋了劃痕面積，而給藥組24 h后的劃痕面積就趨于給藥之前的初始劃痕面積。因此，芒果醚與Gem給藥細胞的劃痕面積變化，表明兩種藥物都可以抑制MCF-7細胞遷移。

3 討論與結(jié)論

尋找新的有前景的癌癥治療藥物已成為熱點問題[18]。自然界物種豐富且環(huán)境復(fù)雜，是潛在活性天然藥物的寶庫，目前這些天然資源已為全球數(shù)百萬人提供著一線藥物[19-22]。靶向藥物成為乳腺癌化療藥物的首選，如紫杉醇及其半合成衍生物等已在臨床治療中取得了顯著效果[23]。一般來說，天然藥物作為乳腺癌臨床治療藥物仍存在很大不確定性。這些因素包括如何提高生物利用度、增強活性、構(gòu)建靶向給藥系統(tǒng)等[24]。這些情況需要通過不同專業(yè)科學(xué)家共同努力來解決。

本研究對從山竹果實內(nèi)提取的一種芒果醚進行了抗腫瘤活性的分析，發(fā)現(xiàn)對乳腺癌細胞MCF-7具有較好的增殖抑制、促發(fā)凋亡和抑制細胞遷移的效果。山竹“芒果醚”給藥處理MCF-7細胞24 h后，IC50值為20 μmol/L，出現(xiàn)凋亡小體，具有劑量和時間依賴現(xiàn)象。同時，芒果醚可促發(fā)細胞凋亡信號，WB檢測結(jié)果顯示，Bcl-2劑量依賴性下調(diào)，而Bax上調(diào)，Cytochrome C顯著上調(diào)，Precaspase-9也明顯下調(diào)，這表明其可通過促發(fā)線粒體依賴性凋亡途徑而抑制了MCF-7增殖。另外，劃痕實驗結(jié)果顯示，芒果醚可有效減弱MCF-7細胞遷移。

本研究明確了山竹“芒果醚”可抑制乳腺癌細胞MCF-7增殖、促發(fā)凋亡和抑制遷移等現(xiàn)象，但其分子機制仍需要更為深入的探討，本課題正積極開展這項工作。另外，本研究顯示，芒果醚對MCF-7細胞(ER+/PR+/P53+/-)作用明顯，但是對MDA-MB-231(ER-/PR-/HER2-)和SUM1315MO2(ER-/PR-/TP53+)細胞無明顯作用，表明芒果醚抑制乳腺癌具有特異性，但仍不明確，有待進一步探析。了解芒果醚藥物靶點和作用機制，對于開發(fā)芒果醚潛在抗乳腺癌意義重大。